Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van macrofagen In vivo, Die voortvloeien gepolariseerde macrofagen uit het beenmerg zuigt, en adoptief overdracht van macrofagen in muizen. Deze technieken laten toe de bepaling van de rol die gepolariseerde macrofagen spelen bij gezondheid en ziekte.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Macrofagen zijn kritisch spelers in de aangeboren immuunrespons op infectueuze uitdaging of letsel, de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Macrofagen disfunctie kan leiden tot een onvermogen om een adequate immuunrespons en als zodanig, zijn in vele ziekteprocessen, zoals inflammatoire darmziekten. Macrofagen weer te geven gepolariseerde fenotypen die in het algemeen onderverdeeld in twee categorieën. Klassiek geactiveerde macrofagen, geactiveerd door stimulatie met IFNy of LPS, spelen een essentiële rol in reactie op bacteriële uitdaging terwijl alternatief geactiveerde macrofagen, geactiveerd door IL-4 of IL-13, deel te nemen aan puin wegvangen en weefselremodellering en zijn betrokken bij de resolutie fase van ontsteking. Tijdens een ontstekingsreactie in vivo, zijn macrofagen gevonden te midden van een complex mengsel van infiltrerende immuuncellen en kunnen deelnemen door verergeren of resolving ontsteking. De rol van macrofagen bepalen in situ in een geheel diermodel is worden onderzocht het effect van afbreken macrofagen van de complexe omgeving. Voor vragen over de rol van de macrofaag fenotype in situ te vragen, kan fenotypisch gedefinieerd gepolariseerde macrofagen worden ontleend ex vivo, uit het beenmerg zuigt en toegevoegd terug naar muizen, met of zonder voorafgaande uitputting van de macrofagen. In de hier gepresenteerde protocol clodronaat bevattende liposomen versus PBS geïnjecteerd controles werden gebruikt colon macrofagen afbreken in dextran natriumsulfaat (DSS) geïnduceerde colitis bij muizen. Daarnaast werden gepolariseerde macrofagen afgeleid ex vivo en overgedragen aan muizen door intraveneuze injectie. Een waarschuwing deze benadering is dat clodronaat bevattende liposomen afbreken alle professionele fagocyten, zowel dendritische cellen macrofagen, zodat om het effect waargenomen door depletie macrofagen specifieke reconstitutie of fenotype van adoptieve overdracht van macrofagen noodzakelijk. Systemische macrofaag depletie in muizen kunnen worden bereikt door het terugkruisen muizen op een CD11b-DTR achtergrond, hetgeen een uitstekende complementaire aanpak. Het voordeel van clodronaat bevattende liposoom-gemedieerde afbraak is dat het niet de tijd en kosten in terugkruisen muizen vereist en kan worden gebruikt bij muizen ongeacht de achtergrond van de muizen (C57BL / 6, BALB / c, of gemengd achtergrond ).
Protocol
1. Aantasten Macrofagen Met behulp van Clodronaat-bevattende liposomen
- Liposomen zijn opgeslagen bij 4 ° C. Twee uur voor de injectie, verwijder clodronaat-bevattende liposomen, PBS-bevattende liposomen, of steriele PBS (injectie controle) uit de koelkast zodat ze om te acclimatiseren op kamertemperatuur (18 ° C).
- Keren de buizen liposomen 8-10 maal om een gelijkmatige verdeling ontstaat voor het laden 200 pi in een 1 ml spuit. Bevestig een 26 gauge naald voor aan de bovenkant van de spuit.
- Met behulp van je linkerhand, scruff de muis net onder de oren vasthouden genoeg de huid haar hoofd en ledematen te immobiliseren.
- Kantel de muis, zodat het hoofd iets naar de grond, zodat de inwendige organen af te stappen van de injectieplaats, die is gelegen in de rechter kwadrant van de buik.
- Rol de spuit tussen uw handpalmen en keer het 6 keer om het liposoom gelijkmatig oplossing voor de injectie te verdelen.
- Steek de naald in de rechter zijkant van de muis buik op een 30-40 graden. Injecteer 200 ul liposoom oplossing of PBS.
- Tijdens een geïnduceerde ontsteking model, zoals DSS-geïnduceerde colitis, injecteren muizen 4 dagen voor aanvang van de experimentele ontsteking tot uitputting van de inwoner macrofagen en om de 2 dagen te verzekeren tijdens het protocol bij nieuwe infiltrerende macrofagen afbreken.
- Aan het einde van het experiment, samen met de geplande experimentele analyses, verwijder weefsels van de plaats van belang en bevestig deze met paraformaldehyde tot macrofagen uitputting te bevestigen door immunohistochemische kleuring.
2. Afleiding van gepolariseerde Macrofagen uit beenmerg aspiratae
- Beenmerg van muizen tussen 8 en 12 weken bepaald de hoogste opbrengst van beenmerg-afgeleide macrofagen. Euthanaseren van de muis, leg het op zijn rug, en vast te pinnen zijn poten, dat zich uitstrekt zijn ledematen zoveel mogelijk.
- Werken in een steriele hood, verwijder het dijbeen en de dij-, weg te snijden zo veel spieren mogelijk te maken.
- Spoel beenmerg van beenderen met IMDM met 10% FCS geladen in een 5 ml uitgerust met een 26 gauge naald.
- Verdun beenmerg zuigt 40 ml in IMDM met 10% FCS, plaats cellen in een 75 cm2 weefselkweek erlenmeyer, en incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 uur. Deze stap verwijdert hechtende mesenchymale cellen of rijpe macrofagen van hematopoietische voorlopercellen.
- Transfer kweeksupernatant met niet-hechtende voorlopers 50 ml Falconbuis conische en centrifugeer 5 min bij 1200 rpm.
- Hersuspenderen celpellet in 5 ml IMDM, 10% FCS en tellen kern cellen door verdunnen celsuspensie 1 20 in azijnzuur. Deze procedure lyseert alle cellen met inbegrip van rode bloedcellen en de overige kernen kan worden gerekend op een hemocytometer.
- Hersuspenderen cellen bij een concentratie van 0,5 x 10 6 cellen / ml in compleet medium, IMDM, 10% FCS, 150 uM monothioglycerol (MTG), en 10 ng / ml van een MCSF, GM-CSF of IL-3. MCSF-afgeleide macrofagen zijn klassiek geactiveerde macrofagen terwijl GM-CSF-of IL-3-afgeleide macrofagen worden afwisselend geactiveerd.
- Vervang medium op dag 4, te stoppen met draaien niet-hechtende cellen en de terugzending daarvan aan de kolf, en op dag 7 en gooi niet-hechtende cellen.
- Bovendien kan IFNy (10 ng / ml) of IL-4 (10 ng / ml) toegevoegd flesjes MCSF-afgeleide cellen op dag 7 schuin macrofagen een klassiek geactiveerd of alternatief geactiveerd fenotype, respectievelijk. Incubeer cellen voor 3 dagen.
- Op dag 10, verwijder media en til cellen off van de weefselkweek fles met behulp van Cell Dissociation Buffer (Gibco-BRL). Place 5 ml buffer op cellen gedurende 5 min bij kamertemperatuur (18 ° C) en stoten de zijkant van de kolf met de hiel van de handpalm enkele malen stevig. Zorg ervoor dat de cellen zijn gestart van de kolf door onderzoek van de kolf onder eenmicroscoop. Pipet geresuspendeerd cellen in een 15 ml Falcon buis konische en was de kolf met een extra 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool en spin down van de cellen gedurende 5 min bij 300 × g.
- Tellen levensvatbare cellen door een hemocytometer en hersuspenderen bij een concentratie van 10 7 cellen / ml in steriel PBS pH 7,4. Macrofagen zijn er klaar voor injectie in muizen.
- Reserve 1,0 × 10 6 macrofagen voor de beoordeling van de macrofaag fenotype. Klassiek geactiveerde macrofagen gestimuleerd met lipopolysaccharide scheiden een hoog niveau van stikstofoxide en IL-12p70 en lage niveaus van IL-10 in vergelijking met alternatief geactiveerde macrofagen. Ook geactiveerde macrofagen constitutief drukken YM1 en arginase I (Argi), dat kan worden gedetecteerd door Western immunoblotting.
3. Overmaking van macrofagen in muizen
- Hersuspenderen macrofagen in steriele PBS in een concentratie van 10 7 cellen / ml. Dit maakt een intravenous injectie van 10 6 macrofagen in een totaal volume van 100 pi, die een volume kan worden veilig en gemakkelijk in muizen geïnjecteerd staartader.
- Warm muizen met behulp van een verwarmingselement of warmte schoot gedurende 5-10 minuten tot de staartader verwijden. Bewaken van de muis te allen tijde op tekenen van hyperthermie.
- Breng de muis om een beveiligingssysteem dat de toegang tot de staart aderen mogelijk maakt.
- Draai de staart 90 °, zodat de ader naar boven is gericht. Aders lopen zijwaarts op beide zijden van de staart en een ader kan worden gebruikt.
- Reinig de injectieplaats met een alcoholdoekje en injecteer langzaam 100 ul (10 6 macrofagen) met een 1 ml spuit met een 26 of 28 gauge naald. Steek de naald met de schuine kant naar boven en onder een lichte hoek, bijna parallel aan de ader.
- Als de naald correct is geplaatst zonder weerstand moet worden gevoeld en de ader moet duidelijk worden na de injectie. Als de naald zich niet in deader, de staart zal bult. Als dit gebeurt, verwijder de naald en probeer het opnieuw proximaal van de laatste poging of in de andere ader. Een nieuwe naald moet worden gebruikt voor elke injectie als de staart is taai en de naalden dof snel tijdens staartader injectie.
- Na de injectie, verwijder de naald, druk zachtjes op de injectieplaats tot de bloeding stopt, en toezicht houden op de muis voor een extra 5min om ervoor te zorgen dat de bloeding is gestopt.
- Herhaal macrofaag injecties om de 4 dagen een continue levering van gepolariseerd macrofagen tijdens de experimentele procedure te garanderen.
- Aan het einde van het experiment, samen met experimentele analyses, verwijder weefsels van de plaats van belang en bevestig deze met paraformaldehyde of formaline tot het effectief bereiken van gepolariseerd macrofagen door immunohistochemische kleuring te bevestigen.
4. Representatieve resultaten
Het aantal en de fenotype van de ingezeten macrophages in elk weefsel afhankelijk van het weefsel onderzocht en zal veranderen infectie of ontsteking. Ook zal het vermogen van clodronaat bevattende liposomen macrofagen putten uit een weefsel afhangen van de route van toediening en effectieve de doelweefsel. Intraperitoneale injectie van clodronaat bevattende liposomen resulteert in een afname F4/80 + macrofagen in de muis colon bij DSS colitis-zichtbaar door immunohistochernische kleuring voor het macrofaag marker F4/80 (figuur 1A). Histologische vlekken kunnen ook worden gebruikt om kwantitatieve verschillen in macrofagen aantal en fenotype in weefselcoupes bepalen. Figuur 1b toont dat gemiddeld 55% van macrofagen is uitgeput door clodronaat bevattende liposomen in vergelijking met geen afbraak gedetecteerd muis zuilen bij muizen geïnjecteerd PBS alleen een injectie controle. Elke waarde wordt bepaald door het tellen van F4/80 en Argi vleked positieve cellen in serie weefselcoupes van 6 muizen op 3 punten, in 3 delen per muis met het tellen wordt uitgevoerd door twee personen blind voor experimentele conditie. Deze resultaten demonstreren dat intraperitoneale injecties clodronaat liposomen colon bij muizen macrofagen afbreken.
Afleiding van macrofagen van beenmerg in de aanwezigheid van verschillende groeifactoren opbrengst macrofagen die klassiek geactiveerd (MCSF gewonnen of MCSF afkomstige en behandeld met IFNy) of geactiveerde (GM-CSF of IL-3 afgeleide of MCSF afgeleid en behandeld met IL-4). Vlissingen beenmerg van 2 dijbeen en 2 dij van een 8 weken oude muis meestal levert 6 × 10 7 cellen met een kern per muis en levert 8 × 10 6 MCSF-afgeleide macrofagen, 10 × 10 6 GM-CSF-afgeleide macrofagen, of 12 × 10 6 IL-3 afgeleide macrofagen. Figuur 2A toont sup nitriet en IL-12p70/IL-10 verhouding macrofaagernatants behandeld met lipopolysaccharide 24 uur Figuur 2B toont een typische Western blot analyse van 0,5 x 10 6 macrofagen van MCSF + / -. IL-4 afleiding voorwaarden onderzocht met antilichamen voor alternatief geactiveerde macrofagen markers, Argi, YM1 of met een GAPDH laden van controle. Deze gegevens tonen aan dat het beenmerg-afgeleide macrofagen kunnen worden scheef naar een gepolariseerde fenotype tijdens de afleiding.
Efficiënte overdracht van ex vivo verkregen gepolariseerde macrofagen een weefsel is afhankelijk van de wijze van toediening en de toegang tot het weefsel. Tijdens de DSS-geïnduceerde colitis, macrofagen intraveneus te reizen naar de plaats van de ontsteking en als alternatief geactiveerde macrofagen te verminderen ernst van de ziekte. Figuur 3A toont het totale aantal van macrofagen en het aantal Argi + (als alternatief geactiveerd) macrofagen geteld in histologische coupes van muizen geïnjecteerd met gepolariseerde beenmergAfgeleid macrofagen. De impact van de overdracht van gepolariseerd macrofagen om de dikke darm tijdens DSS-geïnduceerde colitis wordt aangegeven door activiteit van de ziekte-index, een additief score op basis van gewichtsverlies, rectale bloedingen en een verminderde consistentie van de ontlasting (Figuur 3B). Deze resultaten tonen aan dat de ex vivo verkregen, adoptief overgedragen macrofagen kan het verkeer naar de dikke darm en de impact geïnduceerde ontsteking. M1 macrofagen hebben geen invloed op ontstekingen terwijl M2 macrofagen aanzienlijk verminderen ziekte activiteit index.
Figuur 1. Clodronaat-bevattende liposomen effectief F4/80 afbrekende + en F480 + Argi + cellen in muis dubbele punten in vivo. Een F2 generatie van wild-type muizen op een gemengde C57BL / 6 × 129Sv achtergrond kregen 5% DSS voor 7 dagen en geïnjecteerde IP met PBS (Control) of clodronaat-bevattende liposomen (Clodronaat) 4 dagen voorafgaand aan de behandeling DSSen op dag 0, 2, 4 en 6 in DSS behandeling. (A) dikke darmen werden verwijderd, vast, en secties werden gekleurd door immunohistochemie voor de rijpe macrofagen (F4/80) en de M2 macrofaag marker, Argi. (B) Kwantificering van F4/80 + en + Argi macrofagen. Positief gekleurde cellen werden geteld door twee personen blind voor experimentele conditie bij 40 x vergroting in 6 velden van 3 secties / muis en vanaf 6 muizen / groep. * P <0.01.
Figuur 2. MCSF-afgeleide macrofagen drukken een klassiek geactiveerde fenotype en MCSF-afgeleide macrofagen behandeld met IL-4 te drukken een alternatief geactiveerde macrofagen fenotype. (A) Overeenkomstig een klassiek geactiveerde fenotype MCSF afgeleide macrofagen produceren hogere stikstofmonoxide in reactie op lipopolysaccharide en kan gemeten worden door de Griess test, die het stroomafwaartse metaboliet nitriet detecteert. Ze ALSo produceren hogere IL-12p70/IL-10 verhouding die kan worden gemeten met ELISA. * P <0,01 voor n = 3. (B) Overeenkomstig een alternatief geactiveerde fenotype MCSF afgeleide macrofagen behandeld met IL-4 constitutief express YM1 en Argi, dat kan worden gedetecteerd door Western immunoblotting. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten.
Figuur 3. Intraveneuze geïnjecteerd, ex vivo-afgeleid alternatief geactiveerde macrofagen verkeer naar de dikke darm en vermindering van intestinale ontsteking. Een F2 generatie van wild-type muizen op een gemengde C57BL / 6 × 129Sv achtergrond kregen 5% DSS in het drinkwater voor zes dagen. M1 en M2 macrofagen werden geïnjecteerd IV op de dagen 0 en 4 tijdens de DSS-behandeling. (A) dikke darmen werden verwijderd, vast, en secties werden gekleurd door immunohistochemie voor de rijpe macrofagen (F4/80) en een M2-macrofaag marker (Argi).Kwantificering van macrofagen de controle PBS geïnjecteerde muizen (C) werden muizen geïnjecteerd met M1 macrofagen (+ M1) en muizen ingespoten met M2 macrofagen (+ M2) uitgevoerd door het tellen positief aangekleurde cellen bij 40 x vergroting in 6 gebied van 3 delen / muis en van 6 muizen / groep. Tellen werd uitgevoerd door twee personen blind voor experimentele conditie. (B) ziekte-activiteit werd gevolgd en dagelijks gescoord tijdens de behandeling en is een additief score op basis van gewichtsverlies, rectale bloedingen en een verminderde consistentie van de ontlasting. * P <0,05 voor n = 6 muizen 2 onafhankelijke experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Macrofagen zijn fagocyterende cellen die een belangrijke rol in het immuunsysteem spelen. Zij zijn verantwoordelijk voor de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Typisch, zijn klassiek geactiveerde macrofagen geactiveerd door IFNy of LPS en zijn verantwoordelijk voor het elimineren van pathogenen en het monteren van een ontstekingsreactie 1. Omgekeerd worden afwisselend geactiveerde macrofagen geactiveerd door IL-4 of IL-13 en een rol puin spoelen en weefselre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een 'Grant ten behoeve van onderzoek' van de Crohn en Colitis Foundation of Canada naar LMS, die wordt bijgestaan door een Canadese Vereniging van Gastro-enterologie / Canadese Vereniging van Health Research / Crohn en Colitis Foundation of Canada New Investigator Award.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| Clodronaat bevattende liposomen | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS bevattende liposomen | Clodronateliposomes.org | ||
| Steriele PBS pH 7,4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Foetaal Kalf Serum (FKS) | Invitrogen | 12483 | |
| azijnzuur | BDH ARISTAR | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant muizen MCSF | StemCell Technologies | 02951 | |
| Recombinant muizen GM-CSF | StemCell Technologies | 02935 | |
| Recombinant muriene IL-3 | StemCell Technologies | 02903 | |
| Recombinant muizen IFNy | StemCell Technologies | 02746 | |
| Recombinant muriene IL-4 | StemCell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociatie Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antilichaam | Abd Serotec | MCA497GA | |
| Muis anti-Argi antilichaam | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Tabel 1. Reagentia in dit protocol.
Referenties
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14(2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
