Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent Published: October 7, 2012 doi: 10.3791/4073

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elena Ronander^1,2, Dominique C. Bengtsson^1,2, Louise Joergensen^1,2, Anja T. R. Jensen^1,2, David E. Arnot^1,2,3

¹Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen, ²Department of Infectious Diseases, Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), ³Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology, University of Edinburgh

Summary

Fluoriserende

Abstract

Heft Plasmodium falciparum infiserte erytrocytter (IE) til humane endotelceller reseptorer under malaria infeksjoner er mediert av uttrykk for PfEMP1 protein varianter kodet av VAR gener.

Den haploid P. falciparum genom havner omtrent 60 forskjellige VaR gener hvorav kun ett er antas å bli transkribert per celle om gangen under blod stadium av infeksjonen. Hvordan et slikt gjensidig utelukkende regulering av Var gentranskripsjon oppnås er uklart, er som identifisering av individuelle VAR gener eller undergrupper av Var gener assosiert med ulike reseptorer og konsekvensen av differensial binding på den kliniske utfallet av P. falciparum infeksjoner. Nylig har gjensidig utelukkende transkripsjon paradigme blitt kalt inn tvil ved transkripsjon analyser basert på individuelle P. falciparum karakterutskrift identifikasjon i ett infected erythrocytic celler ved hjelp av RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse av Var gentranskripsjon av parasitten i enkelte kjerner av P. falciparum IE ^en.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for gjennomføring av RNA-FISH metodikk for analyse av Var gentranskripsjon i single-kjerner av P. falciparum smittet humane erytrocytter. Metoden er basert på bruk av Digoxigenin-og biotin-merket antisens RNA sonder bruker TSA Plus Fluorescence Palette System ² (Perkin Elmer), mikroskopiske analyser og ferskt valgt P. falciparum IE. In situ hybridisering metoden kan brukes til å overvåke transkripsjon og regulering av en rekke gener som skal uttrykkes under de forskjellige stadier av P. falciparum livssyklus og er tilpasningsdyktig til andre malariaparasitten arter og andre organismer og celletyper.

Protocol

1. Generasjon Fersk Utvalgte Infiserte Erytrocytter

For denne analysen, blir de beste resultater oppnådd ved bruk av ferskt utvalgte kulturer for overflate ekspresjon av PfEMP1 protein. I dette spesielle forsøket 3D7 P. falciparum avstamning ble valgt ved hjelp av spesifikke antistoffer som tidligere beskrevet ^1.

Dag 1

1. Innhøsting 200fil av pakkede blodlegemer fra en P. falciparum kultur inneholdende 2-5% sent stadium IE ved sentrifugering ved 800 xg i 8 min ved romtemperatur.
2. Resuspendere blodet pelleten i 2 ml av 37 ° C varm 0,75% gelatin løsning i en 14 ml sterilt rør, og la til 15-20 min ved 37 ° C for å tillate den uinfiserte og ring-stadium dvs. å sedimentere.
3. Høste sent stadium IE, dvs. den øvre fasen, inn i en ny 14 ml rør og vask to ganger med 10 ml 37 ° C varm RBC-wash medier.
4. Fortynn 50 ul av spesifikt anti-PfEMP1-antistoffer i 2 ml av 37 ° C varm RBC-wash media og sterilt filter.
5. Bland den vaskede sent stadium IE med den steriliserte fortynnet antisera i en 14 ml sterilt rør og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C med forsiktig omrøring.
6. Spinne ned ved 800 xg i 8 min ved romtemperatur, og vaskes to ganger med 10 ml 37 ° C varm RBC-wash medier.
7. Vask 50 ul Dynabead Protein A suspensjon to ganger med RBC-wash medier med en DynaMaq-15 magnet.
8. Resuspender Dynabeads i 300 ul RBC-wash media og legge dem til den vaskede sent stadium IE. Inkuber i 30 min ved 37 ° C med forsiktig omrøring.
9. Overfør røret til DynaMaq-15 magnet. Permisjon for 1-2 min og fjerne all væske.
10. Resuspender Dynabeads i 4-5 ml RBC-wash media. Overføre røret tilbake på magneten og la den i 1-2 min før fjerner all væsken. Gjenta vasketrinn gang.
11. Overfør de vaskede perler i et 25 cm ² steril kultur fLASK inneholdende 200 ul ferskt erytrocyttkonsentrat. Tilsett 5-6 ml Albumax media i kulturen. Lagre natten over ved 5% CO ₂ ved 37 ° C.

Dag 2

12. Fjern Dynabeads fra kulturen når den valgte IE har reinvaded frisk røde blodceller ved å overføre alle kultur til en 14 ml sterilt rør. Sett røret på DynaMaq-15 magnet og la stå i 1-2 min. Deretter helle væsken tilbake til en kultur kolbe.
13. Kultur for så få sykluser som mulig inntil en parasitemia på 5-10% og parasitter er på ringstage.
14. IE bør analyseres av FACS å sørge for at riktig overflate fenotype, dvs. har protein uttrykk for enten PFD1235w and/orPF11_0008 oppnådd ^en.

2. Utarbeidelse av prober

De antisens RNA prober ble generert fra de mest variable områder av PFD1235w og PF11_0008 Var </ Em> gener fra P. falciparum 3D7 genomisk DNA. DNA ble amplifisert ved PCR og klonet inn i pSPT18 eller 19 vektor for transkripsjon, henholdsvis i henhold til produsentens beskrivelse (Roche). Probene (580 basepar (bp) og 590 bp i lengde) ble merket med Digoxigenin (DIG) eller biotin ved hjelp av en RNA DIG merking Kit eller en Biotin RNA merking Mix, henholdsvis. Vi bekreftet spesifisitet av sonder både av Northern blot analyser og ved ett-label FISH analyse ^1.

3. Tynn Smear og fiksering av parasitter Før In Situ Hybridisering

Dag 1

Alle trinn blir utført i en RNase-fritt miljø og alle reagenser er RNase-fri eller pre-behandlet med dietyl pyrocarbonate (DEPC) eller RNase Zap (Invitrogen). Lysbilder og dekkglass bør rengjøres med alkohol for å fjerne rester av produksjon fett. Det er viktig å utføre protokollen uten pause i mellom trinnenefor å minimere risikoen for nuklease kontaminering.

1. Lage en tynn blod film av standard spre metode ^3. Bruke 100x olje objektiv av mikroskopet, telle IE og beregne prosentandelen av IE i kulturen. Kontroller at parasitten stadiene er i omtrentlig synkronisering, i ringen og tidlige trophozoite stadier av IE syklus. Disse er den pre-replikasjon, uni-kjernekoking etapper, uttrykke Var genet mRNA og egnet for encellete FISH transkripsjon analyser av denne type.
2. Overfør 50 ul av parasitten kulturen, ved en parasitemia på 5-10%, til et 1,5 ml RNase-frie Eppendorf-rør. Sentrifuger i 1 min ved 2000 rpm ved romtemperatur.
3. Ta ut papiret og legg 50 pl PBS pH 7,2 i DEPC behandlet vann. Agitere røret forsiktig. Gjenta sentrifugal sedimentering trinnet to ganger for å vaske cellene frie fra media og cellerester.
4. Gjøre fire gode tynne flekker. For hver smøre, gjøre en smear påen 11 mm diameter brønn i en 4 godt lysbilde, fire dvs. glassplater totalt, i en RNase-fri hette (et kritisk trinn). Wave glir kort i luften for å tørke. Gjøre tre ekstra lysbilder for negative kontroller-en lysbilde for enkelt sonde farging for annen irrelevant genet ved hjelp av en spesifikk probe, et annet lysbilde for RNase behandling og en tredje lysbilde inneholdende IE ikke uttrykke genet av interesse. La lysbilder til tørk på benken i 10-20 min.
5. Fest tynne filmer ved å legge 60 ul fikseringsløsning inneholdende 4% paraformaldehyd og 5% iseddik i brønnene. Forlate for 10 min på benken ved romtemperatur.
6. Vask lysbildene i 2x SSPE buffer i 5 min ved forsiktig omrøring ved romtemperatur. Kort fjerne overflødig væske ved å berøre brønnene som inneholder cellene forsiktig med et papirlommetørkle.
7. Dekk objektglassene med 0,01% pepsin i 0,01 M HCl i 2 min ved 37 ° C (en svært kritisk trinn). Vask lysbildene i 2x SSPE i 5 min ved romtemperatur.
8. Fortynne RNase løsning til en sluttkonsentrasjon på 10 pg / ml. Dekker Den negative kontrollen utstryk med 60 pl av den RNase løsningen. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og deretter vaske lysbildene i 2x SSPE i 5 min ved romtemperatur.
9. Fortsette umiddelbart til hybridiseringsreaksjonen trinn.

4. Hybridisering av RNA prober til faste lysbilder

Dag 1

1. Klargjør hybridisering kammeret, for eksempel en 100 ThermoStar HC4 eller en tom pipettespiss boks satt i en ren ovn, ved sprøyting med RNase Zap og tørke det rent med en papirserviett. Fyll kanaler av hybridiserings kammer eller bunnen av boksen med DEPC-behandlet vann for å sørge for at lysbildene ikke tørker ut under hybridiseringen. Lukk kammeret og forvarmingen til 48 ° C.
2. Fortynn probene i hybridiserings løsningen til en slutt-konsentrasjon på 12 ng / pl. Denature sonden løsningen ved 65 ° C i 5 min i en varmeblokk. Umiddelbart chill på isen.
3. Kort lufttørke lysbildene etter 2x SSPE vask. Fjern forsiktig overflødig væske rundt brønnene med et papirlommetørkle.
4. Åpne hybridisering kammer og plasser lysbildene i kammeret. Påfør en eller begge sonder i et totalvolum på 60 ul per brønn. Nøye dekke flytende slipp med en RNase-fri dekkglass med steril tang.
5. Lukk kammeret og hybridisere lysbildene ved 48 ° C i minst 16 timer over natten.

5. Antistoff Bøyning og Fluorescence Amplification

Dag 2

Følgende trinn er basert på TSA Plus Fluorescence Palette System fra Perkin Elmer. Alle trinnene er gjort ved romtemperatur.

1. Vask lysbildene 3 ganger i TNT buffer i 5 min med forsiktig omrøring.
2. Blokker brønnene i 150 ul TNB buffer i 30 min.
3. Fortynn HRP-konjugert α-DIG-antistoff i TNB buffer ved et forhold på 1:100, og HRP-konjugert α-biotin antistoff i TNB buffer i forholdet 1:500. Fjern overflødig TNB buffer fra lysbildene med et papirlommetørkle. Når det oppdages to transkripsjoner samtidig, kan begge antistoffer gå samtidig. Påfør et totalbeløp på 100 ul av antistoff-TNB løsning per brønn og nøye dekke med lokk. Inkuber lysbilder for 2 hr.
4. Fjerne dekkglass nøye. Vask lysbildene i TNT buffer tre ganger i 5 min.
5. Fortynn FITC-fluoroforen i tyramide forsterkning reagenset i forholdet 1:500 og påfør 100 ul av løsningen til hver brønn. Dekk brønnene med dekkglass og inkuberes i 12 min.
6. Ta av dekselet glir forsiktig og vaske lysbildene 3 ganger i 5 min i TNT buffer ved forsiktig omrøring.
7. Fortynn Cyan3-fluoroforen i tyramide forsterkning reagenset i forholdet 1:500. Tilsett 100 ul pervel av denne løsningen. Dekk brønnene med dekkglass og inkuberes i 12 min.
8. Ta av dekselet glir forsiktig og skyll lysbildene raskt ved nedsenkning i TNT buffer.
9. Vask lysbildene 3 ganger med TNT buffer i 5 min.
10. Fordype lysbildene raskt i DEPC behandlet vann.
11. La lysbilder lufttørke. Monter lysbilder med anti-fade reagens som inneholder DAPI. Forsegle hjørnene på dekkglass med neglelakk.
12. Lysbildene er nå klar for mikroskopi. Hold lysbildene dekket med aluminiumsfolie og oppbevar ved 4 ° C dersom forsøket er å være ferdig neste dag. En fullstendig forsegling av sidene av lysbildene kan utføres 24 timer etter påføring av anti-fade reagens. Dette vil tillate lysbildene skal bli avbildet i opptil en uke etter protokollen er fullført.

6. Visualisering av hybridiserte prober

1. Slå på mikroskopet. En standard immunfluorescens mikroskop er sufficient for denne type eksperiment, men hvis du har tilgang til en confocal mikroskop kan du også bruke dette for 3D-bilder eller for å oppnå videoer av fargede celler. Tillate mikroskop for å varme opp for 15-30 min. Slå på datamaskinen og programvaren.
2. Kontroller kvaliteten på flekker på immunfluorescens mikroskop. Velg et sted som inneholder noen få parasitter.
3. Justere forsterkningen av hver laser manuelt. Juster pixel bor til 4-6 m ^-1 s ^-1 og trinnene til 512 x 512 piksler.
4. Ta en test bilde med Frame Lambda. Omstille laseren gevinst.
5. Ta minimum 20 gode bilder av fluorescerende enkeltceller. Minst 2-5 bilder av et felt som inneholder 5-20 parasitter blir nødvendig for å oppnå en rimelig oversikt over prosentandelen av positive parasitter.

Representative Results

Figur 1 illustrerer et flytskjema av de store trinn og varigheten av RNA FISH metodikk.

En rekke representative bilder av godt og dårlig bevarte farget mRNA FISK forsøk med én P. falciparum IE er vist i figur 2. Dette intracellulære protozo har en liten (1-1,5 mikrometer diameter) kjerne som er farget blå med DAPI. Fire tyve timer etter erytrocytt invasjon i P. falciparum prosessen schizogony, dvs. kjernefysisk inndeling, begynner. Optimal FISH deteksjon av Var gentranskripsjon oppstår på rundt 10-22 timer i denne 48 hr intra-erythrocytic lytisk syklus. Prober generelt hybridisere til mRNA arter som synes tilstøtende til hovedsiden kjernefysiske kroppen, i det som sannsynligvis kjernefysisk konvolutt-assosiert endoplasmatiske retikulum. De gode bilder i rad Et show FITC-(grønn) og Cyan3-(rød) merkede prober som tilsvarer PFD1235w og PF11_0008 VAR gener, henholdsvis i den doble valgte P. falciparum sub-line, 3D7 _{PFD1235w/PF11_0008.} Samlokalisering av genene er åpenbare, men ikke absolutt. Row B viser dårlig hybridisering av begge sonder til parasitter som enten har degradert eller i stor grad opphørt transkribere Var mRNA. I raden C, en god FISH hybridisering oppnådd men den cellulære bevaring er dårlig, som vist ved dårlig spredt og aggregere parasitter.

Figur 1. RNA FISH eksperiment flytskjema. Flytdiagrammet illustrerer de viktigste punktene og tidspunktet for FISH prosedyren.

Figur 2. Confocal bilder av RNA-FISH i dobbel valgt P. falciparum indikerer simultanous mRNA transkripsjon av to forskjellige gener VAR merket med enten FITC (grønt) eller Cyan3 (rød)-signal. DAPI farging (blå) viser parasitten kjerne-DNA. Den vertikale rad a1, b1 og c1 viser overføring bilder av parasitter. Målestokk 5 mikrometer.

Discussion

RNA FISH analyse, i motsetning til metoder som Northern blotting og RT-PCR, tillater diskriminering av spesifikke mRNA transkripter på enkelt celle-nivå. Dette gjør det mulig å diskriminere mellom transkripsjonelt aktive og inaktive celler, i dette eksemplet, P. falciparum parasittiske protozoer inne humane røde blodceller. Slike hel-celle observasjoner er ofte nødvendig, og kan rakne viktige og romanen transkripsjonelle mønstre ^en.

Selv om andre RNA FISH metoder har blitt beskrevet ^4-10, har det vært et behov for utvikling av en ny og raffinert protokoll for studiet av samtidige Div. mRNA transkripsjon i P. falciparum. Ved å bruke asRNA sonder som deteksjon verktøy, kan de spesielle temporale mønstre av mRNA aktivitet lett lokalisert i cellene. I tillegg kan asRNA sonder også brukes i andre eksperimentelle systemer som ville støtte sin spesifisitet ^en. Andre critical parametere som er viktige ved utviklingen av en ny protokoll omfatter fiksering og permeabilzation av cellene. Disse trinnene ble empirisk definert ved å teste ulike kjemiske reagenser som foreslått av andre forfattere ^5. Vi konkluderte med at ved å kombinere den langsomme fungerende korset linker paraformaldehyd sammen med koagulanten fiksativ eddiksyre kunne vi oppnå en god bevaring av vevet morfologi. I tillegg fant vi ut at pre-blokkering cellene før du legger sondene ikke var nødvendig, på samme måte som andre beskrevet RNA FISH protokoller ^5. Videre, i den foreliggende protokollen bruker vi milde vaskinger, en mild protease (pepsin) ved lave mengder og en kort inkuberingsperiode for å tillate sonden og de antistoffer som diffunderer inn i cellekjernen og hybridisere med mRNA festet på ER, minimere skade på omliggende membraner (Fig. 2A1-2A4).

I tillegg, den RNA fisken og høyoppløsningsbilder generert av cameren festet til konfokal mikroskop avslører om en bestemt celle er positiv for farging eller ikke, og også gir verdifull informasjon om den romlige relasjoner mellom farget antisens RNA og DAPI farget kjernen. Som løst i bildene i figur 2A4, vises mRNA som skal festes ved siden av kjernen, sannsynligvis i endoplasmatisk retikulum, og ikke på toppen av det, som forventet i en DNA-FISH bilde ^11-12.

Studier av enkeltceller krever observasjoner av tallrike parasitter og til forskjellige tidspunkter for å få en statistisk signifikant resultat. Dermed er RNA FISH analyse en ganske tidkrevende teknikk som krever tålmodighet og betydelig prøving og feiling eksperimentering for å kalibrere teknikk. Som RNA FISH er en teknikk av mange parametere en feilfri skyting guide til de viktigste trinnene i denne protokollen er gitt i tabell 1.

Problem	Mulig cause	Anbefaling
Svakt signal eller ikke noe signal	Lav mRNA uttrykk. mRNA nedbrytning. Probe brytes ned, i-effektivt merket eller for lav i konsentrasjon. For høy hybridisering temperatur. For lang pepsin behandling. Cellene er ikke permeabilized nok.	Sjekk protein uttrykk ved FACS. Arbeide under RNase forhold og bruker bare nylagde løsninger. Gjøre en god sjekk av merket probe på gel og sammenligne til en merket kontroll RNA. Foreta en titrering serie av sonden konsentrasjon i fisk. Reduser hybridisering temperatur trinnvis. Reduser pepsin behandling lengde. Forleng pepsin treatment lengde eller prøve en annen vaskemiddel.
Dårlig mobilnettet bevaring	For høy parasittmengden eller stressede parasitter. For tykk film. Dårlig rengjort lysbilder. Cellene på lysbildene er deattached.	Bruk en sunn parasitt kultur ved å holde parasitemia under 10% og endre cellen media hver dag. Fortynn parasitten kulturen. Rengjør lysbilder med alkohol og vent i minst 10 min for lysbildene til tørk. Bruk tilberedes para-formaldehyd og / eller øke paraformaldehyd inkubering lengde.
Høy Bakgrunn	For høy probe konsentrasjon. Utilstrekkelig vask avparasitter. Sprengning shizonts. Utilstrekkelige innlegg hybridisering lakenpose. Blokkering buffer er forurenset eller ineffektiv.	Foreta en titrering serie av sonden konsentrasjon i fisk. Vask parasitter to ganger før du tilbereder den tynne filmer. Synkroniser kulturen tettere. Øke antallet og / eller lengden av vasker. Klargjør ny blokkering buffer. Prøv andre blokkerer reagens, konsentrasjon eller forlenge blokkeringsperioden
RNase behandlet kontrollen er positiv	Den Rnase løsningen er inaktiv. For lavt RNase konsentrasjon. Inkubasjonen var for kort.	Utarbeide en ny Rnase løsningsjon. Øke konsentrasjonen. Foreta en titrering serie. Forleng RNase behandlingsperioden.
Falsk positiv påvisning av negativ kontroll parasitter	Sonden er ikke bestemt. Parasitter uttrykker ikke mRNA detektert av sonden.	Sjekk spesifisitet av sonder. Sjekk at parasitten linje som brukes er den rette og fersk valgt.

Tabell 1. Troobleshooting veiledning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate	Calbiochem	203206
Anti-Dig antibody	Novus biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digital	Nikon digital sight DC-F11
Coverslips	Menzel-glaser	631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99 %	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl	Sigma	H1758	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA	Fluka/Sigma	31149-106GF	0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O			Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4 %	Fluka/chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 %			950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin	Sigma/Aldrich	P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate
RNase	Sigma/Aldrich		Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 wells 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate	Sigma/aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder			9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent			0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco - CM LAB Aps	91016