Summary
La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.
Abstract
Dopamina è un neurotrasmettitore vigorosamente studiato nel SNC. Infatti, il suo coinvolgimento in attività locomotoria e la ricompensa comportamento correlato ha favorito cinque decenni di inchiesta sulle carenze molecolari associati con regolazione della dopamina. La maggior parte di queste indagini di regolazione della dopamina nel cervello, la messa a fuoco sulla base molecolare per la sua regolamentazione nel campo delle regioni terminali dei percorsi nigrostriatali e mesoaccumbens, striato e nel nucleo accumbens. Inoltre, tali studi si sono concentrati sull'analisi del tenore di tessuto dopamina con normalizzazione a un solo peso del tessuto bagnato. Indagine delle proteine che regolano la dopamina, come la tirosina idrossilasi (TH) di proteine, fosforilazione TH, trasportatore della dopamina (DAT), e vescicolari trasportatore monoamine 2 (VMAT2) proteina spesso non includono l'analisi del tenore di tessuto dopamina nello stesso campione. La capacità di analizzare sia il contenuto della dopamina dei tessuti e delle sue proteine di regolazione (compresa la post-tramodifiche nslational) non solo dà potere intrinseco di interpretare il rapporto della dopamina con il livello di proteine e la funzione dei TH, DAT, o VMAT2, ma si estende anche all'economia del campione. Ciò si traduce in un costo minore, e tuttavia produce approfondimenti nel regolamento molecolare di dopamina in qualsiasi paradigma di scelta degli investigatori.
Ci concentriamo le analisi nel mesencefalo. Anche se il SN e VTA sono in genere trascurati nella maggior parte degli studi di regolazione della dopamina, questi nuclei sono facilmente sezionato con la pratica. Una lettura completa di tenore di tessuto dopamina e TH, DAT, o VMAT2 può essere condotto. Vi è fiorente letteratura sull'impatto della funzione della dopamina nel SN e VTA sul comportamento, e le impingements di sostanze esogene o di processi di malattia ivi 1-5. Inoltre, i composti come fattori di crescita hanno un effetto profondo sulla proteine dopamina e dopamina-regolazione, in misura relativamente maggiore nella SN o VTA Si illustrerà la tecnica di dissezione per separare questi due nuclei e il trattamento del campione di tessuto sezionato che produce un profilo rivelando meccanismi molecolari di regolazione dopamina in vivo, specifici per ogni nuclei (Figura 1).
Protocol
1. Dissezione
- Su un letto di wet-ghiaccio, raffreddare una matrice cervello dei roditori (sezioni coronali segregato 1 millimetro di distanza), una capsula di Petri contenente 5 rasoi, e un bisturi # 11. In un contenitore separato, posto etichettato tubi microcentrifuga da 2 ml di grandezza in ghiaccio secco.
- Il ricercatore scegliere il metodo di eutanasia. Abbiamo risultati riproducibili effettuazione di una anestesia molto breve con isoflurano, idealmente, un vaporizzatore deve essere usato. Tuttavia, se non disponibile, si usa una batteria grande giara contenente una piattaforma. Con il vaso della batteria si trova in una cappa di ventilazione approvato, inserire un isoflurano satura di garza sotto la piattaforma e aspettare 3-5 minuti per consentire l'isoflurano per saturare il vaso della batteria. Posizionare il ratto dentro e rimuovere per decapitazione, non appena il topo ha perso conoscenza. Rimuovere rapidamente il cervello (idealmente in meno di due minuti), sciacquare sotto l'acqua fredda, e posizionare immediatamente nella matrice fredda cervello dei roditori.
- Un minuto dopo la posizioneIng il cervello nella matrice, inserire lame fredde nel cervello raffreddato, a partire circa 2 mm anteriore del chiasma ottico se il corpo striato e nel nucleo accumbens sono desiderati per l'analisi in aggiunta ai nuclei mesencefalo. Continuare inserisce lamette freddo con ciascuna sezione 1 mm fino ad arrivare a metà del ponte, sfalsando il posizionamento di ogni lama di rasoio successivo in modo da facilitare facile rimozione di ogni singola lama.
- Quando si estrae il rasoio, e cercare l'inizio dell 'ippocampo. Quando è completamente avvolto attorno al mesencefalo, cominciano a prendere sezioni utilizzando la # 11 bisturi, come illustrato in figura 2.
- Disporre il tessuto sezionato nel pre-raffreddata provetta per microcentrifuga sul ghiaccio secco. Nel ratto, si aspettano di essere in grado di sezionare SN e VTA da un minimo di due fette coronali e un massimo di tre. Tessuti Conservare a -80 ° C fino al momento per l'elaborazione.
2. Tissue Analysis: HPLC fo dopamina e metaboliti
Per informazioni complete sulla attrezzatura HPLC e manutenzione, riferirsi all'analisi HPLC, alla fine del manoscritto.
- Delicatamente omogeneizzare tessuto immediatamente dopo la rimozione dal ghiaccio secco utilizzando ghiacciata 0,1 M HClO 4-EDTA (0,1 M HClO 4 e 0,1 mM EDTA) 9, che contiene N-metil dopamina ad una concentrazione di 20 ng / mL, che funge uno standard interno per il recupero del campione durante l'analisi HPLC. L'omogeneizzatore che usiamo è un Sonifier Branson 150, con l'impostazione al 10% della potenza totale (1 su 10). I volumi sonicazione si consigliano:
Nel ratto, SN = pl 250 (dissezione unilaterale), 400 microlitri (dissezione bilaterale), VTA = 200 (dissezione unilaterale) ul, 400 ul (dissezione bilaterale).
In mouse, (dissezioni bilaterali solo), SN = 200 microlitri, VTA = 200 pl. - Dopo l'omogeneizzazione, di contenere campioni in ghiaccio secco. I campioni sono poi centrifuged (DuPont Sorvall MicroSpin 24S) a 12.000 RPM per sedimentare la proteina pellet da utilizzare per determinazioni western blot. I supernatanti vengono iniettati direttamente nel HPLC. I volumi di iniezione sono raccomandati per l'analisi precisa nel ratto o il mouse: (. Sia da prep) SN = 150 (. Sia da prep), VTA = 160 microlitri
- Lo standard archivio viene preparata a 1 mg / ml aggiungendo la quantità appropriata di monoammine e metaboliti * di componente dopamina a 0,1 M di acido perclorico 0,1 mM EDTA. La concentrazione di ogni composto è di 1 mg / ml eccetto triptofano che è 5 mg / ml. Lo standard stock è diviso in 10 aliquote pl e memorizzati nel bassissimo fino a quando necessario.
* Tutti i pesi sono corretti per la forma di sale del composto, se applicabile.
Preparare lo standard di lavoro diluendo una aliquota di 10 microlitri di standard di scorta a 100 ml di soluzione di acido perclorico. La concentrazione dello standard di lavoro è 0,1 ug / ml eccetto triptofano che è 0,5 ug / ml. 50 pl diquesto standard di lavoro viene iniettato nel HPLC per un on-column quantità di 5 ng di ciascun componente, tranne triptofano che è di 25 ng. - Determinazione del recupero della dopamina nel frazionamento del campione:
Ci sono diversi passaggi coinvolti per determinare il recupero della dopamina da un frazionamento del campione. - In primo luogo, dividere l'altezza della dopamina picco del campione per l'altezza del picco dello standard dopamina e moltiplicare questo rapporto per l'importo totale (ng) di dopamina nello standard. La nostra concentrazione di dopamina standard è 0,1 microlitri ng / ul e 50 della norma viene analizzato. Pertanto, la quantità di dopamina nel standard è 5 ng. Pertanto, la seguente equazione può essere utilizzato per determinare il recupero dopamina in un dato campione:
(Altezza del picco dopamina nel campione / altezza del picco di dopamina in standard) * 5 ng - Correzione per la perdita del campione utilizzando lo standard interno N-metil dopamina:
L'effettivo recupero di N-metil dopamina è calcolato nello stesso modo dopamina dividendo il N-metil dopammina altezza di picco nel campione da N-metil altezza picco dopamina dello standard e questo rapporto moltiplicando la quantità totale (ng) di N-metil dopamina nello standard. Come la dopamina, il nostro standard di N-metil concentrazione di dopamina è di 0,1 ng / ul. 50 pl della norma viene analizzato. Pertanto, la quantità di N-metil dopamina nello standard è di 5 ng. Pertanto, la seguente equazione può essere utilizzato per determinare N-metil recupero dopamina in un dato campione:
(N-metil altezza picco dopamina nel campione / N-metil altezza picco dopamina in standard) * 5ng
Tuttavia, poiché la N-metil dopamina in ciascun campione non proviene dal campione stesso, ma dal buffer HPLC, la quantità di N-metil dopamina previsto in ciascun campione viene calcolata. L'N-metil concentrazione di dopamina in tampone HPLC è 20 ng / ml o 0,02 ng / mL, quindi la quantità prevista di N-metil dopamina in ciascun campione è trovato moltiplicando il N-metil concentrazione dopamina del buffer HPLC dal volume aliquota di ciascun campione utilizzato per HPLC analisi. Ciò è illustrato nel seguente equazione:
(0,02 ng / pl) * (volume di aliquota di campione utilizzato per l'analisi HPLC) - La differenza tra l'atteso e recuperato N-metil dopamina può quindi essere utilizzato per correggere l'per la quantità di dopamina recuperato regolando per qualsiasi perdita del campione. Basta prendere il rapporto di atteso N-metil dopamina / recuperato N-metil dopamina e moltiplicare tale dalla quantità di dopamina recuperato. Pertanto, l'equazione generale per la quantità di dopamina in un'aliquota di campione è il seguente:
(Altezza del picco dopamina nel campione / dopamina altezza picco in standard) * (N-metil altezza picco dopamina in standard / N-metil altezza picco dopamina nel campione) * (0,02 ng / pl) * (volume di aliquota di campione utilizzato per l'analisi HPLC ) - Dopamina totale recuperata da un campione:
Il valore di dopamina recuperato da un frazionamento del campione viene poi utilizzato per estrapolare la quantità totale di dopamina in un dato campione. Ciò viene fatto dividendo l'importo recuperato (ng) of DA dal volume aliquota e moltiplicando questo valore per il volume totale del tampone HPLC che il campione è stata sonicata, questa fase è dato dalla seguente equazione:
(Quantità (ng) di dopamina in aliquota / volume di frazionamento del campione) * (volume totale di tampone HPLC in cui è stata sonicata campione).
Il lettore si riferisce ai seguenti studi 2,4,10 per una presentazione completa della valutazione dei metaboliti della dopamina e in collaborazione con letture di dopamina in proteine che regolano non solo SN e VTA, ma striato e nucleo accumbens pure.
3. Tissue Analysis: Total normalizzazione delle proteine e finale dei risultati TH e DAT
- Posizionare i pellets proteina precipitata (derivante dal trattamento tampone HPLC) in ghiaccio, per mantenere 4 ° C. Assicurarsi che tutti i buffer è stato rimosso e archiviati (se l'analisi di conferma è richiesto). Se il SN o VTA deve essere lavorato bilateralmente (ratto solo), aggiungere 300 microlitri (SN) o 200 pl (VTA) del 1% SDS contenente 5 mM Tris (pH 8,3) e 1 mM EDTA a pellet e sonicare. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di SDS al SN pellets o 100 ul a pellet VTA Se l'elaborazione di tessuti da dissezioni unilaterali.
- Porre i campioni in prossimità di acqua bollente per ~ 5 minuti per completare denaturazione delle proteine e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i tappi sono saldamente in questa fase.
- Determinare concentrazione di proteina nel campione usando il saggio BCA, compresa una curva standard proteina (standard albumina) nell'intervallo 2-40 pg di proteina. Assay volume di 5 microlitri del campione in triplicato e usare il valore mediano per determinare quantità di proteina contro la curva standard. Dividere per il volume di saggio di concentrazione di proteina. Nota: questo è il primo dei due provvedimenti adottati per normalizzare TH totale, DAT, e VMAT2 risultati per il recupero delle proteine totali.
- Preparare i campioni con tampone campione (contenente ditiotreitolo) per ridurre SDS-elettroforesi su acrilamide g 10%els. Idealmente, la concentrazione finale di proteine totali dovrebbe essere ~ 2 pg / pl. La ragione di questa selezione concentrazione è di ridurre il volume del campione necessaria per la determinazione finale di fosforilazione TH, come ~ 100 pg di proteina totale sarà necessario per il caricamento quantificare precisamente ser31 e ser40 fosforilazione TH. Se il colore giallo è visto nel campione dopo l'aggiunta di tampone del campione, il campione è troppo acido. Aggiungere 1 M Tris (pH 8.2) con incrementi di 10 pl fino a quando il colore blu viene ripristinato.
- Preparare i campioni come segue per le seguenti determinazioni di dopamina-proteine che regolano:
- TH: contro uno standard calibrato per la proteina TH (come ng), la concentrazione di TH (TH come per ng per pg di proteina totale) in SN dovrebbe variare da ~ 0,05-0,27 TH ng per pg di proteina totale di 2,4, 7,10,11. Contro una curva TH lineare standard, che vanno 0,5-5,0 ng TH e l'utilizzo di anticorpo primario TH (cat Millipore # AB152, diluizione 1:1000 in PVP T-20 Soluzione bloccante) che produce una curva standard lineare, il carico ottimale di proteine totali del SN dovrebbe essere ~ 10 ug. La concentrazione di TH nella VTA varia da ~ 0,4-1,0 ng TH per 4,11 mg di proteine. Pertanto, il carico di proteine totali per VTA dovrebbe essere ~ 5 pg.
- DAT: Le quantità relative di DAT a SN o VTA sono significativamente inferiore a quella delle regioni affini campo terminali di striato e nucleo accumbens 4. L'espressione relativa del DAT come normalizzata alle proteine TH recuperata è anche significativamente più bassi nei SN e VTA. Di conseguenza, i carichi di proteine per la quantificazione delle proteine DAT in SN o VTA devono essere molto maggiore rispetto ai carichi di esempio delle regioni terminali del campo. Un minimo di 30 pg di proteina totale è necessaria per la precisione nella valutazione DAT in VTA e un carico nominale di 50 pg di proteina totale è necessità di una valutazione del SN. L'anticorpo primario utilizzato è Santa Cruz, cat # sc-1433.
- VMAT2: L'espressione della VMAT2, Come normalizzato alle proteine totali, è maggiore nelle regioni che mesoaccumbens nigrostriatali. Tuttavia, rispetto all'espressione TH, espressione VMAT2 è maggiore in SN e almeno in striato 4. Utilizzo di Santa Cruz cat # sc-15314, un carico nominale di proteine totali di circa il 40 mcg di essere la migliore per la quantificazione del VMAT2.
- Eseguire la quantità adeguata di proteine totali tramite SDS-PAGE su gel di acrilammide al 10%. Il Bio-Rad Protean II unità elettroforesi viene utilizzata per le determinazioni, che è un gel grande formato. Trasferire le proteine su nitrocellulosa 0,45 micron dimensione dei pori. Per il trasferimento, un serbatoio Hoeffer impostata su almeno 27 Volt permette il trasferimento avrà luogo durante la notte.
- Lasciare le macchie asciugare per almeno 30 minuti e poi macchia con soluzione Ponceau S (1% Ponceau S in 5% di acido acetico glaciale) per ~ 5 minuti. De-macchia vigorosamente con lo 0,2% di soluzione di HCl fino a bande proteiche individuali chiaramente risolvere e la colorazione di fondo è stato rimosso. Ottenere un'immagine del Ponceau S macchiaing con J l'immagine per quantificare ulteriormente i carichi di proteine rispetto in ogni corsia e normalizzare TH, DAT, o VMAT2 risultati (Figura 3).
4. Tissue Analysis: sito-specifica fosforilazione TH
La fosforilazione di TH a ser31 ser40 può aumentare o L-DOPA biosintesi delle catecolamine in cellule 12. Sebbene la quantità di fosforilazione in ogni sito necessario per aumentare la L-DOPA biosintesi in regioni cerebrali dopaminergici come SN e VTA non viene stabilita, è evidente che ser31 fosforilazione gioca un ruolo importante nella regolazione L-DOPA biosintesi 10 e co-varia con DA tenore di tessuto tra lo striato, il nucleo accumbens, SN e VTA 2, 10. Tuttavia, l'inclusione di ser40 sono necessarie determinazioni, in quanto numerosi studi mostrano che può influenzare l'attività TH, in particolare se una soglia di fosforilazione è raggiunto il 12.
Mentre ser19 phosphorylatinon influisce sulla attività TH solo 13,14, può essere considerato un sentinella Ca 2 +-dipendente segnalazione nel neurone DA, dato che extracellulare Ca 2 + è necessario aumentare ser19 fosforilazione in condizioni depolarizzando 12. Inoltre, vi è una significativa correlazione positiva con la fosforilazione di ser19 ser31 fosforilazione solo nel SN e VTA 10, a significare che ser19 stato di fosforilazione potrebbero influenzare ser31 fosforilazione, e quindi, indirettamente L-DOPA biosintesi.
Considerazioni Esempi di carico ottimale per la quantificazione del site-specific stechiometria TH fosforilazione: Di seguito, le considerazioni necessarie per le determinazioni accurate e precise di site-specific fosforilazione TH nei tessuti sezionati è presentato. Quando possibile, uno standard di fosforilazione calibrato TH dovrebbero essere inclusi nella valutazione di fosforilazione campione TH. Il carico campione deve tener accstechiometria ount inerente a ciascun sito di fosforilazione in modo che il saggio di fosforilazione quantifica entro la gamma dinamica di lavoro del anticorpo utilizzato. Come nota finale, la proteina intrinseca totale che entra nel test per ogni campione deve essere caricato anche nelle corsie della curva standard. Ciò è facilmente ottenibile con una proteina carrier (come fegato di ratto), che non esprime TH.
- . ser19 Dei tre siti di fosforilazione, ser19 stechiometria i livelli di fosforilazione sono maggiori in SN e VTA, che vanno 0,15-0,25 2,10,11. L'altra considerazione è che il nostro metodo di rilevazione, ser19 ps è quantificato nella gamma lineare tra 0,5 e 5,0 ng fosfo-ser19 10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine TH tra 5 e 10 ng (dando così circa 0,75-2,5 ng fosfo-ser19 dal campione) fornirebbe una misura affidabile di ser19 fosforilazione TH. Usiamo Phosphosolutions primaria (Cat. # p1580-19) a diluizione 1:1000.
- ser31 ser31. stechiometria livelli di fosforilazione sono relativamente meno in SN e VTA rispetto alle loro regioni affini campo dei terminali, che vanno da ~ 0,04-0,10 2,4,10,11. Con il nostro metodo di rilevazione, ser31 ps viene rilevato nella gamma lineare tra 0,5 e 7,0 ng fosfo-ser31 10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine TH tra 10 e 30 ng (dando così circa 0,50-3,0 ng fosfo-ser31 dal campione) fornirebbe una misura affidabile della fosforilazione ser31TH. Vedi Figura 4A per un esempio di ser31 quantificazione. Il nostro anticorpo primario è un in-house purificate per affinità anticorpo che è stato prodotto da Biochemicals 21 ° secolo, (Boston, MA), e convalidato per la specificità della fosfo-epitopo utilizzando i nostri in-house standard 2.
- ser40 ser40 livelli di fosforilazione stechiometria in SN e vanno da VTA ~ 0,02 -. 0,06 2,4,10,11. Con il nostro metodo di rilevazione, sER40 ps viene rilevato nella gamma lineare tra 0,2 e 2,0 ng fosfo-ser40 10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine TH tra 10 e 30 ng (dando così uno stimato 0,20-1,8 ng fosfo-ser40 dal campione) fornirebbe una misura affidabile della fosforilazione ser40TH. Vedi 4B figura per un esempio di ser40 quantificazione. Usiamo Phosphosolutions primaria (Cat. # p1580-40) a diluizione 1:1000.
5. Risultati rappresentativi
- La dopamina in SN vs VTA Ci sono tre letture di dopamina (o metaboliti) che possono essere presi in analisi quantitativa;. Secondo totale recuperata dalla dissezione, per le proteine, e per le proteine TH (come dimostrano ad striato, SN, nucleo accumbens, e VTA in tabella 1). Il recupero della dopamina totale tra SN e VTA è abbastanza simile, compresa tra 6-9 ng per due o tre dissezioni fetta coronali 2. Normalizzare il recupero della dopamina alle proteine totali mostrerà that, basato sul metodo di dissezione impiegato, che il VTA avrà maggiore dopamina per proteine totali, media di 6-8 ng / mg di proteina in SN e 9-10 ng / mg di proteina in VTA 2, 4. Infine, la normalizzazione della dopamina per TH totale recuperata dovrebbe rivelare una differenza tra SN e VTA, essendo maggiore nel VTA 10, e compresa tra 0,2 e 0,8 ng dopamina per proteina TH ng tra le due regioni 2,10.
DA regione Totale DA recuperato DA per mg di proteina DA per ng TH striato 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Nucleus accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Proteine totali: TH, DAT, VMAT2 Utilizzando la calibrata standard di proteine TH per la quantificazione, più TH viene recuperato in SN che il VTA dalla dissezione (60 ng in SN e 26 ng in VTA 2). Tuttavia, quando normalizzata a proteine, questo rapporto inverte, con TH per proteine totali del VTA essere ~ 3 - a 5 volte superiore rispetto al SN, (~ 0,32 ng / mg proteina in VTA e ~ 0,09 in SN) 4, 10.
L'atteso recupero DAT in SN e VTA è simile, con il recupero un po 'più nel VTA secondo proteine totali o secondo TH totale recuperata 4. In particolare, proteina DAT è molto meno abbondanti in queste regioni rispetto alle regioni cognate campo terminali 4 VMAT2 recupero per proteine totali è maggiore nella VTA rispetto SN 4. Tuttavia, quando normalizzata per TH proteine, c'è il recupero leggermente maggiore nel SN 4. - Sito-specifica fosforilazione TH Da un certo numero di studi, sono stati risultati consistenti in ser19, ser31, e ser40 quantità fosforilazione nella SN e VTA, e anche in relazione alle regioni cognate campo terminali. Ser19 fosforilazione è notevolmente maggiore nel SN e VTA (~ 0,2-0,3) rispetto al corpo striato e nel nucleo accumbens (~ 0,05-0,15) 2,4,7,10,11. Ser31 fosforilazione è significativamente inferiore nel SN e VTA rispetto alle loro regioni affini campo terminali, essendo ~ 0,06-0,10 tra queste regioni somatodendritic 2,4,7,10,11. Durante l'inibizione della decarbossilasi dell'acido aromatico con NSD-1015, vi è un aumento di 2 volte in ser31 fosforilazione in soli 10 VTA. Ser40 fosforilazione varia tra 0,02 e 0,05 nel SN eVTA e generalmente questo stechiometria non differisce significativamente dalle regioni affini campo terminali 2,4,7,10,11.
Figura 1. Letture dopaminergici da una dissezione tessuto.
Figura 2. Tecnica di dissezione per isolare l'neuropilo dopaminergico mesencefalo. Tecnica per la dissezione substantia nigra (SN) dalla zona ventrale tegmentale (VTA). 1. Rimuovere corteccia sovrastante e l'ippocampo (queste strutture siano già stati rimossi nell'immagine sopra). 2. Praticare un taglio verticale che separa la zona pigmentata della SN dal VTA. 3. Effettuare un taglio orizzontale o vicino alla linea mediana appena sopra la parte più dorsale e laterale del SN. 4. Stuzzicare la SN lontano dal resto del tronco encefalico. Una volta SN è stato rimosso, analogamente stuzzicare il VTA dallaresto del mesencefalo. Nota: questa sezione si osserva tipicamente in corrispondenza delle coordinate, rispetto al bregma, di AP 5.7.
Figura 3. Seconda (e ultima) la normalizzazione del totale colorazione delle proteine carico Ponceau S per l'analisi dell'immagine J. Proteine Ponceau S colorazione di una determinazione TH totale in campioni di ratto substantia nigra. I primi cinque corsie formano la sinistra sono la curva standard TH totale, al quale pg di proteina 28 da omogenato di fegato di ratto è stato aggiunto a rispecchiare il carico di proteine dai campioni di substantia nigra. La corsia successiva contiene peso molecolare (MW) i marcatori. Le corsie rimanenti contengono ~ 28μg di proteine da campioni di ratto substantia nigra. I carichi proteici sono basati sulla concentrazione proteica di ciascun campione, determinato con il metodo BCA. Tuttavia, nonostante ciò che dovrebbe essere carichi uguali, ci sono variazioni nel buio della colorazione Ponceau S tra i campioni che indicano un leggerovariabilità in concentrazioni proteiche, che è corretta per la normalizzazione utilizzando un'analisi ImageJ per analizzare la quantità di colorazione Ponceau S per ciascun campione.
Figura 4. Rappresentativi risultati TH fosforilazione dai controlli e trattamenti. Rappresentante ser31 tirosina idrossilasi fosforilata (PTH) e ser40 blot PTH occidentali di ratti trattati con soluzione salina e metanfetamine Wistar da un precedente studio 4. A. ser 31 PTH in campioni di ratto substantia nigra. I calibrati ser 31 gamme di PTH curva standard da 0,3 a 2,0 ng ng ed è all'interno del range lineare di rilevazione. Sulla base di precedenti analisi Western blot dei livelli di TH totali, 6 ng di TH totale sono stati caricati per ogni campione. B. ser40 PTH in campioni di ratto tegmentale ventrale. Le calibrate ser40 gamme di PTH curva standard da 0,2 a 1,5 ng ng ed è all'interno del range lineare di rilevazione. Sulla base di precedenti analisi Western blot dei livelli di TH totali, 9 ng dei TH totale sono stati caricati per ogni campione.
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Discussion
Come illustrato nella figura 1, i metodi descritti sopra dovrebbe produrre letture multiple di dopamina e della sua TH proteine che regolano, DAT, e VMAT2 da un campione di SN o VTA ottenuti dal ratto o topo. Anche in questo caso, i benefici di realizzare questo protocollo è che il ricercatore può ottenere letture operativamente trovati di come dopamina è regolata in vivo in virtualmente qualsiasi paradigma sperimentale e, così facendo, risparmiare notevoli risorse sperimentali riducendo il numero di animali richiesto in qualsiasi esperimento.
E 'assolutamente necessario che il ricercatore rispettare i requisiti di temperatura imposte durante la dissezione (4 ° C), deposito di tessuto (almeno -70 ° C), sonicazione tessuto (sonicazione immediatamente dopo la rimozione dalla temperatura di conservazione) in tampone ghiacciato e HPLC la successiva formazione di pellet e di elaborazione. Una volta che il pellet viene sonicata e bollito in soluzione SDS, i campioni possono continuare ad essere Further trattati a temperatura ambiente. Deposito di archiviati HPLC analizzato campione ed i campioni preparati tampone campione per l'analisi proteica deve essere a -80 ° C.
Anche in questo caso, il vantaggio principale del protocollo è l'approccio innata operativamente risultati delle partite relative alla regolamentazione della dopamina in vivo. Inoltre, la normalizzazione dei tessuti letture della dopamina ai marcatori di neuropilo dopaminergica (TH, DAT) forniscono una grande misura di garanzia che il ricercatore è dissezione SN o VTA con coerenza e precisione. Dato il coinvolgimento di dopamina nella dipendenza, disturbo psichiatrico, arene e locomotori, questo protocollo potrebbe essere impiegato in molti esperimenti. Una limitazione importante è che l'interpretazione dei risultati fosforilazione TH devono essere conservative, in quanto non è noto in questo momento la misura in cui è richiesto un aumento fosforilazione a ser31 ser40 o in vivo per aumentare la L-DOPA biosintesi. Tuttavia, come detto, è evidence che ser31 fosforilazione sembra regolare L-DOPA biosintesi e ha un ruolo nella regolazione del contenuto totale del tessuto dopamina nel sistema nervoso centrale 2,10. In questo momento, standard per proteine TH e fosforilazione TH non sono commercialmente disponibili. Tuttavia, questo laboratorio ha mantenuto e ampliato tali standard basati su quelli utilizzati quando il primo documento sulla regolamentazione TH fosforilazione in vivo è stata pubblicata 11. Tuttavia, è possibile normalizzare il contenuto di proteina dopamina tessuto TH recuperata in queste regioni discrete usando questo protocollo.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Finanziamenti per il questo lavoro, e come citato 2,10, è stato fornito, in parte, da un premi per la ricerca di sovvenzioni a MF Salvatore dalla Federazione americana per la ricerca sull'invecchiamento, The Edward P. Stiles Trust Fund e Biomedical Research Foundation di Northwest Louisiana, e BS Pruett dalla Compagnia Ike Muslow Predoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
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HPLC system: |
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The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
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The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
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The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
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Pump: Shimadzu LC-10AD |
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| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
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| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
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Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
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References
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