Summary
一种快速的方法，调查相关的抗体的存在下，在细胞内环境中的分子机制的相互作用和效果进行说明。该方法涉及的抗体的转染到活细胞，使用的基础上的脂质制剂的非共价复合物的形成。该技术是适应的永生化细胞系和原代细胞。
Abstract
抗体的能力，获得新的洞察发生在生命系统的各种事件。产生非常具体的目标蛋白的抗体，可以非常精确的生物学问题的能力加以解决。更重要的是，抗体的发病机制中的数量的人类疾病包括系统性红斑狼疮（SLE），类风湿性关节炎（RA），副肿瘤综合征，多发性硬化症（MS）和人T-淋巴病毒1型（HTLV-1）有牵连相关性脊髓病/热带痉挛性瘫痪（HAM / TSP）1-9。如何抗体，引起病是一种正在进行的调查，数据表明，抗体和各种细胞内的分子在炎症之间的相互作用，改变细胞的信息传递，细胞凋亡10。它已被证明，MS和HAM / TSP患者产生自身抗体，细胞内的RNA结合蛋白异构核糖核酸蛋白甲1（中hnRNP A1）3，5-7，9，11。最近的数据表明，内神经元和表面抗原的抗体是致病3，5-9，11。因此，一个程序，允许细胞内抗体的研究蛋白质相互作用，将给予很大的洞察疾病的发病机制。
基因通常在培养的原代细胞和细胞系转染，但转染进入细胞的抗体已被阻碍，通过改变抗体的结构或转染效率差12。其它转染方法包括基于阳离子脂质体（由DOTAP / DOPE）和聚乙烯亚胺（PEI）的抗体的转染，这两种抗体转染在10倍的减少相比，控制12。在我们的研究中进行的方法是类似的阳离子脂质介导的方法，并使用的脂质为基础的机制，以形成非共价复合物与抗体通过静电和hydrophobic的相互作用13。我们利用的Ab-DeliverIN试剂，这是能够捕获抗体通过非共价键的静电和疏水相互作用，并提供它们在细胞内的脂质制剂。因此，化学和遗传联轴器交付到活细胞的功能性抗体是没有必要的。此方法使我们能够执行各种抗体跟踪和蛋白定位的实验，以及作为细胞内抗体的分子后果：蛋白质相互作用9分析。
在这个协议中，我们将展示如何为神经元转染抗体快速，重复性好，具有高度的转染效率。作为一个例子，我们将使用抗核糖核蛋白A1和抗IgG抗体。对于容易量化的转染效率，我们使用抗核糖核蛋白A1与ATTO-550-NHS和FITC标记的IgG抗体标记。 Atto550 NHS是一个新的标签与的高分子吸收和量子易领域。激发源和荧光过滤器Atto550是类似的Cy3标记（例如：556 EM 578）。 Atto550此外，具有高的耐光性。 FITC标记的IgG作为对照表明，该方法是多才多艺的，不染依赖。这种方法产生的数据将有助于了解人类疾病的发病机制中可能发挥的作用，细胞内的靶抗原的抗体。
Protocol
1。抗体标记（图1）
- 0.1 M NaHCO3缓冲：
- 8.4克的NaHCO 3
- 29.2克氯化钠
- 1升H 2 O
- 带来的缓冲与此溶液的pH为8.4（10.6克Na 2 CO 3，29.2克NaCl，1升H 2 O）。
- 加入35微升Atto550 NHS到第70微升抗hnRNPA1和500μl的NaHCO 3缓冲液，并在室温下的1小时旋转。长达一小时的旋转后，将混合物注入到一个透析器，并在2升的PBS过夜透析。
- 第二天，将透析Atto550 NHS反hnRNPA1使用的旋转柱（的Amicon Ultra 0.5）集中。
- 已标记的抗hnRNPA1抗体浓缩后Atto550 NHS，纳米压降样品浓度的确定。
2。抗体的转染（图2）
- 种子10 5细胞/孔到500微升Dulbecco的改良的Eagle培养基（DMEM/F12 +10％FBS +1％抗生素），在8孔滑动转染前24小时。细胞融合应该是至少70％。
- 播种后二十四小时，放入微量离心管中加入2微升的Ab-DeliverIN试剂。
- 接下来，添加2微克Atto550 NHS标记反hnRNPA1抗体（0.5微克/微升），以相同的离心管中，并在室温下孵育10-15分钟。
- 在温育时，吸液媒体和394微升新鲜DMEM培养基添加到细胞中。
注意：加入500μlDMEM未触动过的细胞的一室作为一个控制。
- 温育后，添加100μl的DMEM中的抗体混合物，通过移液向上和向下混合，并加至总体积为500微升的细胞在DMEM。
- 更改媒体抗体交货后48小时。
注：重复议定书与FITC标记RIGG作为阳性对照。
3。现场和固定影像，以决定效率
- 图片细胞在48小时使用的Cy3过滤器在荧光显微镜图像转Atto550 NHS标记的抗体。
- 实时成像已经完成后，吸出的媒体和修复细胞。
- 抽吸介质后，将细胞用0.4％多聚甲醛在室温下的15分钟。 4×每次5分钟，用PBS洗涤细胞。然后，装入安装介质细胞的DAPI试剂和修复盖玻片。测量与Axiovision软件的固定细胞的转染效率。如果Axiovision软件是手头没有，根本从您的图片事件计数的手和插件计算结果到3.7。或者，ImageJ软件可用于这些计算。
- 首先，使用“事件”测量的细胞总数在您选择的图像在放大20倍来计算。
- 接下来，请使用“事件”（Events）测量细胞计数不成功转染的抗体在相同的20倍的放大倍率的图像。
- 要访问在Excel风格的格式测得的“事件”，点击“属性”，点击“测量”选项卡，并单击“查看”表“。
- 最后，请使用以下的计算，以确定转染效率，两相比较以前测量的事件：（ - 未转染细胞（细胞总数）/细胞总数）×100 =转染效率。
4。代表性的成果
未转染的实时图像（ 图3A）相比，转染（ 图3B）神经元显示，清楚地观察到细胞内（ 图3B，C，D）的标记的抗体（在每个图中的红色或绿色）。吸入后，与媒体洗涤以除去附着到细胞表面的抗体之间或标记的抗体仍然是存在于神经元（ 图3C，D）。要计算的转染效率，使用本Axiovision软件来计算而无法成功转染的细胞相比，细胞总数。这些值被输入到一个转染效率公式作为细胞总数的百分比（ 图4）中获得的转染效率。
ATTO 550 NHS酯用于标记抗体的程序的流程图如图1所示。其次是集中在标记的抗体需要的步骤。 点击此处查看大图 。
图2。标记抗体进入活细胞的培养，转染的程序流程图。arge.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图3转染的神经细胞转染后48小时的实时图像。
图4。修正和漂洗的图像的事件计数，以确定转染效率。
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Discussion
为了测试假设特定的分子和它们的表达，基因和其他载体转染到细胞中。此过程中的独特的方面是能够容易地转染到靶细胞的抗体。我们进行了这种方法在5个不同的实验中，各一式两份。在所有的实验中，转染效率的结果是相似的。更重要的是，该方法使进入细胞的抗体的条目而不改变抗体的结构或功能。另外，用荧光显微镜的活神经元的使用，我们能够确定，通常超过55％的转染效率。这允许一个测试直接感兴趣的抗体，其细胞内的目标之间的相互作用有关的假设。虽然这里没有研究，Fab片段也可以利用。另外，可以设计实验，研究是否改变培养条件，如增加炎性细胞因子的影响expressi或细胞内的目标定位。
抗体可能针对细胞内的抗原是一个正在进行的调查。盛行的理论表明，细胞损伤后，细胞内抗原暴露的适应性免疫反应，这使得对靶抗原的抗体生产。在SLE患者hnRNPs的抗体反应是如何可能发生的一个例子。 SLE患者使抗体到核蛋白P2和靶细胞的凋亡的影响时，核蛋白P2被输送到细胞表面，它是可用来产生的自体免疫反应14。这也被示出，其中在神经系统疾病的研究表明，对神经元的可能是唯一的表面抗原的致病性自体免疫反应15，16的目标。这个想法是现在面临的挑战。有趣的是，现在有数据表明，抗体可以输入神经元中的表位特异性的方式。例如，在自身免疫性视网膜病变，NTI-烯醇化酶抗体侵入神经 元和改变功能的烯醇化酶，细胞质糖酵解酶17。另外，在一个模型中的僵硬人员综合征，抗amphiphysin抗体输入神经 元在体内共同本地化与突触前的标记物和改变GABA的释放18。这可能会对相关的独特的结构和功能的神经元。像这里提出一个解决这些重要问题，如自身免疫性疾病的发病机制，继续研究和研究更好地理解9。
中hnRNP A1是一种细胞内的抗原5星，9。因此，我们需要一种技术，它将使我们能够测试是否抗核糖核蛋白A1抗体可能有助于神经功能障碍。由于中hnRNP A1抗体被发现在MS和HAM / TSP患者3，5-7，9，11，我们转成神经细胞的抗核糖核蛋白A1和控制抗体。我们证实，抗体进入细胞后，微阵列分析（使用两个对照IgG和原始的神经元作为对照）表明，相关基因中hnRNP A1功能被修改，从而确认，转染并没有改变反的hnRNP A1功能9。更重要的是，进一步的微阵列分析表明反的hnRNP A1的抗体应答与spastin，当突变基因表达的改变之间的关联，，模仿临床表型的MS和HAM / TSP患者9。这表明，抗体的转染可用于检测细胞内的目标的抗体是否可以改变细胞功能。这有一些其他的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，与癌症相关的副肿瘤综合征的实用程序。
总之，能够可靠地转染到活细胞的抗体提供了机会，在正常和疾病的情况下，细胞内的功能抗体，抗体靶标相互作用和本地化的目标提问。/ P>
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的研究与发展，医学研究服务，退伍军人事务部办公室。这项研究是由一个VA优秀评论奖（MCL）大学和田纳西州健康科学中心多发性硬化症研究基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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