Analyse af enkeltcelle-gentransskription ved RNA Fluorescent Published: October 7, 2012 doi: 10.3791/4073

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elena Ronander^1,2, Dominique C. Bengtsson^1,2, Louise Joergensen^1,2, Anja T. R. Jensen^1,2, David E. Arnot^1,2,3

¹Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen, ²Department of Infectious Diseases, Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), ³Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology, University of Edinburgh

Summary

Fluorescent

Abstract

Adhæsion af Plasmodium falciparum inficerede erythrocytter (IE) til humane endotel receptorer under malariainfektioner medieres ved ekspression af PfEMP1 proteinvarianter kodet af VaR gener.

The haploid P. falciparum genom havne cirka 60 forskellige was gener, hvoraf kun én er blevet menes at blive transskriberet per celle ad gangen i blodet fase af infektionen. Hvordan en sådan gensidigt udelukker regulering af var gentranskription opnås er uklar, da er at identificere individuelle was gener eller undergrupper af VaR gener forbundet med forskellige receptorer og konsekvensen af forskellen binding på det kliniske resultat af P. falciparum infektioner. Senest har gensidigt udelukker transkription paradigme været draget i tvivl ved transskription assays baseret på individuel P. falciparum udskrift identifikation i en enkelt infected erytrocytiske celler under anvendelse af RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse af var gentranskription af parasitten i enkelte kerner af P. falciparum IE ^1.

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til udførelse af RNA-FISH metode til analyse af var gentranskription i single-kerner af P. falciparum inficerede humane erythrocytter. Fremgangsmåden er baseret på anvendelse af digoxigenin-og biotin-mærket antisense RNA-prober ved hjælp af TSA Plus Fluorescence Palette System ² (Perkin Elmer), mikroskopiske analyser og frisk valgt P. falciparum IE. Den in situ-hybridisering metode kan bruges til at overvåge transkription og regulering af en række gener udtrykt under de forskellige faser af P. falciparum livscyklus og kan tilpasses til andre malariaparasitten arter og andre organismer og celletyper.

Protocol

1. Generering af Frisk Udvalgte Inficerede Erythrocytter

Til dette assay, er de bedste resultater opnået ved anvendelse af frisk udvalgte kulturer for overfladeekspression af PfEMP1 protein. I dette særlige forsøg blev 3D7 P. falciparum linie blev valgt under anvendelse af specifikke antistoffer som beskrevet tidligere ^1.

Dag 1

1. Høst 200 pi pakkede blodlegemer fra en P. falciparum kultur indeholdende 2-5% sent IE ved centrifugering ved 800 x g i 8 minutter ved stuetemperatur.
2. Resuspendere blodet pelleten i 2 ml 37 ° C varm 0,75% gelatineopløsning i et 14 ml sterilt rør, og efter henstand i 15-20 minutter ved 37 ° C for at tillade uinficerede og ring-fase IE at sedimentere.
3. Høste de sene IE, dvs øvre fase, til et nyt 14 ml rør og vaskes to gange med 10 ml 37 ° C varm RBC-vaskemedier.
4. Fortynd 50 ul specifik anti-PfEMP1-antistoffer i 2 ml 37 ° C varm RBC-vask medier og sterilt filter.
5. Bland den vaskede sene IE med den steriliserede fortyndede antisera i et 14 ml sterilt rør og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
6. Spin ned ved 800 x g i 8 minutter ved stuetemperatur, og vaskes to gange med 10 ml 37 ° C varm RBC-vaskemedier.
7. Vask 50 pi Dynabead Protein A suspension to gange med RBC-vask medier ved hjælp af en DynaMaq-15 magnet.
8. Resuspender de Dynabeads i 300 gl RBC-vask medier og tilføje dem til den vaskede sene IE. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
9. Overfør røret til DynaMaq-15 magnet. Orlov til 1-2 min og fjerne al væsken.
10. Resuspendere Dynabeads i 4-5 ml af RBC-vaskemedier. Overfør røret tilbage på magnet og lad det stå 1-2 min, før du fjerner al væsken. Gentag vasketrinet gang.
11. Overfører de vaskede perler i et ²⁵ cm2 steril kultur fLASK indeholdende 200 ul frisk pakkede røde blodceller. Tilføj 5-6 ml af Albumax medier ind i kulturen. Opbevares natten over ved _5% CO2 ved 37 ° C.

Dag 2

12. Fjern Dynabeads fra kulturen, når den valgte IE har reinvaded de friske røde blodlegemer ved at overføre hele kulturen til et 14 ml sterilt rør. Sæt røret på DynaMaq-15 magnet og orlov til 1-2 min. Derefter hældes al væsken tilbage til en dyrkningskolbe.
13. Kultur for så få cykler som muligt, indtil en parasitemia på 5-10% og parasitter er på ringstage.
14. IE bør analyseres ved FACS for at sikre, at den korrekte overflade fænotype, har dvs proteinekspression for enten PFD1235w and/orPF11_0008 opnået ^1.

2. Fremstilling af prober

Antisense RNA prober blev genereret fra de variable regioner af PFD1235w og PF11_0008 var </ Em> gener fra P. falciparum 3D7 genomisk DNA. DNA blev amplificeret ved PCR og klonet i pSPT18 eller 19 vektor til transkription, henholdsvis ifølge producentens beskrivelse (Roche). Proberne (580 basepar (bp) og 590 bp i længden) blev mærket med digoxigenin (DIG) eller biotin under anvendelse af en DIG-RNA-mærkningskit eller en Biotin-RNA mærkning Mix hhv. Vi bekræftede specificiteten af proberne både ved Northern blot-analyser samt ved en enkelt-label FISH-analyse ^1.

3. Tynd Smear og Fiksering af parasitter Før In Situ Hybridization

Dag 1

Alle trin udføres i et RNase-frit miljø og alle reagenser er RNase-frit eller præ-behandlet med diethylpyrocarbonat (DEPC) eller RNase Zap (Invitrogen). De dias og dækglas skal rengøres med sprit for at fjerne resterende produktion fedt. Det er vigtigt at udføre protokollen uden nogen pause mellem trinfor at minimere risikoen for nuclease kontaminering.

1. Lav en tynd blod film ved standard sprede metode ^3. Brug af 100x olie objektiv af mikroskopet, IE tælle og beregne den procentdel af IE i kulturen. Kontroller, at parasitten faser er i omtrentlige synkront, i ringen og tidlige trophozoite stadier af IE cyklus. Det drejer sig om præ-replikation, uni-nucleate faser, der udtrykker var mRNA og egnet til encellede FISH transskription assays af denne type.
2. Overfør 50 pi af parasitten kultur, ved en parasitæmi på 5-10%, til et 1,5 ml RNase-frit Eppendorf-rør. Centrifugeres i 1 minut ved 2.000 rpm ved stuetemperatur.
3. Fjern mediet, og der tilsættes 50 pi PBS pH 7,2 i DEPC-behandlet vand. Omrør røret forsigtigt. Gentag centrifugal sedimentering trin to gange for at vaske cellerne fri medier og cellerester.
4. Lav fire gode kvalitet tynde udstrygninger. For hver smear, gøre en smøre påen 11 mm diameter godt af en 4 godt dias, henholdsvis fire objektglas i alt, i en RNase-fri hætte (et afgørende skridt). Bølge glider kortvarigt i luften for at tørre. Har tre ekstra slides for negative kontroller-et objektglas for enkelt probe farvning for andre irrelevant gen ved anvendelse af en specifik probe, et andet objektglas til RNase-behandling og en tredje objektglas indeholdende IE ikke udtrykker genet af interesse. Lad objektglassene tørre på bænken for 10-20 min.
5. Fastgør tynde film ved tilsætning af 60 pi fiksering opløsning indeholdende 4% paraformaldehyd og 5% iseddikesyre i brøndene. Lad i 10 minutter på bænken ved stuetemperatur.
6. Vask objektglassene i 2 x SSPE-puffer i 5 minutter ved forsigtig omrystning ved stuetemperatur. Kort beskrevet fjerne overskydende væske ved at berøre brøndene indeholdende cellerne forsigtigt med en papirserviet.
7. Dæk objektglassene med 0,01% pepsin i 0,01 M HCI i 2 minutter ved 37 ° C (en yderst kritisk trin). Vask objektglassene i 2 x SSPE i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Fortyndes RNase opløsning til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Dæk de negative kontrolprøver udstrygningspræparater med 60 ul af RNase løsning. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og derefter vaske objektglassene i 2 x SSPE i 5 minutter ved stuetemperatur.
9. Fortsæt straks til hybridiseringstrinnet.

4. Hybridisering af RNA-prober til Faste Slides

Dag 1

1. Forbered hybridiseringskammeret, såsom en ThermoStar 100 HC4 eller en tom pipettespids box sat i en ren ovn, ved sprøjtning med RNase Zap og tørrer den ren med en papirserviet. Fyld kanalerne i hybridiseringskammeret eller bunden af ​​kassen med DEPC-behandlet vand for at sikre, at gliderne ikke udtørrer under hybridisering. Kammeret lukkes og forvarmes til 48 ° C.
2. Fortynd proberne til hybridiseringsopløsningen til en slutkoncentration på 12 ng / ul. Denaturere probe opløsning ved 65 ° C i 5 min i en varmeblok. Straks chill på is.
3. Kortvarigt lufttørre objektglassene efter 2x SSPE vask. Omhyggeligt fjerne overskydende væske omkring brøndene med en papirserviet.
4. Åbn hybridiseringskammeret og placere dias i kammeret. Anvende en eller begge prober i et samlet volumen på 60 ul per well. Omhyggeligt dække væskedråbe med en RNase-frit dækglas med sterile pincetter.
5. Kammeret lukkes og hybridiserer objektglassene ved 48 ° C i mindst 16 timer natten over.

5. Antistofkonjugation og fluorescens amplifikation

Dag 2

De følgende trin er baseret på TSA Plus Fluorescence Palette system fra Perkin Elmer. Alle trin udføres ved stuetemperatur.

1. Vask gliderne 3 gange i TNT-puffer i 5 minutter med forsigtig omrøring.
2. Bloker brøndene i 150 pi TNB-puffer i 30 minutter.
3. Fortyndes HRP-konjugeret α-DIG-antistof i TNB-puffer i et forhold på 1:100 og HRP-konjugeret α-biotin antistof i TNB puffer, i et forhold på 1:500. Fjern overskydende TNB buffer fra dias med en papirserviet. Når der detekteres to transskripter samtidigt, kan begge antistoffer komme op. Anvendes en total mængde på 100 ul antistof-TNB opløsning per brønd og forsigtigt dækkes med en dækstrimmel. Glassene inkuberes i 2 timer.
4. Fjern dækglas omhyggeligt. Vask objektglassene i TNT buffer 3 gange i 5 min.
5. Fortynd FITC-fluorofor i tyramid amplifikationsreagens i et forhold på 1:500 og anvende 100 pi af opløsningen til hver brønd. Dække brøndene med dækglas og inkuberes i 12 min.
6. Fjern låget glider forsigtigt og vask gliderne 3 gange i 5 minutter i TNT-puffer ved forsigtig rystning.
7. Fortynd Cyan3-fluorofor i tyramid amplifikationsreagens i et forhold på 1:500. Tilsæt 100 pi prbrønd af denne opløsning. Dække brøndene med dækglas og inkuberes i 12 min.
8. Fjern låget glider forsigtigt og derefter glassene skylles hurtigt ved nedsænkning i TNT buffer.
9. Vask objektglassene 3 gange med TNT-puffer i 5 minutter.
10. Fordyb diasene hurtigt i DEPC-behandlet vand.
11. Lad objektglassene lufttørre. Monter glassene med anti-fade reagens indeholdende DAPI. Forsegl hjørnerne af dækglas med neglelak.
12. Objektglassene er nu klar til mikroskopi. Hold slides dækket med aluminiumfolie og opbevares ved 4 ° C, hvis forsøget er at være afsluttet næste dag. En fuldstændig forsegling af siderne af gliderne kan udføres 24 timer efter påføring af anti-fade reagens. Herved vil slides der skal afbildes i op til en uge efter protokollen er afsluttet.

6. Visualisering af hybridiserede prober

1. Tænd for mikroskopet. En standard immunofluorescens mikroskop er sufficient for denne slags eksperiment, men hvis du har adgang til et konfokalt mikroskop, kan du også bruge dette til 3D-billeder eller for at opnå videoer af dine farvede celler. Tillad mikroskop for at varme op i 15-30 minutter. Tænd for computeren og softwaren.
2. Kontrollere kvaliteten af ​​farvningen på immunofluorescens-mikroskop. Vælg et sted, der indeholder et par parasitter.
3. Justér forstærkningen af ​​hver laser manuelt. Juster pixel dvæle til 4-6 m ^-1 s ^-1 og de ​​skridt til 512 x 512 pixels.
4. Tag et testbillede med Frame Lambda. Justér laser gevinst.
5. Tage mindst 20 gode billeder af fluorescerende enkeltceller. Mindst 2-5 billeder af et felt indeholdende 5-20 parasitter er nødvendige for at opnå en rimelig overblik over procentdelen af ​​positive parasitter.

Representative Results

Figur 1 illustrerer et rutediagram af de vigtigste trin og varigheden af RNA FISH metoden.

En række repræsentative billeder af godt og dårligt bevarede farvede mRNA FISH eksperimenter med enkelt P. falciparum IE er vist i figur 2. Denne intracellulære protozo har en lille (fra 1 til 1,5 um diameter) kerne, som er farvet blåt med DAPI. Fireogtyve timer efter erythrocyt invasion i P. falciparum processen med schizogony, dvs nukleare division, begynder. Fisks påvisning af var gentransskription forekommer ved ca 10 til 22 timer i denne 48 timers intra-erytrocytiske lytiske cyklus. Prober generelt hybridisere til mRNA arter, der ligger lige op til den vigtigste nukleare organ, i hvad der sandsynligvis nuklear kappe-associeret endoplasmatiske reticulum. De billeder af god kvalitet i række A viser FITC-(grøn) og Cyan3-(rød) mærkede prober svarende til PFD1235w og PF11_0008 was gener forbindelser på den dobbelte udvalgte P. falciparum delaktionslinje, 3D7 _{PFD1235w/PF11_0008.} Co-lokalisering af generne fremgår, men ikke absolut. Række B viser ringe hybridisering af begge prober til parasitter, som har enten nedbrudt eller stort set ophørt omskriver var mRNA. I række C, er en god fisk hybridisering opnået, men det cellulære konservering er dårlig, som det fremgår af dårligt sprede og samle parasitter.

Figur 1. RNA FISH eksperiment flowchart. Rutediagrammet illustrerer de vigtigste punkter og tidspunktet for FISH procedure.

Figur 2. Konfokale billeder af RNA-FISH i dobbelt udvalgte P. falciparum angiver samtidig kørsel mRNA transkription af to forskellige was gener mærket med enten FITC (green) eller Cyan3 (rød) signal. DAPI-farvning (blå) angiver parasitten kerne-DNA. Den lodrette række a1, b1 og c1 viser transmissions billeder af parasitterne. Scale bar 5 um.

Discussion

RNA FISH-analyse, i modsætning til fremgangsmåder såsom Northern blotting og RT-PCR, muliggør diskriminering af specifikke mRNA-transkripter på enkeltcelleniveau. Dette gør det muligt at skelne mellem transkriptionelt aktive og inaktive celler, i dette eksempel, P. falciparum parasitiske protozoer inden i humane røde blodlegemer. Sådanne helcelle-observationer er ofte nødvendige, og kan udrede vigtige og hidtil ukendte transkriptionelle mønstre ^en.

Selvom andre RNA-FISH metoder er blevet beskrevet ^4-10, har der været et behov for udvikling af en ny og raffineret protokol til undersøgelse af samtidige var mRNA-transkription i P. falciparum. Ved at bruge asRNA prober som værktøjer til afsløring, kan de særlige tidsmæssige mønstre af mRNA aktivitet let lokaliseret i cellerne. Desuden kan asRNA prober også anvendes i andre eksperimentelle systemer som understøtter deres specificitet ^1. Andre critriske parametre der er vigtige ved udviklingen af ​​en ny protokol omfatter fiksering og permeabilzation af cellerne. Disse foranstaltninger er blevet empirisk defineret ved at teste forskellige kemiske reagenser som foreslået af andre forfattere ^5. Vi konkluderede, at ved at kombinere den langsomtvirkende tværbinder paraformaldehyd sammen med koagulanten fikseringsmiddel eddikesyre vi kunne opnå en god bevarelse af vævsmorfologi. Desuden fandt vi ud af, at præ-blokering af cellerne, før du tilføjer sonderne var det ikke nødvendigt, i lighed med andre beskrevet RNA FISH protokoller ^5. Endvidere i denne protokol anvender vi blid vask, en mild protease (pepsin) i lave mængder og en kort inkubationsperiode for at tillade sonden og antistofferne diffundere ind i kernen og hybridisere med mRNA fastgjort på ER, minimere skader på omkringliggende membraner (Fig 2a1-2A4).

Desuden genererede RNA fisk og billeder med høj opløsning ved cameren fastgjort til konfokalt mikroskop viser, om en bestemt celle er positive for farvning eller ikke, og også giver værdifuld information om de rumlige relationer mellem de farvede antisense-RNA og DAPI-farvet kerne. Som løst i billederne i fig 2A4, mRNA synes at være fastgjort ved siden af kernen, sandsynligvis i det endoplasmatiske reticulum, og ikke ovenpå det, som forventet i en DNA-FISH billede ^11-12.

Undersøgelser af enkeltceller kræver observationer af mange parasitter, og på forskellige tidspunkter for at få et statistisk signifikant resultat. Således RNA FISH-analyse er en temmelig tidskrævende teknik, der kræver tålmodighed og betydelige trial-and-error eksperimenteren at kalibrere teknikken. Da RNA FISH er en teknik mange parametre en fejlfinding guide til de vigtigste trin i denne protokol er angivet i tabel 1.

Problem	Mulig cause	Anbefaling
Svagt signal eller intet signal	Lav mRNA ekspression. mRNA nedbrydning. Probe nedbrydes, in-effektivt mærket eller for lav koncentration. For høj hybridiseringstemperatur. For lang pepsin behandling. Celler ikke permeabiliseret nok.	Kontroller proteinekspression ved FACS. Arbejdet under RNAse frie betingelser og kun bruge frisk fremstillede opløsninger. Gør et kvalitetstjek af den mærkede probe på gel og sammenligne til en mærket kontrol RNA. Lav en titrering serie af sonden koncentration i fisk. Reducere hybridiseringstemperatur trinvis. Reducere pepsin behandling længde. Forlænge pepsin treatment længde eller prøv en anden rengøringsmiddel.
Poor cellulær konservering	For høj parasitæmi eller stressede parasitter. For tykke film. Badly rengøres dias. Cellerne på dias er deattached.	Anvende en sund parasit kultur ved at holde parasitemia under 10% og ændring af cellemediet hver dag. Fortynd parasitten kultur. Rengør glassene med alkohol og vente mindst 10 min for dias til tørre. Brug frisk fremstillet para-formaldehyd og / eller øge paraformaldehydet inkubation længde.
Høj baggrund	For høj probekoncentration. Utilstrækkelig vask afparasitter. Bursting shizonts. Utilstrækkelige post-hybridiserings-vaske. Blokeringsbuffer er forurenet eller ineffektiv.	Lav en titrering serie af sonden koncentration i fisk. Vask parasitter to gange, før fremstilling af de tynde film. Synkronisere kulturen mere stramt. Øge antallet og / eller varigheden af ​​vaskene. Forbered ny blokeringspuffer. Prøv andre blokeringsreagens, koncentration eller forlænge blokeringsperioden
RNase behandlet kontrol er positiv	RNase løsning er inaktiv. For lav RNase koncentrationen. Inkubationen var for kort.	Forbered en ny Rnase løstion. Øge koncentrationen. Lav en titrering serie. Forlænge RNAse behandlingsperioden.
Falsk positiv påvisning af negative kontrol parasitter	Proben er ikke specifik. Parasitter udtrykker ikke mRNA detekteret af sonden.	Kontroller specificiteten af ​​proberne. Kontroller, at parasitten anvendte linje er den rigtige, og frisk valgt.

Tabel 1. Troobleshooting vejledning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate	Calbiochem	203206
Anti-Dig antibody	Novus biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digital	Nikon digital sight DC-F11
Coverslips	Menzel-glaser	631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99 %	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl	Sigma	H1758	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA	Fluka/Sigma	31149-106GF	0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O			Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4 %	Fluka/chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 %			950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin	Sigma/Aldrich	P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate
RNase	Sigma/Aldrich		Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 wells 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate	Sigma/aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder			9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent			0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco - CM LAB Aps	91016