Summary
Un enfoque rápido para investigar las interacciones y efectos en los mecanismos moleculares relacionados con la presencia de anticuerpos en un entorno intracelular se describe. El método implica la transfección de anticuerpos en células vivas utilizando una formación de complejo no covalente basada en una formulación de lípidos. La técnica es adaptable a las líneas celulares inmortalizadas y en células primarias.
Abstract
Los anticuerpos ofrecen la posibilidad de conocer mejor novela en varios eventos que tienen lugar en los sistemas vivos. La capacidad de producir anticuerpos altamente específicos para las proteínas diana ha permitido preguntas biológicas muy precisas que deben abordarse. Es importante destacar que los anticuerpos han sido implicados en la patogénesis de un número de enfermedades humanas, incluyendo el lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), los síndromes paraneoplásicos, esclerosis múltiple (MS) y T-linfotrópico humano tipo virus 1 (HTLV-1) asociado mielopatía / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Cómo anticuerpos causar enfermedad es un área de investigación en curso, y los datos sugiere que las interacciones entre los anticuerpos y los diversos resultados de moléculas intracelulares en la inflamación, alterado celular de mensajería, y la apoptosis 10. Se ha demostrado que los pacientes con MS y HAM / TSP producir anticuerpos contra la proteína de unión intracelular de ARN heterogéneo proteína A ribonucleares1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Datos recientes indican que los anticuerpos para tanto intra-neuronal y antígenos de superficie son patógenas 3, 5-9, 11. Por lo tanto, un procedimiento que permite el estudio de anticuerpo intracelular: interacciones proteína daría una gran comprensión de la patogénesis de enfermedades.
Los genes están comúnmente transfectaron en células primarias y líneas celulares en cultivo, sin embargo transfección de anticuerpos en las células se ha visto obstaculizado por la alteración de la estructura del anticuerpo o la eficiencia de transfección pobre 12. Otros métodos de transfección incluyen la transfección de anticuerpo basada en liposomas catiónicos (que consiste de DOTAP / DOPE) y polietileniminas (PEI), ambos de los cuales resultó en una disminución de diez veces en la transfección de anticuerpos en comparación con los controles 12. El método realizado en nuestro estudio es similar al mediada por lípidos catiónicos métodos y utiliza un mecanismo basado en lípidos para formar complejos no covalentes con los anticuerpos a través de electrostática y hydrinteracciones ophobic 13. Hemos utilizado Ab-DeliverIN reactivo, que es una formulación lipídica capaz de capturar anticuerpos a través de interacciones no covalentes electrostáticas e hidrófobas y su entrega dentro de las células. Así química y genética acoplamientos no son necesarios para la entrega de anticuerpos funcionales en las células vivas. Este método nos ha permitido realizar anticuerpo diversos experimentos de rastreo y localización de las proteínas, así como los análisis de las consecuencias moleculares de anticuerpo intracelular interacciones proteína: 9.
En este protocolo, vamos a mostrar cómo transfectar anticuerpos en neuronas rápido, reproducible y con un alto grado de eficiencia de transfección. Como ejemplo, vamos a usar anti-anticuerpos hnRNP A1 y anti-IgG. Para la cuantificación fácil de eficiencia de transfección se utilizó anti-anticuerpos hnRNP A1 marcados con Atto-550-NHS y marcado con FITC IgG. Atto550 NHS es una nueva etiqueta con alta absorción molecular y yi cuánticaeld. Fuente de excitación y filtros fluorescentes para Atto550 son similares a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Además, Atto550 tiene alta fotoestabilidad. Marcado con FITC IgG se utilizaron como control para demostrar que este método es muy versátil y no teñir dependiente. Este enfoque y los datos que se generan ayudará en la comprensión de la función que los anticuerpos a antígenos diana intracelulares podría desempeñar en la patogénesis de las enfermedades humanas.
Protocol
1. Anticuerpo Etiquetado (Figura 1)
- Hacer NaHCO3 0,1 M buffer:
- 8,4 g de NaHCO 3
- 29,2 g de NaCl
- 1 litro de H2O
- Llevar el tampón hasta un pH de 8,4 con esta solución (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro H 2 0).
- Añadir 35 Atto550 NHS mu l a 70 l anti-hnRNPA1 y 500 l NaHCO 3 tampón y girar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la rotación de una hora de duración, inyectar la mezcla en un dializador y dializar 2 litros de PBS durante la noche.
- El día siguiente, se concentran los dializados Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizando una columna de centrifugación (Amicon Ultra 0,5).
- Después de que los Atto550 NHS marcado anti-hnRNPA1 anticuerpo se ha concentrado, nano-gota de muestra para determinar la concentración.
2. Anticuerpo transfección (Figura 2)
- Seed 10 5 células / pocillo en 500 l de Dulbecco Medio de Eagle Modificado (DMEM/F12 +10% FBS 1% de antibiótico) en una corredera 8 y 24 horas antes de la transfección. Confluencia celular debe ser de al menos 70%.
- Veinticuatro horas después de la siembra, añadir 2 l de Ab-DeliverIN reactivo en un tubo Eppendorf.
- A continuación, añadir 2 g de Atto550 NHS etiquetados anti-hnRNPA1 de anticuerpos (0,5 mg / l) para el mismo tubo de Eppendorf y se incuban 10-15 min a TA.
- Durante la incubación, aspirar los medios y añadir 394 l de medio DMEM fresco a las células.
Nota: Añadir 500 l DMEM a una cámara de células intactas para actuar como un control.
- Después de la incubación, añadir 100 ml de DMEM a la mezcla de anticuerpo, mezclar pipeteando arriba y abajo, y añadir a las células en DMEM para un volumen total de 500 l.
- Cambie los medios de comunicación después de 48 horas de la entrega de anticuerpos.
Nota: El Protocolo se repitió con FITC Rigg como control positivo.
3. Imágenes en directo y fijo para determinar la eficiencia
- Células de imagen en vivo a las 48 horas con la Cy3 filtro en un microscopio de fluorescencia a la imagen de las transfectadas Atto550 NHS anticuerpos marcados.
- Después de obtención de imágenes en vivo se ha completado, la aspiración de los medios y las células fijas.
- Después de los medios de aspiración, el tratamiento de células con 0,4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar las células 4 x 5 min cada uno con PBS. A continuación, montar las células con medio de montaje que contiene el reactivo y el cubreobjetos solución DAPI. Medir la eficiencia de transfección de las células fijadas con Axiovision software. Si Axiovision software no está a la mano, simplemente contar los acontecimientos de su imagen por los resultados de la mano y se conectan a calcular en 3,7. Alternativamente, el software ImageJ puede ser utilizado para estos cálculos.
- En primer lugar, utilice la "Eventos" de medición para contar el número total de células en su imagen de elección de 20 aumentos.
- A continuación, utilice el "Eventos" de medición para contar las células que no erantransfectadas con éxito con los anticuerpos de la imagen misma magnificación de 20x.
- Para acceder a las medidas "Eventos" en un formato de estilo de Excel, haga clic en "Propiedades", haga clic en la "medición" ficha y haga clic para ver "Como muestra la tabla."
- Por último, utilice el siguiente cálculo para determinar la eficacia de transfección mediante la comparación de los dos eventos previamente medidos: ((células totales - las células no transfectadas) / células totales) x 100 = eficiencia de transfección.
4. Los resultados representativos
Las imágenes en vivo de no transfectadas (Figura 3A) en comparación con transfectadas (Figura 3B), las neuronas revelan que el etiquetado de los anticuerpos (rojo o verde en cada figura) se observa claramente dentro de las células (Figura 3B, C, D). Después de la aspiración y el lavado con medios para eliminar los anticuerpos entre o adherentes a la superficie de las células, anticuerpos marcados todavía están presentes dentro de las neuronas (Figura 3C, D). Para calcular la eficiencia de la transfección, el uso del software Axiovision para calcular el total de células en comparación con células que no fueron transfectadas con éxito. Estos valores se introdujeron en una fórmula de la eficiencia de transfección para adquirir la eficiencia de transfección como un porcentaje del total de células (Figura 4).
Figura 1. Diagrama de flujo de los procedimientos utilizados para marcar anticuerpos con la Atto 550 NHS ester seguido los pasos necesarios para concentrar los anticuerpos marcados. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Diagrama de flujo de los procedimientos utilizados para transfectar anticuerpos marcados en células vivas en cultivo.arge.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 3. Las imágenes en directo de las neuronas transfectadas 48 h de transfección siguiente.
Figura 4. Fija y se enjuagó con imágenes de eventos de contarse para determinar la eficiencia de transfección.
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Discussion
Con el fin de probar las hipótesis sobre moléculas específicas y de su expresión, genes y otros vectores son comúnmente transfectadas en células. El aspecto único de este procedimiento es la capacidad para transfectar fácilmente anticuerpos en las células diana. Se realizó este procedimiento en cinco experimentos separados, cada uno por duplicado. Resultados de transfección de eficiencia fue similar entre todos los experimentos. Es importante destacar que el método permite la entrada de anticuerpos en la célula, sin alterar la estructura del anticuerpo o de la función. Además, con el uso de microscopía de fluorescencia de neuronas vivas, que son capaces de determinar la eficiencia de transfección, que comúnmente excede 55%. Esto permite probar las hipótesis relacionadas directamente con la interacción entre el anticuerpo de interés y su diana intracelular. Aunque no se ha estudiado aquí, los fragmentos Fab también se pueden utilizar. Alternativamente, se pueden diseñar experimentos que examinan si la alteración de las condiciones de cultivo, tales como la adición de citoquinas inflamatorias afecta Expressien o localización de dianas intracelulares.
Cómo anticuerpos podría dirigir antígenos intracelulares es un área en curso de investigación. La teoría actual indica que después de la lesión celular, antígenos intracelulares son expuestos a la respuesta inmune adaptativa, que permite la producción de anticuerpo al antígeno diana. La respuesta de anticuerpos a hnRNPs en pacientes con LES es un ejemplo de cómo esto probablemente se produce. Los pacientes con LES producen anticuerpos para hnRNP P2 y sobre la apoptosis de las células diana, P2 hnRNP se transporta a la superficie celular donde está disponible para generar una respuesta autoinmune 14. Esto se muestra también en la enfermedad neurológica, en la que los estudios sugirieron que los antígenos de superficie solamente en las neuronas podría ser el objetivo de una respuesta autoinmune patógena 15, 16. Esta idea está siendo desafiado. Curiosamente, ahora hay datos que sugieren que los anticuerpos pueden entrar en las neuronas de una manera específica de epítopo. Por ejemplo, en la retinopatía autoinmune, unanti-enolasa anticuerpos penetrado las neuronas y altera la función de la enolasa, una enzima citoplasmática glucolítica 17. Además, en un modelo de síndrome de la persona rígida, anticuerpos anti-anfifisina entró neuronas in vivo, co-localizado con pre-sinápticos marcadores y alteración de la liberación de GABA 18. Esto podría estar relacionado con la estructura única y la función de las neuronas. Estudios como el que aquí se presenta frente a estas cuestiones importantes, como la patogénesis de la enfermedad autoinmune se siguen estudiando y mejor entendido 9.
hnRNP A1 es un antígeno intracelular 5, 9. Por lo tanto, se requiere una técnica que nos permita comprobar si los anticuerpos anti-hnRNP A1 pueden contribuir a la disfunción neuronal. Debido a que los anticuerpos contra hnRNP A1 se encontraron en pacientes con EM y HAM / TSP 3, 5-7, 9, 11, transfectadas anti-anticuerpos hnRNP A1 y de control en neuronas. Se confirmó que los anticuerpos entró en las células y siguiendoanálisis de microarrays (usando tanto el control de IgG y las neuronas intactas como controles) mostraron que los genes relacionados con la función de hnRNP A1 se altera, lo que confirma que la transfección no alteró la función anti-hnRNP A1 9. Es importante destacar que los análisis adicionales de microarrays mostraron una asociación entre la respuesta de anticuerpos anti-hnRNP A1 con la expresión alterada de espastina, un gen que cuando muta, imita el fenotipo clínico de los pacientes con EM y HAM / TSP 9. Esto muestra que la transfección de anticuerpo puede ser utilizado para probar si los anticuerpos contra dianas intracelulares puede alterar las funciones celulares. Esto tiene utilidad con un número de otras enfermedades autoinmunes tales como SLE, RA, y los síndromes paraneoplásicos relacionados con el cáncer.
En resumen, la capacidad para transfectar fiable anticuerpos a células vivas ofrece la oportunidad de hacer preguntas a la función del anticuerpo, anticuerpo:. Interacciones diana y localización de objetivos dentro de las células bajo condiciones normales y de enfermedad </ P>
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación y Desarrollo, Médico del Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos. Este estudio fue financiado por una concesión de mérito revisión VA (a MCL) y la Universidad de Tennessee Health Science Center Fondo Multiple Sclerosis Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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