Summary
Dopamine is duidelijk geregeld in de middenhersenen kernen, die de cellichamen en dendrieten van de dopamine neuronen bevatten. Hier beschrijven we een dissectie en sample-handling aanpak om de resultaten te maximaliseren, en dus conclusies en inzichten, op dopamine regelgeving in de middenhersenen kernen van de substantia nigra (SN) en ventrale tegmentale gebied (VTA) bij knaagdieren.
Abstract
Dopamine een krachtig onderzocht neurotransmitter in het CNS. Inderdaad, heeft zijn betrokkenheid bij de bewegingsactiviteit en beloning gerelateerd gedrag bevorderd vijf decennia van onderzoek naar de moleculaire tekortkomingen in verband met dopamine regelgeving. Het merendeel van deze onderzoeken van dopamine regelgeving in de hersenen focus op de moleculaire basis voor de regulering in de terminal gebied regio's van de nigrostriatale en mesoaccumbens paden, striatum en de nucleus accumbens. Bovendien hebben deze studies gericht op de analyse van dopamine weefsel inhoud met normalisatie alleen nat weefsel gewicht. Onderzoek van de eiwitten die regelen dopamine, zoals tyrosine hydroxylase (TH) eiwit, TH fosforylering, dopamine transporter (DAT), en vesiculaire monoamine transporter 2 (VMAT2) eiwit vaak niet een analyse omvatten van dopamine weefsel inhoud in hetzelfde monster. De mogelijkheid om zowel dopamine weefsel inhoud en het regelen van eiwitten (waaronder post-tra te analyserennslational wijzigingen) geeft niet alleen inherente kracht om het interpreteren van de relatie van dopamine met het eiwit-niveau en de functie van TH, DAT, of VMAT2, maar strekt zich ook uit monster economie. Dit vertaalt zich in lagere kosten, en toch levert inzichten in de moleculaire regulatie van dopamine in vrijwel elke paradigma van de onderzoekers 'keuze.
We richten ons de analyses in de middenhersenen. Hoewel de SN en VTA worden meestal genegeerd in de meeste studies van dopamine regelgeving, worden deze kernen gemakkelijk ontleed met de praktijk. Een uitgebreide uitlezing van dopamine weefsel inhoud en TH, DAT, of VMAT2 kunnen worden uitgevoerd. Er is snel groeiende literatuur over de invloed van dopamine functie in de SN en VTA op het gedrag en de impingements van exogene stoffen of ziekte processen die in 1-5. Bovendien, verbindingen zoals groeifactoren hebben een diepgaand effect op dopamine en dopamine-regulerende eiwitten, met een relatief grotere mate in de SN of VTA Wij illustreren de ontleding techniek om deze twee kernen en het monster verwerking van ontleed weefsel dat een profiel waaruit moleculaire mechanismen van dopamine regeling in vivo, specifiek voor elk kernen (figuur 1) levert scheiden.
Protocol
1. Ontleding
- Op een bedje van nat-ijs, chillen een knaagdier hersenen matrix (coronale secties gescheiden 1 mm van elkaar), een petrischaal met 5 scheermesjes, en een # 11 scalpel. In een aparte container, plaats 2 ml grootte microfugebuisje buizen label in droog ijs.
- De onderzoeker zal kiezen voor de methode van euthanasie. Wij hebben reproduceerbare resultaten uitvoeren van een zeer korte verdoving met isofluraan, ideale een verdamper worden gebruikt. Echter, indien niet beschikbaar, gebruiken we een grote accu pot met daarin een platform. Met de batterij pot gelegen in een goedgekeurde ventilatie kap, het plaatsen van een isofluraan-verzadigde gaasje onder het platform en wacht 3-5 minuten, zodat de isofluraan om de batterij te pot te verzadigen. Plaats de rat binnen en verwijderen voor onthoofding, zodra de rat heeft het bewustzijn verloren. Snel verwijderen van de hersenen (het liefst in minder dan twee minuten), spoel onder koud water en plaats direct in de gekoelde knaagdieren hersenen matrix.
- Een minuut nadat positieIng de hersenen in de matrix, plaats koude scheermesjes in de gekoelde hersenen begin ca. 2 mm rostraal het optisch chiasma als striatum en de kern accumbens gewenst voor analyse naast de middenhersenen kernen. Ga door het invoegen van koude scheermesjes met elk 1 mm sectie, totdat aankomen halverwege de pons, een spreiding van de plaatsing van elke volgende scheermesje om zo gemakkelijker het verwijderen van elk individueel blad te vergemakkelijken.
- Bij het uittrekken van de scheermessen, kijk voor de start van de hippocampus. Bij het volledig is rond de middenhersenen, beginnen profielen met de nr. 11 scalpel nemen zoals weergegeven in figuur 2.
- Onmiddellijk Plaats de ontleed weefsel in de pre-gekoelde microfugebuis op het droge ijs. In de rat, verwachten te kunnen SN en VTA ontleden van een minimum van twee coronale plakken en een maximum van drie. Winkel weefsels bij -80 ° C tot gereed voor verwerking.
2. Tissue Analyse: HPLC fof Dopamine en metabolieten
Voor volledige informatie over de HPLC-apparatuur en het onderhoud vindt u in HPLC-analyse aan het eind van het manuscript.
- Voorzichtig homogeniseren weefsel direct na verwijdering van droogijs met ijskoude 0,1 M HClO 4-oplossing (0,1 M HClO 4 en 0,1 mM EDTA) 9 die N-methyl dopamine bevat in een concentratie van 20 ng / ml die als interne standaard voor herstel van monster tijdens de HPLC analyse. De homogenisator die we gebruiken is een Branson Sonifier 150, met de instelling op 10% van de volle kracht (1 van 10). De volgende sonicatie volumes worden aanbevolen:
In ratten, SN = 250 ul (eenzijdige dissectie), 400 pl (bilaterale dissectie), VTA = 200 ul (eenzijdige dissectie), 400 pl (bilaterale dissectie).
In muis, (bilaterale dissecties only), SN = 200 ui, VTA = 200 pi. - Na homogenisering, houdt monsters op droog ijs. Monsters worden vervolgens CENTRIFuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) bij 12.000 omwentelingen per minuut sediment het eiwit pellet wordt gebruikt voor western blot bepalingen. De supernatant direct in de HPLC. De volgende injectie volumes worden aanbevolen voor nauwkeurige analyse in de rat of muis: (. Van beide prep) SN = 150 (. Van beide prep), VTA = 160 pl
- Voorraadoplossing bereid bij 1 mg / ml door toevoeging van de juiste hoeveelheid van monoaminen en metabolieten * dopamine component 0,1 M perchloorzuur 0,1 mM EDTA. De concentratie van elke verbinding 1 mg / ml behalve tryptofaan 5 mg / ml. Voorraadoplossing is verdeeld in 10 pi fracties en opgeslagen in de ultra tot nodig.
* Alle gewichten gecorrigeerd voor de zoutvorm van de verbinding indien van toepassing.
Bereid de werkstandaard door verdunnen van een 10 pi monster van stock standaardoplossing 100 ml perchloorzuuroplossing. Concentratie van de standaard 0,1 ug / ml behalve tryptofaan 0,5 ug / ml. 50 pideze standaard wordt geïnjecteerd in de HPLC voor een on-kolom hoeveelheid van 5 ng van elk bestanddeel met uitzondering tryptofaan 25 ng. - Bepaling van de dopamine herstel binnen sample hoeveelheid:
Er zijn verschillende stappen voor de dopamine herstel van een monster hoeveelheid bepalen. - Ten eerste, deelt u de dopamine piekhoogte van het monster door de dopamine piekhoogte van de standaard en vermenigvuldig deze verhouding met het totale bedrag (ng) van dopamine in de standaard. De standaard dopamine concentratie 0,1 ng / ul en 50 ul standaard getest. Aldus is de hoeveelheid dopamine in de standaard 5 ng. Zo kan de onderstaande vergelijking gebruikt worden bepaald dopamine herstel in een monster:
(Dopamine piekhoogte in monster / dopamine piekhoogte in de standaard) * 5 ng - Corrigeren voor het verlies van het monster met behulp van de interne standaard N-methyl-dopamine:
De werkelijke herstel van N-methyl dopamine berekend op dezelfde wijze als dopamine wordt door het N-methyl dopamine piekhoogte in het monster door de N-methyl dopamine piekhoogte van het standaard vermenigvuldigen verhouding met de totale hoeveelheid (ng) N-methyl dopamine in de standaard. Zoals dopamine, de standaard N-methyl dopamine concentratie 0,1 ng / ul. 50 ul van de standaard wordt bepaald. Aldus is de hoeveelheid N-methyl dopamine in de standaard 5 ng. Zo kan de onderstaande vergelijking gebruikt om N-methyl dopamine herstel bepalen in een monster:
(N-methyl dopamine piekhoogte van het monster / N-methyl dopamine piekhoogte in standaard) * 5ng
Omdat de N-methyl dopamine in elk monster afkomstig uit het monster niet maar uit het HPLC buffer, wordt de hoeveelheid N-methyl dopamine verwacht in elk monster bepaald. De N-methyl dopamine concentratie in HPLC buffer 20 ng / ml of 0,02 ng / pl, zodat de verwachte hoeveelheid N-methyl dopamine in elk monster wordt gevonden door het N-methyl dopamine concentratie van de HPLC buffer met de hoeveelheid volume elk monster voor HPLC analyse. Dit blijkt uit de onderstaande vergelijking:
(0,02 ng / pl) * (hoeveelheid monstervolume voor HPLC-analyse) - Het verschil tussen de verwachte en teruggewonnen N-methyl dopamine kan dan worden gebruikt om de correctie van de hoeveelheid dopamine teruggewonnen door aanpassing voor monster verloren. Gewoon de verhouding van de verwachte N-methyl dopamine / teruggewonnen N-methyl dopamine en vermenigvuldig dit door de hoeveelheid dopamine teruggewonnen. Aldus is de totale vergelijking voor de hoeveelheid dopamine in een monster hoeveelheid hieronder:
(Dopamine piekhoogte van het monster / dopamine piekhoogte in standaard) * (N-methyl dopamine piekhoogte in standaard / N-methyl dopamine piekhoogte van het monster) * (0,02 ng / pl) * (hoeveelheid monstervolume voor HPLC-analyse ) - Totaal dopamine hersteld van een steekproef:
De waarde van dopamine teruggewonnen uit een monster monster wordt vervolgens gebruikt om de totale hoeveelheid dopamine extrapoleren in een monster. Dit wordt gedaan door deling van het teruggevorderde bedrag (ng) of DA de hoeveelheid volume vermenigvuldigen waarde van het totale volume van HPLC buffer die het monster werd gesoniceerd inch Dit wordt gegeven door de volgende vergelijking:
(Bedrag (ng) van dopamine in de steekproef van hoeveelheid / volume van het monster hoeveelheid) * (totale volume van de HPLC-buffer waarin monster werd gesoniceerd).
De lezer wordt naar de volgende studies 2,4,10 een uitgebreide beschrijving van de beoordeling van dopamine en metabolieten in combinatie met uitlezingen van dopamine-regulerende eiwitten niet alleen SN en VTA maar striatum en de kern accumbens ook.
3. Tissue Analyse: Total Protein en Final Normalisatie van TH en DAT resultaten
- Plaats de neergeslagen eiwitten pellets (afgeleid van de HPLC buffer behandeling) in het natte ijs tot 4 ° C te behouden Zorg ervoor dat alle buffer is verwijderd en gearchiveerd (als bevestigende analyse is vereist). Als de SN of VTA is om bilateraal worden verwerkt (rat alleen), voeg 300 ul (SN) of 200 pi (VTA) 1% SDS met 5 mM Tris (pH 8,3) en 1 mM EDTA van de pellet en ultrasone trillingen. Voeg 150 ul van de SDS oplossing voor SN pellets of 100 ul tot VTA pellets als het verwerken van weefsel van eenzijdige dissecties.
- Plaats de monsters in de buurt van kokend water ~ 5 minuten eiwitdenaturatie te voltooien en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Zorg ervoor dat caps zijn veilig ondergebracht bij deze stap.
- Bepaal eiwitconcentratie in de monsters met de BCA-assay, zoals een eiwit standaardcurve (albumine standaard) bereik van 2 - 40 ug eiwit. Assay 5 pi volume van het monster in drievoud en gebruik maken van de mediane waarde van eiwitten hoeveelheid ten opzichte van de standaard curve te bepalen. Delen door de test volume eiwitconcentratie. Let op dit is de eerste van twee stappen gezet voor het normaliseren van het totaal TH, DAT, en VMAT2 resultaten aan totaal eiwit herstel.
- Bereid de monsters met monster buffer (die dithiothreitol) voor reducerende SDS-elektroforese van 10% acrylamide gels. Idealiter wordt de uiteindelijke totale eiwitconcentratie zijn ~ 2 pg / pl. De reden voor deze concentratie selectie is het monstervolume nodig zijn voor de uiteindelijke bepaling van TH fosforylatie verminderen, ~ 100 ug totaal eiwit nodig voor het laden precies te bepalen ser31 en ser40 TH fosforylering. Als gele kleur is te zien in monster na toevoeging van monster buffer, het monster is te zuur. Voeg 1 M Tris (pH 8,2) in 10 pi stappen tot blauwe kleur wordt hersteld.
- Bereid de monsters Voor de volgende bepalingen van dopamine-regulerende eiwitten:
- TH: Tegen een gekalibreerde standaard TH eiwit (ng) de concentratie van TH (per ng TH per totaal ug eiwit) in de SN verwachting variëren van ~ 0.05-0.27 ng TH per pg totaal eiwit 2,4, 7,10,11. Tegen een lineaire TH standaardcurve, variërend 0,5 tot 5,0 ng TH en het gebruik van primaire antilichaam tegen TH (Millipore kat # AB152, 1:1000 verdunning in PVP T-20 Blokkering oplossing) een lineaire standaardcurve voortgebracht, dienen de optimale belasting van totaal eiwit van de SN zijn ~ 10 pg. De concentratie van TH in de VTA varieert van ~ 0.4 1.0 ng TH per pg eiwit 4,11. Daarom moet totaal eiwit belasting VTA zijn ~ 5 pg.
- DAT: De relatieve hoeveelheden van DAT in SN of VTA aanzienlijk minder dan in de verwante terminal gebied gebieden striatum en de kern accumbens 4. De relatieve expressie van DAT als genormaliseerd om teruggekregen TH eiwit is ook beduidend lager in SN en VTA. Daarom eiwit belasting voor het kwantificeren van DAT-eiwit in SN of VTA moet veel groter zijn in vergelijking met monster belasting van de terminal veld regio's. Een minimum van 30 ug totaal eiwit nodig is voor precisie DAT beoordeling VTA en een nominale belasting van 50 ug totaal eiwit dat voor beoordeling in de SN. De gebruikte primaire antilichaam is van Santa Cruz, kat # SC-1433.
- VMAT2: De expressie van VMAT2, Als genormaliseerde het totale eiwit, meer in het mesoaccumbens dan nigrostriatale gebieden. Echter, ten opzichte van TH expressie, VMAT2 expressie is het grootst in SN en het minst in het striatum 4. Met behulp van Santa Cruz kat # sc-15314, een nominale belasting van totaal eiwit ~ 40 ug de beste te zijn voor de kwantificering van VMAT2.
- Start de juiste hoeveelheid totaal eiwit met SDS-PAGE op 10% acrylamidegelen. De Bio-Rad Protean II elektroforese-eenheid wordt gebruikt voor de bepaling, een groot formaat gel. Breng de eiwitten op 0,45 urn poriegrootte nitrocellulose. Voor de overdracht, een Hoeffer tank ingesteld op ten minste 27 Volt kan de overdracht plaats te vinden 's nachts.
- Laat de blots drogen ten minste 30 minuten en daarna met een oplossing Ponceau S (1% Ponceau S in 5% ijsazijn) voor ~ 5 minuten vlek. Krachtig De-vlek met 0,2% HCl-oplossing totdat de individuele eiwitbanden duidelijk op te lossen en achtergrondkleuring wordt verwijderd. Zorg voor een afbeelding van de Ponceau S vlekING met Image J verder ten opzichte van eiwit belastingen te kwantificeren in elke baan en TH, DAT, of VMAT2 resultaten (Figuur 3) te normaliseren.
4. Tissue Analyse: Site-specifieke TH Fosforylatie
De fosforylering van TH op ser31 of ser40 kunnen verhogen L-DOPA biosynthese in catecholaminerge cellen 12. Hoewel de hoeveelheid van fosforylatie op elke locatie nodig is om L-DOPA biosynthese toename van dopaminerge gebieden van de hersenen, zoals SN en VTA is niet vastgesteld, zijn er aanwijzingen dat ser31 fosforylatie een belangrijke rol in het reguleren van L-DOPA biosynthese 10 en co-varieert met DA speelt weefsel inhoud onder het striatum, nucleus accumbens, SN en VTA 2, 10. Toch, het opnemen van ser40 bepalingen zijn noodzakelijk omdat een groot aantal studies laten zien dat het kan TH activiteit beïnvloeden, met name als een drempel van fosforylering wordt bereikt 12.
Terwijl ser19 phosphorylatiop niet TH activiteit alleen invloed 13,14 kan worden beschouwd als een sentinel voor Ca2 +-afhankelijke signalering in de DA neuron aangezien extracellulaire Ca2 + moet ser19 fosforylatie verhogen onder omstandigheden depolariserende 12. Verder is er een significante positieve correlatie van ser19 fosforylering met ser31 fosforylering alleen in de SN en VTA 10, wat aangeeft dat ser19 fosforylatiestatus kon ser31 fosforylatie beïnvloeden, en dus indirect L-DOPA biosynthese.
Voorbeeld belasting overwegingen voor een optimale kwantificering van site-specifieke TH fosforylering stoichiometrie: Hieronder wordt de aanpassingen die nodig zijn voor een nauwkeurige en precieze bepalingen van site-specifieke TH fosforylatie in ontleed weefsels gepresenteerd. Indien mogelijk, moet een geijkte TH fosforylering standaard worden opgenomen in de beoordeling van het monster TH fosforylering. Het monster belasting moet rekening worden volgensount inherent stoichiometrie in elke fosforylatie zodat assay kwantificeert fosforylatie binnen het dynamische bereik van het antilichaam wordt gebruikt. Als laatste opmerking moet de inherente totale hoeveelheid eiwit komt in de test voor elk monster ook worden geplaatst in de standaardcurve rijstroken. Dit wordt gemakkelijk bereikt met een dragereiwit (zoals rattenlever) die niet tot expressie TH.
- . ser19 Van de drie fosforylatie sites, ser19 fosforylering stoichiometrie niveaus zijn het grootst in SN en VTA, variërend 0,15 tot 0,25 2,10,11. De andere overweging is dat door onze detectiemethode, ser19 ps wordt gekwantificeerd in lineaire bereik tussen 0,5 en 5,0 ng fosfo-ser19 10. Gezien deze overwegingen totaal eiwit TH belasting tussen 5 en 10 ng (waardoor schatting 0,75 tot 2,5 ng fosfo-ser19 van het monster) zou een betrouwbare maat ser19 TH fosforylatie voorzien. We gebruiken Phosphosolutions primaire (Cat. # P1580-19) op 1:1000 verdunning.
- . ser31 ser31 fosforylering stoichiometrie niveaus zijn relatief minder in SN en VTA in vergelijking met hun verwante terminal gebied de regio's, variërend van ~ 0,04 tot 0,10 2,4,10,11. Door onze detectiemethode, wordt ser31 ps gedetecteerd in lineaire bereik tussen 0,5 en 7,0 ng fosfo-ser31 10. Gezien deze overwegingen totaal eiwit TH belasting tussen 10 en 30 ng (waardoor schatting 0,50 tot 3,0 ng fosfo-ser31 van het monster) zou een betrouwbare maat voor ser31TH fosforylering. Zie figuur 4A voor een voorbeeld van ser31 kwantificering. Onze primaire antilichaam is een in-house affiniteit-gezuiverd antilichaam dat is vervaardigd door 21 ste eeuw Biochemicals, (Boston, MA), en gevalideerd voor de specificiteit van de fosfo-epitoop gebruik van onze in-house normen 2.
- ser40 ser40 fosforylering stoichiometrie niveaus in SN en VTA variëren van ~ 0,02 -. 0,06 2,4,10,11. Door onze detectiemethode, ser40 ps wordt gedetecteerd lineaire bereik tussen 0,2 en 2,0 ng fosfo-ser40 10. Gezien deze overwegingen totaal eiwit TH belasting tussen 10 en 30 ng (waardoor schatting 0,20 tot 1,8 ng fosfo-ser40 van het monster) zou een betrouwbare maat voor ser40TH fosforylering. Zie figuur 4B voor een voorbeeld van ser40 kwantificering. We gebruiken Phosphosolutions primaire (Cat. # P1580-40) op 1:1000 verdunning.
5. Representatieve resultaten
- Dopamine in SN vs VTA Er zijn drie metingen van dopamine (of metabolieten) die kunnen worden genomen in de kwantitatieve analyse;. Als per totaal hersteld van dissectie, per eiwit, en per TH-eiwit (dit is aangetoond voor het striatum, SN, nucleus accumbens, en VTA in tabel 1). Totaal dopamine herstel tussen SN en VTA is redelijk vergelijkbaar, variërend van 6-9 ng voor twee tot drie coronale plak dissecties 2. Normaliseren dopamine herstel naar totaal eiwit zal that, gebaseerd op de ontleding methode, dat de VTA een grotere dopamine per totaal eiwit hebben gemiddeld 6-8 ng / mg eiwit in SN en 9-10 ng / mg eiwit in VTA 2, 4. Ten slotte moet de normalisatie van dopamine om teruggekregen totaal TH blijkt ook een verschil tussen SN en VTA, groter is in de VTA 10, en variërend tussen 0,2 en 0,8 ng dopamine per ng TH-eiwit tussen de twee regio's 2,10.
DA regio Totaal DA hersteld DA per mg proteïne DA per ng TH striatum 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Nucleus accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Totaal aantal eiwitten: TH, DAT, VMAT2 Met behulp van de geijkte TH eiwit standaard voor kwantificering, wordt er meer TH teruggevonden in SN dan de VTA van de dissectie (60 ng in SN en 26 ng in VTA 2). Wanneer echter genormaliseerd eiwit deze relatie omgekeerd met TH per totaal eiwit in de VTA wordt ~ 3 - 5-keer hoger dan in de SN, (~ 0,32 ng / ug eiwit in VTA en ~ 0,09 in SN) 4, 10.
Het verwachte herstel van DAT in SN en VTA is vergelijkbaar, met iets meer herstel in de VTA per totale hoeveelheid eiwit of per totaal TH hersteld 4. Met name DAT eiwit is veel minder overvloedig in deze regio's in vergelijking met de verwante terminal gebied van de regio's 4 VMAT2 herstel als per totaal eiwit is groter in de VTA versus SN 4. Wanneer echter genormaliseerd TH eiwit is iets groter herstel van de SN 4. - Plaatsspecifieke TH fosforylatie Van een aantal studies zijn er constante resultaten ser19, ser31 en ser40 fosforylatie hoeveelheid in de SN en VTA, en ook met betrekking tot de verwante terminal veld gebieden. Ser19 fosforylering is met name groter in de SN en VTA (~ 0,2 tot 0.3) in vergelijking met striatum en de nucleus accumbens (~ 0.05 tot +0.15) 2,4,7,10,11. Ser31 fosforylering is significant minder in de SN en VTA in vergelijking met hun verwante terminal gebied de regio's, die ~ 0,06 tot 0,10 tussen deze regio's somatodendritisch 2,4,7,10,11. Tijdens de remming van de aromatische zuren decarboxylase met NSD-1015, is er een 2-voudige toename in ser31 fosforylatie in de VTA slechts 10. Ser40 fosforylatie varieert tussen 0,02 en 0,05 in de SN enVTA en meestal is deze stoichiometrie niet significant afwijken van de verwante terminal veld regio's 2,4,7,10,11.
Figuur 1. Dopaminergic uitlezingen van een weefsel dissectie.
Figuur 2. Dissection Techniek voor het isoleren van de middenhersenen dopaminerge neuropil. Techniek voor het ontleden van de substantia nigra (SN) van ventrale tegmentale gebied (VTA). 1. Verwijder de bovenliggende cortex en de hippocampus (deze structuren zijn al verwijderd in de bovenstaande afbeelding). 2. Maak een verticale snede om de gepigmenteerde gebied van het CBS van de VTA. 3. Een horizontale doorsnede op of nabij de middellijn boven de rug en laterale grootste deel van de SN. 4. Plaag van de SN weg van de rest van de hersenstam. Na SN is verwijderd, eveneens plagen de VTA afstand van derest van de middenhersenen. Opmerking: deze sectie wordt meestal waargenomen op de coördinaten, in verhouding tot bregma, bij AP 5.7.
Figuur 3. Tweede (en laatste) normalisering van het totaal eiwitkleuring load-Ponceau S voor Image J analyse. Ponceau S eiwitkleuring op een totaal TH bepaling in de rat substantia nigra monsters. De eerste vijf banen vormen de linker worden de standaard totale TH curve, waarin 28 ug eiwit uit rattenlever homogenaat werd toegevoegd aan het eiwit belasting van de grijze stof monsters weerspiegelen. De volgende baan bevat moleculair gewicht (MW) markers. De overige banen bevatten ~ 28μg eiwit uit rat substantia nigra monsters. Het eiwit lasten zijn gebaseerd op de eiwitconcentratie van elk monster bepaald door de BCA-methode. Echter, ondanks wat gelijk moet zijn belastingen, zijn er variaties in de duisternis van de vlekken Ponceau S tussen de monsters wijst op een lichtevariabiliteit in eiwitconcentraties, welke wordt gecorrigeerd met normalisering met ImageJ analyse voor de hoeveelheid kleuring Ponceau S analyseren voor elk monster.
Figuur 4. Vertegenwoordiger TH fosforylering resultaten van controles en behandelingen. Vertegenwoordiger ser31 gefosforyleerde tyrosine hydroxylase (PTH) en ser40 PTH Western blots van zout en metamfetamine behandelde Wistar ratten uit een eerdere studie 4. A. ser 31 PTH in de rat substantia nigra monsters. De gekalibreerde SER 31 PTH standaard curve varieert van 0,3 tot 2,0 ng ng en is binnen het lineaire gebied van detectie. Gebaseerd op eerder Western blot analyse van alle TH niveau werd 6 ng totaal TH geladen voor elk monster. B. ser40 PTH in de rat ventrale tegmentale monsters. De gekalibreerde ser40 PTH standaard curve loopt uiteen van 0,2 tot 1,5 ng ng en is binnen het lineaire gebied van detectie. Gebaseerd op eerder Western blot analyse van alle TH niveaus zijn 9 ng totaal TH geladen voor elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals in figuur 1, dienen de hierboven beschreven leveren meerdere metingen van dopamine en regulerende eiwitten TH, DAT en VMAT2 van een monster van SN of VTA verkregen van ofwel de rat of muis. Nogmaals, de voordelen van het uitvoeren van dit protocol is dat de onderzoeker kan operationeel op elkaar afgestemde uitlezingen van de manier waarop dopamine is geregeld in vivo onder nagenoeg alle experimentele paradigma, en daarmee belangrijke experimentele middelen te besparen door het verminderen van het aantal dieren dat nodig is in een te verkrijgen experiment.
Het is absoluut noodzakelijk dat de onderzoeker temperatuur eisen die tijdens de dissectie (4 ° C), de opslag van weefsel (minstens -70 ° C), weefsel sonicatie (onmiddellijke sonicatie na verwijdering van de bewaartemperatuur) in ijskoude HPLC buffer te observeren en volgende pellet vorming en verwerking. Wanneer de pellet gesoniceerd en gekookt in SDS-oplossing kan de monsters blijven furthre verwerkt bij kamertemperatuur. Opslag van gearchiveerd HPLC geanalyseerde monster en het monster buffer bereide monsters eiwitanalyse moet bij -80 ° C.
Nogmaals, het grote voordeel van het protocol is de aangeboren benadering van operationeel-match resultaten met betrekking tot dopamine regelgeving in vivo. Verder is het normaliseren van dopamine weefsel uitlezingen naar markers van dopaminerge neuropil (TH, DAT) zorgen voor een grote mate van zekerheid dat de onderzoeker is ontleden van SN of VTA met consistentie en nauwkeurigheid. Gezien de betrokkenheid van dopamine in de verslavingszorg, psychiatrische stoornis en bewegingsapparaat arena's, kan dit protocol worden toegepast in vele experimenten. Een opvallende beperking is dat de interpretatie van de TH fosforylering resultaten moeten conservatief zijn, want het is niet bekend op dit moment de mate waarin een toename van de fosforylatie op ser31 of ser40 nodig is in vivo tot L-DOPA biosynthese te verhogen. Maar, zoals gezegd, er is evfeiten laten dat ser31 fosforylering lijkt te reguleren L-DOPA biosynthese en heeft een rol in het reguleren van het totaal dopamine weefsel-gehalte in het CZS 2,10. Op dit moment normen TH eiwit en TH fosforylatie niet commercieel verkrijgbaar. Toch heeft dit laboratorium onderhouden en uitgebreid dergelijke normen gebaseerd op die bij het eerste artikel over TH fosforylering regelgeving in vivo werd gepubliceerd 11. Toch is het mogelijk om dopamine weefselinhoud normaliseren teruggewonnen TH eiwit in deze discrete gebieden met dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering voor de dit werk, en zoals aangehaald 2,10, werd verstrekt, voor een deel, door een onderzoek te verlenen awards uit aan MF Salvatore van de Amerikaanse Federatie voor Aging Research, de Edward P. Stiles Trust Fund en Biomedische Research Foundation van Noordwest-Louisiana, en BS Pruett van de Ike Muslow Predoctoraal Fellowship, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
|||
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
|||
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
|||
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
|||
Pump: Shimadzu LC-10AD |
|||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
|||
| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
|||
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
|||
References
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
