Summary
En hurtig fremgangsmåde til undersøgelse af vekselvirkninger og virkningerne på molekylære mekanismer i forbindelse med tilstedeværelsen af antistoffer i et intracellulært miljø, er beskrevet. Fremgangsmåden involverer transfektion af antistoffer i levende celler under anvendelse af et ikke-kovalent kompleksdannelse baseret på en lipidformulering. Teknikken kan tilpasses til udødeliggjorte cellelinier og primære celler.
Abstract
Antistoffer giver mulighed for at få ny indsigt i forskellige arrangementer, der finder sted i levende systemer. Evnen til at producere meget specifikke antistoffer mod målproteiner har givet mulighed for meget præcise biologiske spørgsmål, der skal behandles. Vigtigere, er antistoffer blevet impliceret i patogenesen af en række humane sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multipel sclerose (MS) og human T-lymfotropisk virus type 1 (HTLV-1) associeret myelopati / tropisk spastisk paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hvordan antistoffer forårsage sygdom er et område med igangværende undersøgelse, og data tyder på, at samspillet mellem antistoffer og forskellige intracellulære molekyler resulterer i inflammation, ændres cellulær messaging, og apoptose 10. Det er blevet vist, at patienter med MS og HAM / TSP producerer autoantistoffer til det intracellulære RNA-bindende protein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. De seneste data viser, at antistoffer mod både intra-neuronale og overfladeantigener er patogene 3, 5-9, 11. Således en procedure, der muliggør studiet af intracellulært antistof: ville proteininteraktioner give stor indsigt i sygdommen patogenese.
Gener er almindeligt transficeret ind i primære celler og cellelinier i kultur, har imidlertid transfektion af antistoffer i celler blevet hæmmet af ændring af antistofstrukturen eller dårlig transfektionseffektivitet 12. Andre metoder til transfektion omfatter antistof transfektion baseret på kationiske liposomer (bestående af DOTAP / DOPE) og polyethylenimines (PEI), som begge resulterede i en ti-fold fald i antistof-transfektion sammenlignet med kontroller 12. Fremgangsmåden udføres i vores undersøgelse ligner kationisk lipidmedieret metoder og anvender et lipid-baseret mekanisme til dannelse af ikke-kovalente komplekser med antistoffer via elektrostatiske og hydrophobic interaktioner 13. Vi udnyttede Ab-deliverin reagens, som er en lipidformulering kan indfange antistoffer gennem ikke-covalente elektrostatiske og hydrofobe interaktioner og levere dem i celler. Således kemiske og genetiske koblinger er ikke nødvendige til afgivelse af funktionelle antistoffer i levende celler. Denne metode har gjort det muligt for os at udføre forskellige antistof sporing og protein lokalisering eksperimenter, samt analyser af de molekylære konsekvenser af intracellulært antistof: protein interaktioner 9.
I denne protokol vil vi vise, hvordan at transficere antistoffer til neuroner hurtigt, reproducerbart og med en høj grad af transfektionseffektivitet. Som et eksempel, vil vi bruge anti-hnRNP A1 og anti-IgG-antistoffer. For let kvantificering af transfektionseffektiviteten vi anvendte anti-hnRNP A1 antistoffer mærket med Atto-550-NHS og FITC-mærket IgG. Atto550 NHS er en ny etiket med høj molekylær absorption og kvante yienergimærkningsdirektivet. Excitationskilde og fluorescerende filtre til Atto550 svarer til Cy3 (eksempel 556 Em. 578). Desuden har Atto550 høj fotostabilitet. FITC-mærket IgG blev anvendt som kontrol til at vise, at denne metode er alsidig og ikke farve afhængig. Denne fremgangsmåde og de data, der genereres vil bidrage til forståelse af den rolle, som antistoffer mod intracellulære målantigener kan spille i patogenesen af sygdomme hos mennesker.
Protocol
1. Antistofmærkning (figur 1)
- Gøre 0,1 M NaHCO3-puffer:
- 8,4 g NaHCO3
- 29,2 g NaCI
- 1 liter H2O
- Bring buffer op til en pH-værdi på 8,4 med denne opløsning (10,6 g Na2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 l H 2 0).
- Tilføj 35 pi Atto550 NHS til 70 pi anti-hnRNPA1 og 500 pi NaHCO3-puffer og roter i 1 time ved stuetemperatur. Efter den timelange rotation, injicere blandingen i en dialysator og dialyseres i 2 liter PBS natten over.
- Den næste dag, koncentrere de dialyserede Atto550 NHS anti-hnRNPA1 under anvendelse af en centrifugesøjle (Amicon Ultra 0.5).
- Efter de Atto550 NHS mærket anti-hnRNPA1 antistof er blevet koncentreret, nano-drop prøve for at bestemme koncentrationen.
2. Antistof Transfektion (figur 2)
- Seed 10 5 celler / brønd i 500 pi Dulbecco s modificerede Eagle-medium (DMEM/F12 +10% FBS +1% antibiotikum) i en 8 og slide 24 timer før transfektion. Cellekonfluens bør være mindst 70%.
- Fireogtyve timer efter podning, tilsættes 2 pi af Ab-deliverin reagens i et eppendorfrør.
- Dernæst tilsættes 2 ug Atto550 NHS mærkede anti-hnRNPA1-antistof (0,5 pg / pl) til den samme Eppendorf-rør og inkuberes 10-15 min ved stuetemperatur.
- Under inkubationen aspireres mediet, og der tilsættes 394 pi af frisk DMEM medier til cellerne.
Bemærk: Der tilsættes 500 ul DMEM til det ene kammer af uberørte celler til at fungere som en kontrol.
- Efter inkubationen tilsættes 100 pi DMEM til antistof blandingen, blandes ved pipettering op og ned, og tilsæt til cellerne i DMEM til et samlet volumen på 500 pi.
- Skift mediet efter 48 timers antistof levering.
Bemærk: protokol blev gentaget med FITC-mærket Rigg som positiv kontrol.
3. Live og Fixed Imaging at bestemme Effektivitet
- Billede celler lever ved 48 timer ved hjælp af Cy3 filter på et fluorescensmikroskop til billede transficerede Atto550 NHS mærkede antistoffer.
- Efter billeddannelse er afsluttet, aspireres medierne og fix celler.
- Efter aspirering medier, behandle celler med 0,4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne 4 x 5 min hver med PBS. Derefter monteres celler med montering medier indeholdende DAPI reagens og fix dækglas. Måling af transfektionseffektiviteten af de fikserede celler med AxioVision software. Hvis AxioVision softwaren ikke er ved hånden, skal du blot tælle begivenhederne fra dit billede i hånden og stik resulterer i beregning i 3,7. Alternativt kan ImageJ software anvendes til disse beregninger.
- Først skal du bruge den "Events" måling til at tælle det samlede antal celler i dit billede af valg på 20x forstørrelse.
- Derefter kan du bruge "Events" måling til at tælle de celler, der ikke varmed held transficeret med antistoffer i samme 20x forstørrelse billede.
- Du får adgang til målte "Events" i et Excel-stil format, klik på "Egenskaber", klik på "Måling" fanen, og klik for at se "As Table".
- Endelig kan du bruge følgende beregning at bestemme din transfektionseffektivitet ved at sammenligne de to tidligere målte hændelser: ((samlet celler - utransficerede celler) / total celler) x 100 = transfektionseffektivitet.
4. Repræsentative resultater
De levende billeder af ikke-transficerede (figur 3A) sammenlignet med transficerede (figur 3B) neuroner viser, at mærkning af antistofferne (røde eller grønne i hver figur) klart observeret i celler (figur 3B, C, D). Efter aspiration og vask med medier til fjernelse af antistoffer mellem eller adhærerende til overfladen af celler, mærkede antistoffer er stadig til stede i neuroner (figur 3C, D). At beregne transfektionseffektivitet, bruge AxioVision software til at beregne totale celler sammenlignet med celler, der ikke blev vellykket transficeret. Disse værdier blev indgået en transfektionseffektivitet formel til at erhverve transfektionseffektivitet som en procentdel af totale celler (figur 4).
Figur 1. Blokdiagram af de procedurer, der anvendes til mærkning af antistoffer med Atto 550 NHS-ester efterfulgt af nødvendige skridt for at koncentrere de mærkede antistoffer. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Blokdiagram af de procedurer, der anvendes til transfektion af mærkede antistoffer i levende celler i kultur.arge.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Fig. 3. Levende billeder af de transficerede neuroner 48 timer efter transfektion.
Fig. 4. Fast og skylles billeder med hændelser tælles for at bestemme transfektionseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at teste hypoteser om specifikke molekyler og deres ekspression, er gener og andre vektorer almindeligvis transficeres i celler. Det unikke ved denne procedure er evnen til let at transficere antistoffer i målceller. Vi udførte denne metode i fem separate forsøg hver i dubletter. Transfektionseffektivitet resultater svarede blandt alle eksperimenter. Vigtigt er det, at fremgangsmåden muliggør optagelse af antistoffer i cellen uden at ændre antistof struktur eller funktion. Yderligere, ved anvendelse af fluorescensmikroskopi af levende neuroner, er vi i stand til at bestemme transfektionseffektivitet, som almindeligvis overstiger 55%. Dette gør det muligt at teste hypoteser direkte relateret til samspillet mellem antistoffet af interesse og dens intracellulære mål. Selv om det ikke er undersøgt her, kan Fab-fragmenter også anvendes. Alternativt kan man udvikle at undersøge, om ændring dyrkningsbetingelser såsom at tilføje inflammatoriske cytokiner påvirker expressipå eller lokalisering af intracellulære mål.
Hvordan antistoffer kan målrette intracellulære antigener er en løbende område af undersøgelsen. Fremherskende teori indikerer, at efter cellulær skade, der intracellulære antigener eksponeret for det adaptive immunrespons, som tillader antistofproduktion til målantigenet. Antistofreaktionen på hnRNPs i SLE-patienter er et eksempel på, hvordan denne sandsynligt forekommer. SLE-patienter producerer antistoffer til hnRNP P2 og ved apoptose af målceller, der hnRNP P2 transporteres til celleoverfladen, hvor det er tilgængeligt til at generere en autoimmun respons 14. Dette blev også vist i neurologisk sygdom, i hvilke undersøgelser antydet, at kun overfladeantigener på neuroner kan være mål for et patogent autoimmunrespons 15, 16. Denne idé bliver nu udfordret. Interessant nok er der nu data, der tyder på, at antistoffer kan indtaste neuroner i en epitop specifik måde. For eksempel ved autoimmun retinopati aNTI-enolase antistoffer trængt neuroner og ændrede funktion enolase, et cytoplasmisk glycolytisk enzym 17. Yderligere, i en model af stiv-person syndrom, trådte anti-amphiphysin antistoffer neuroner in vivo, co-lokaliseret med præ-synaptiske markører og ændret GABA release 18. Dette kan være relateret til den unikke struktur og funktion af neuroner. Undersøgelser som den præsenteres her behandle disse vigtige emner, som patogenesen af autoimmune sygdomme fortsat blive undersøgt og forstået bedre 9.
hnRNP A1 er en intracellulær antigen 5, 9. Derfor har vi krævet en teknik, der vil give os mulighed for at afprøve, om anti-hnRNP A1 antistoffer kunne bidrage til neuronal dysfunktion. Fordi autoantistoffer til hnRNP A1 blev fundet i MS og HAM / TSP patienter 3, 5-7, 9, 11, vi transficeret anti-hnRNP A1 og kontrol-antistoffer i neuroner. Vi bekræftede, at antistoffer ind i cellerne og eftermicroarray analyser (ved hjælp af både kontrol-IgG og uberørte neuroner som kontrolgruppe) viste, at gener relateret til hnRNP A1 funktion blev ændret, hvilket bekræfter, at transfektion ændrede ikke anti-hnRNP A1 funktion 9. Vigtigere, yderligere microarray analyser viste en sammenhæng mellem den anti-hnRNP A1 antistofreaktion med ændret ekspression af spastin, et gen, som, når muteret, efterligner den kliniske fænotype af MS og HAM / TSP patienter 9. Dette viser, at antistof transfektion kan anvendes til at teste, om antistoffer mod intracellulære mål kan ændre cellulære funktioner. Dette har anvendelighed til en række andre autoimmune sygdomme, såsom SLE, RA, og cancer-relaterede paraneoplastic syndromes.
Sammenfattende giver mulighed for pålideligt transficere antistoffer i levende celler mulighed for at stille spørgsmål af antistof-funktion, antistof:. Target interaktioner og lokalisering af mål i cellerne under normale og sygdomstilstande </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af Office of Research og udvikling, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs. Denne undersøgelse blev finansieret af en VA Merit anmeldelse Award (til MCL) og University of Tennessee Health Science Center Multipel sklerose Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
