Summary
荧
Abstract
恶性疟原虫感染的红细胞（IE）在疟疾感染的人脐静脉内皮受体介导的黏附表达的PfEMP1 由 var基因编码的蛋白变异。
单倍体P.恶性疟原虫基因组中藏着约60个不同的变种基因，其中只有一个被认为是转录每一次细胞在血液的感染阶段。如何实现这种相互排斥的变种基因的转录调控还不清楚，因为是个人var基因的鉴定或小组var基因与不同的受体和后果的差分结合的临床结果P.恶性疟原虫感染。近日，被称为相互排斥的转录模式提出了质疑，根据个人P.转录分析恶性疟原虫转录鉴定单INF的ected红细胞细胞利用RNA 荧光原位杂交（FISH）分析VAR的寄生虫P.单个核基因转录恶性疟原虫即：1。
在这里，我们提出了一个详细的协议进行分析变种基因的转录的RNA-FISH方法在单核的P.恶性疟原虫感染人类的红细胞。该方法是基于对使用地高辛和生物素标记的反义RNA探针使用的TSA加荧光调色板系统2（Perkin Elmer公司制），微观分析和新鲜选择P.恶性 IE浏览器。 原位杂交法可以用来监测转录的各种基因表达和调节过程中的不同阶段的P.恶性疟原虫生命周期和适应其他疟疾寄生虫物种和其他生物体和细胞类型。
Protocol
1。新选择受感染的红细胞的生成
对于这个测定法，获得最好的结果是当使用新鲜选择培养表面表达的PfEMP1蛋白。在这个特殊的实验3D7 P.恶性疟原虫谱系选择使用特定的抗体，如前面描述的1。
第1天
- 嘉实200μl的包装血细胞从P.恶性疟原虫培养含有2-5％的IE后期通过离心分离，在800×g离心8分钟，在室温下。
- 血液沉淀重新悬浮在2毫升37°C预热0.75％明胶溶液在一个14毫升的无菌管中，并离开为15-20分钟，在37℃下，以允许未感染和环阶段IE泥沙。
- 收获后期的IE， 即上层相，到一个新的14毫升的试管中，并用10ml的37℃的温水RBC清洗介质清洗两次。
- 用50微升具体的反PfEMP稀释在2毫升37℃的温水RBC清洗媒体和无菌过滤器1抗体。
- 灭菌的稀释抗血清在14毫升无菌试管中，并培育30分钟，37°C下缓慢搅拌混合水洗后期的IE。
- 附带下降，在800×g离心8分钟，在室温下，并清洗两次，每次用10毫升37℃的温水RBC清洗介质。
- 洗两次50μL的Dynabead蛋白的悬浮液，红细胞洗涤介质中使用DynaMaq-15磁铁。
- 在300μl红细胞洗涤介质中重悬磁珠和他们洗过的后期IE。在37℃下孵育30分钟，温和搅拌。
- 管转移到DynaMaq-15磁体。静置1-2分钟，取出所有的液体。
- 重悬磁珠于4-5毫升的红细胞洗涤介质。管转移回上的磁铁，让它为1-2分钟前消除所有的液体。重复洗涤步骤一次。
- 将洗过的小珠转移到一个25厘米2无菌培养fLASK含有200μl的新鲜堆积的红血细胞。添加5-6毫升Albumax媒体进入文化。存放过夜，在37℃下在5％CO 2的
第2天
- 从文化当选定的的IE已经reinvaded的鲜红色的血细胞将所有的文化，一个14毫升的无菌试管中取出磁珠。将管到DynaMaq-15磁铁离开1-2分钟。然后，全部倒掉培养瓶中的液体倒回。
- 尽可能为几个周期的5％至10％，直到原虫和寄生虫的文化是在ringstage。
- IE应通过FACS分析，以确保正确的表面表型， 即蛋白表达的任一PFD1235w and/orPF11_0008已得到的1。
2。探针制备
反义RNA探针产生的从最的可变区的PFD1235w和PF11_0008 变种</ em>的基因，P.恶性疟原虫 3D7基因组DNA。通过PCR扩增的DNA，并克隆到载体转录的pSPT18或19，分别根据制造商的说明（Roche公司）。使用地高辛RNA标记试剂盒RNA标记或生物素混合，分别与地高辛（DIG）或生物素标记探针（580个碱基对（bp）和590 bp的长度）。我们证实了特异性的探针，通过Northern印迹分析和由单一标签FISH分析1。
3。薄涂片和固定在原位杂交中的寄生虫在此之前
第1天
所有的步骤被执行的无RNase的环境中，所有试剂无RNase的或预先用焦碳酸二乙酯（DEPC）或RNase扎普（Invitrogen公司）。载玻片和盖玻片应该用酒精清洗，以除去残留的制造油脂。重要的是要在各步骤之间没有任何暂停执行协议为了尽量减少核酸酶污染的风险。
- 薄血膜的标准传播方法3。使用油100倍的显微镜物镜，算上IE浏览器和IE浏览器中的百分比计算的文化。检查，寄生虫阶段是在近似的同步的，在环和早期滋养体阶段的IE周期。这些都是预先复制，单核阶段，表达var基因mRNA的和适合这种类型的单细胞FISH转录分析。
- 50微升的寄生虫文化传输，在原虫的5-10％，以1.5毫升的无RNase的Eppendorf管中。在室温下以2,000 rpm离心1分钟。
- 取出介质，并加入50μlPBS DEPC处理过的水的pH值为7.2。轻轻搅动管。离心沉淀步骤重复两次以洗涤细胞不受媒体和细胞碎片。
- 四好品质的薄涂片。对于每一个涂抹，使涂抹于一个11毫米直径的4以及幻灯片， 即四在总的载玻片上，在一个无RNA酶罩（ 关键步骤 ）。波简要地滑动到空气中晾干。车型三个额外的任何其他的无关基因的单探针染色阴性对照 - 酮滑动滑动，通过使用特定的探头，另一个滑动核糖核酸酶处理和三分之一滑动含有IE不表达感兴趣的基因。留在板凳上干10-20分钟的幻灯片。
- 修复的薄膜，通过添加60微升固定溶液含有4％多聚甲醛和5％冰醋酸入井。在室温下静置10分钟，在板凳上。
- 通过温和搅拌5分钟，在室温下，在2×SSPE缓冲液洗净幻灯片。多余的液体接触的孔中的细胞，用纸巾轻轻取出。
- 量的幻灯片0.01％的胃蛋白酶在0.01 M HCl 2分钟，在37°C（一个非常关键的一步）。洗5分钟，在室温下2个亚急性硬化性全脑炎中的幻灯片。
- 的RNase溶液稀释至最终浓度为10微克/毫升。量的负控制涂片用60微升的RNase溶液。在37°C孵育30分钟，然后洗5分钟，在室温下2个亚急性硬化性全脑炎中的幻灯片。
- 立即着手在杂交步骤。
4。杂交的RNA探针固定滑轨
第1天
- 准备杂交室，作为温度感应器100 HC4的或空的移液管尖中放入干净的烘箱中，通过喷洒用RNase扎普和擦拭清洁用薄纸等。填充杂交室或用DEPC处理过的水，以使确保幻灯片不会干出期间杂交的框的底部的通道。关闭室和预热至48°C。
- 稀释到杂交溶液至终浓度为12纳克/微升探针。变性的探针溶液在65℃的加热块中的5分钟。立即冰上冷却。
- 简单地说晾干后2个亚急性硬化性全脑炎洗的幻灯片。孔周围用纸巾小心地除去过量的液体。
- 打开杂交室，和室中的幻灯片。应用的总体积为60微升每孔中的一个或两个探针。一个无RNA酶的盖玻片，用无菌镊子小心地覆盖液滴。
- 关闭腔，并在夜间至少16小时，在48°C杂交的幻灯片。
5。抗体共轭荧光扩增
第2天
下面的步骤是基于TSA Plus荧光调色板的系统从Perkin Elmer。所有的步骤都在室温下进行。
- 洗净幻灯片的3倍TNT缓冲轻轻搅拌5分钟。
- 井座TNB缓冲液150μl的30分钟。
- 稀释的HRP共轭的α-DIG抗体1:100，HRP共轭的α-生物素抗体的比例在TNB的缓冲液中，在TNB缓冲区中的比率为1:500。用纸巾从幻灯片中删除任何多余的TNB缓冲。同时检测两个转录时，这两种抗体可以去一次。应用的抗体TNB的溶液，每孔加入100μl的总量，并小心地用盖玻片覆盖。孵育的幻灯片2小时。
- 取出盖玻片仔细。洗净的幻灯片在TNT缓冲液3次，每次5分钟。
- 在1:500的比例稀释的FITC-荧光团中的酪胺的扩增试剂，和应用的解决方案，每个孔中加入100μl。井用盖玻片覆盖，孵育12分钟。
- 小心取出盖玻片，并用幻灯片3次，轻轻搅拌5分钟，TNT缓冲。
- 在1:500的比例稀释Cyan3荧光团中的酪胺的扩增试剂。加入100μl每该溶液。井用盖玻片覆盖，孵育12分钟。
- 取下盖子滑落仔细阅读，然后快速冲洗幻灯片，沉浸在TNT缓冲。
- 幻灯片洗净3次，用TNT缓冲液5分钟。
- 迅速在DEPC处理过的水浸泡幻灯片。
- 离开幻灯片风干。安装防褪色试剂DAPI幻灯片。密封用指甲油的盖玻片的角部。
- 现在准备用于显微镜的幻灯片。保持覆盖铝箔和存储的幻灯片，在4°C，如果实验是要完成的第二天。一个完整的密封的侧面的滑动，可以进行24小时后，施加的抗褪色试剂。这将允许被成像在幻灯片最多为一个星期后的协议已完成。
6。杂交探针的可视化
- 打开显微镜上。一个标准的免疫荧光显微镜，够ient这种实验，但如果你有机会到激光共聚焦显微镜，你也可以使用这个3D图像或获得视频染色细胞。允许显微镜热身15-30分钟。接通计算机和软件。
- 质量检查的染色，免疫荧光显微镜。选择一个点，其中包含一些寄生虫。
- 手动调整每个激光器的增益。调整的像素停留4-6米-1 s -1和512×512象素的步骤。
- 测试图片使用框架拉姆达。调整激光的增益。
- 以最低的20个好照片的荧光单细胞。需要至少有2-5个图片一个字段包含5-20寄生虫的阳性寄生虫的百分比，以获得一个公平的概述。
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Representative Results
图1示出的主要步骤的流程图，和持续时间的RNA FISH方法。
一系列有代表性的图像，保存差染mRNA的FISH实验采用单P.疟原虫 IE浏览器在图2中所示。细胞内的原虫有一个小的（1-1.5微米直径）的原子核，用DAPI染成蓝色。二十四小时后，红细胞的入侵P.恶性疟原虫裂殖过程中， 即细胞核分裂，就开始了。优化FISH检测的变种基因转录发生这个48小时内红细胞裂解周期在10-22小时左右。探测器通常杂交的mRNA物种出现相邻的主核体，大概是什么核包络相关的内质网中。行中的良好质量的图像A显示FITC（绿色）和Cyan3-（红色）相对应的标记的探针的PFD1235w和PF11_0008 var基因，分别在选择双P.恶性疟原虫子线次，3D7 PFD1235w/PF11_0008。定位的基因是显而易见的，但不是绝对的。 B行显示出较差的两种探针杂交退化或基本停止录制变种基因的寄生虫。在C行中，一个好的鱼杂交，但，细胞保存较差，严重扩散和聚集寄生虫。
图1。 RNA的FISH实验流程图。流程图说明的鱼过程中的要点和时序。
共聚焦图像的RNA-FISH双P. 图2。 恶性表示点大先生NA与任FITC（绿色）或Cyan3（红色）信号的两个不同的标记的var基因的转录。 DAPI染色（蓝色）表示的寄生虫的核DNA。的垂直行A1，b1和c1的显示的透射图像的寄生虫。比例尺为5μm。
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Discussion
RNA FISH分析，如Northern印迹和RT-PCR的方法，允许特定的mRNA转录在单细胞水平上的歧视。这使得有可能区分转录活性和非活动单元，在这个例子中，P.恶性疟原虫在人体红血细胞内寄生原虫。这种全细胞观察往往是必要的，并可能解开重要的和新颖的转录模式1。
虽然其他RNA FISH的方法已被描述4-10，出现了一个需要发展的一个新的和精致的协议，用于研究的同时var mRNA转录的P.恶性疟原虫 。通过检测工具，使用asRNA探头，特殊的时空格局mRNA的活动，可以很容易地定位在细胞。此外，asRNA探针也可以用于在其他的实验的系统，这将支持它们的特异性1。其他致命一击ICAL是很重要的参数，在开发新的协议包括细胞固定和permeabilzation。经验通过测试各种化学试剂，如由其他作者5建议定义了这些步骤。我们得出的结论相结合，缓慢作用的交联剂多聚甲醛与促凝剂固色剂醋酸的组织形态，我们可以得到很好的保存。此外，我们发现，，预先阻断细胞前加入探针是没有必要的，类似于其他的RNA FISH协议5。此外，本协议中，我们使用温和的洗涤，在低量温和的蛋白酶（胃蛋白酶）和一个短的潜伏期，以允许扩散到细胞核内，并与附着在ER的mRNA杂交的探针和抗体，最大限度地减少损坏周围的膜（图2A1-2A4）。
此外，RNA FISH和高分辨率图像由CAMER生成一个附加的共聚焦显微镜揭示一个特定的细胞是否是阳性染色或没有，还提供了有价值的信息有关染色的反义RNA和DAPI染色的核之间的空间关系的。解决中的图像数字2A4的mRNA似乎是连接未来的核心，可能是内质网中，而不是在它的上面，如预期中的DNA-FISH图像11-12。
单细胞的研究需要多种寄生虫，并在不同的时间点的观测得到统计学上显着的结果。因此，RNA FISH分析是相当耗时的技术，要求耐心和相当大的试验和误差实验校准的技术。由于RNA FISH是许多参数的技术的一个问题解答获得此协议的主要步骤的表1中给出。
| 问题 | 可能CAUSE | 推荐 |
| 弱信号或无信号 |
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| 可怜的细胞保护 |
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| 高背景 |
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| 核糖核酸酶处理的对照是积极的 |
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| 假阳性检测阴性对照寄生虫 |
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表1。Troobleshooting指导。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢迈克尔·Alifrangis和乌拉Abildtrup，基因分型的寄生虫和克里斯蒂娜·霍尔姆优秀的技术援助。这项工作是由霍华德休斯医学研究所（授予55005511），，Lundbeck公司基金（批准R9-A840）和尼尔斯·玻尔基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco - CM LAB Aps | 91016 |
References
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