Summary
Допамин четко регулируется в ядрах мозга, в которых содержатся клетки тела и дендриты нейронов допамина. Здесь мы опишем вскрытия и образец обработки подход для достижения максимальных результатов, и, следовательно, выводы и понимание, на допамин регулирования в мозге зародышей черной субстанции (SN) и вентральной области покрышки (VTA) у грызунов.
Abstract
Допамин является активно изучал нейромедиатор в ЦНС. В самом деле, его участие в двигательной активности и вознаграждение поведения, связанного способствовала пять десятилетий исследования в области молекулярной недостатки, связанные с регулированием допамина. Большинство из этих запросов допамина регулирования в мозгу внимание на молекулярные основы ее регулирования в терминале поле регионах нигростриатной и mesoaccumbens пути, стриатуме и прилежащем ядре. Кроме того, такие исследования были сконцентрированы на анализе содержания допамина ткани с нормализацией только сырого веса ткани. Исследование белков, которые регулируют допамина, такие, как тирозин гидроксилазы (TH) белка, TH фосфорилирования, переносчика дофамина (DAT), и везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) белок часто не включают в себя анализ содержания дофамина в тканях и того же образца. Умение анализировать и содержание дофамина ткани и ее регулирующих белков (в том числе пост-траnslational модификации) не только дает присущее власти интерпретации отношений допамина с уровнем белка и функции TH, DAT, или VMAT2, но распространяется также образцы экономики. Это приводит к меньшей стоимости, и тем не менее дает полное представление о молекулярной регуляции допамина практически в любой парадигме выбор следователей.
Мы ориентируемся анализа в мозге. Несмотря на то, СН и ВТА, как правило, игнорируется в большинстве исследований дофамина регулирования, эти ядра легко расчлененный с практикой. Всеобъемлющего считывания содержания допамина ткани и TH, DAT, или VMAT2 может быть проведена. Там в растущей литературы о влиянии функции дофамина в СН и ВТА на поведение, и impingements экзогенных веществ или болезненных процессов в нем 1-5. Кроме того, такие соединения, как факторы роста оказывают глубокое влияние на допамин и дофамин-регулирование белков, в сравнительно большей степени в SN или VTA Проиллюстрируем вскрытия техника для разделения этих двух ядер и обработки образцов из расчлененных ткани, которая производит профиль выявления молекулярных механизмов регуляции допамина в естественных условиях, характерных для каждого ядра (рис. 1).
Protocol
1. Рассечение
- На ложе из мокрого льда, охладить матрицу грызунов мозга (корональные разделы выделены 1 мм друг от друга), чашки Петри, содержащие 5 бритвы, и № 11 скальпеля. В отдельной емкости, места помечены 2 мл труб размером микроцентрифужную в сухой лед.
- Следователь будет выбрать способ эвтаназии. У нас есть воспроизводимыми результатами проведения анестезии очень короткий с ИФ, в идеале, испаритель должны быть использованы. Однако, если нет, мы используем большой сосуд батарея с платформы. С батареи банка расположены в утвержденный вентиляционных капот, разместить ИФ-насыщенных марлевым тампоном под платформу и ждать 3-5 минут, чтобы насытить ИФ батареи банкой. Положите крысу внутрь и снять для обезглавливания, как только крыса потеряла сознание. Быстро удалить мозга (в идеале до двух минут), промыть под холодной водой, и поместить непосредственно в охлажденном матрица мозга грызунов.
- Одна минута после позициив G мозга в матрицу, вставить холодного лезвия в охлажденный мозг, начиная примерно с 2 мм ростральнее зрительных нервов, если стриатуме и прилежащем ядре желательны для анализа в дополнение к мозге ядер. Продолжить вставки холодного лезвия с шагом 1 мм раздел до прибытия в середине моста, пошатываясь размещения каждого последующего лезвия, чтобы облегчить удаление легче каждого лезвия.
- При извлечении из бритвы, посмотрите для начала гиппокампе. Когда он полностью оборачивается вокруг мозга, начинают принимать разделам помощи № 11 лезвие скальпеля, как показано на рисунке 2.
- Немедленно поместите расчлененный ткани в предварительно охлажденный микроцентрифужную трубки на сухой лед. У крыс, ожидать, чтобы иметь возможность анализировать СН и ВТА из как минимум двух корональных ломтиками и не более трех. Магазин тканей при температуре -80 ° C до готовности для последующей обработки.
2. Ткань Анализ ВЭЖХ еили дофамина и его метаболитов
Для получения полной информации об оборудовании HPLC и техническое обслуживание, обратитесь к анализу ВЭЖХ в конце рукописи.
- Осторожно гомогенизации ткани сразу после извлечения из сухого льда использованием ледяной 0,1 М HClO 4-раствором ЭДТА (0,1 М HClO 4 и 0,1 мМ ЭДТА) 9, которая содержит N-метил допамина в концентрации 20 нг / мл, что является Внутренний стандарт для восстановления образца во время анализа ВЭЖХ. Гомогенизатор мы используем Брэнсон Sonifier 150, с установкой на 10% от полной мощности (1 из 10). Следующие объемы ультразвука рекомендуется:
В крысы, SN = 250 мкл (одностороннее вскрытие), 400 мкл (двустороннее рассечение), VTA = 200 мкл (одностороннее вскрытие), 400 мкл (двустороннее рассечение).
В мыши (только двусторонние вскрытия), SN = 200 мкл, VTA = 200 мкл. - После гомогенизации, проводить пробы на сухой лед. Образцы затем centrifuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) при 12000 оборотов в осадок белка гранул, которые будут использоваться для определения западной пятном. Супернатантах вводят непосредственно в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Следующие объемы инъекций рекомендуется для точного анализа в крысу или мышь: (. Либо подготовки) SN = 150 (. Либо подготовки), VTA = 160 мкл
- Фондовый стандарт подготовлен на 1 мг / мл, добавляя соответствующее количество моноаминов и метаболитов дофамина * компонент до 0,1 М хлорной кислоты 0,1 мМ ЭДТА. Концентрация каждого соединения составляет 1 мг / мл, кроме триптофана, которая составляет 5 мг / мл. Фондовый стандарт разделен на 10 мкл аликвоты и хранить в сверхнизких до необходимости.
* Все весов с поправкой на соль формы соединения, если это применимо.
Подготовка рабочего эталона путем разбавления 10 мкл фондовый стандарт 100 мл хлорной кислоты. Концентрация рабочего эталона составляет 0,1 мкг / мл, кроме триптофана, который составляет 0,5 мкг / мл. 50 мклэто рабочий стандарт вводится в высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке на сумму 5 нг каждого компонента, кроме триптофана, который составляет 25 нг. - Определение допамина восстановления в пример аликвоту:
Есть несколько шагов, чтобы определить допамина восстановления образца аликвоту. - Во-первых, разделить допамина высота пика образца допамина высоте пика стандарта и умножим это соотношение по количеству (нг) допамина в стандарте. Наша стандартная концентрация допамина составляет 0,1 нг / мкл и 50 мкл стандарта анализировали. Таким образом, количество допамина в стандарт 5 нг. Таким образом, уравнение ниже могут быть использованы для восстановления определяется допамина в данном примере:
(Дофамин высота пика в образце / дофамин высота пика в стандартном) * 5 нг - Исправление потери примера с использованием внутреннего стандарта N-метил дофамина:
Фактическое восстановление N-метил допамина рассчитывается таким же образом, как допамин путем деления N-метил допамин высота пика в образце N-метил допамина высота пика стандарта и умножая это соотношение по количеству (нг) N-метил допамина в стандарте. Как и допамин, наш стандарт N-метил допамина концентрации 0,1 нг / мкл. 50 мкл стандарта анализировали. Таким образом, количество N-метил допамина в стандарт 5 нг. Таким образом, уравнение ниже, может быть использована для определения N-метил допамина восстановление в данном примере:
(N-метил допамина высота пика в образце / N-метил допамина высота пика в стандартном) * 5ng
Однако, так как N-метил допамина в каждом образце происходит не от самого образца, а из буфера ВЭЖХ, количество N-метил допамина ожидать в каждом образце вычисляется. N-метил дофамина в ВЭЖХ буфера составляет 20 нг / мл и 0,02 нг / мкл, так ожидаемого количества N-метил допамина в каждом образце определяется умножением N-метил дофамина в буфер высокоэффективной жидкостной хроматографии в объеме аликвоту каждого образца для HPLC анализа. Это показано в приведенном ниже уравнении:
(0,02 нг / мкл) * (аликвоту объем выборки для анализа HPLC) - Разница между ожидаемым и восстановления N-метил дофамина может быть использована для коррекции на количество допамина восстановлены настройки для любого образца потеря. Просто возьмите соотношение ожидаемой N-метил допамин / восстановления N-метил дофамина и умножить это на количество допамина восстановлены. Таким образом, общее уравнение для количества допамина в образце аликвоту приведены ниже:
(Дофамин высота пика в образце / дофамин высота пика в стандартной комплектации) * (N-метил допамина высота пика в стандартном / N-метил допамина высота пика в образце) * (0,02 нг / мкл) * (аликвоту объем пробы для ВЭЖХ ) - Всего допамина оправился от образца:
Значение допамина оправился от образца аликвоту затем используется для экстраполировать общее количество допамина в данном образце. Это делается путем деления суммы восстановленного (нг) ое DA на аликвоты объемом и умножив это число на объем буфера высокоэффективной жидкостной хроматографии, что образец был ультразвуком дюйма Это задается уравнением ниже:
(Количество (нг) допамина в пример аликвоту / объем выборки аликвоту) * (Объем буфера высокоэффективной жидкостной хроматографии, в котором образец ультразвуком).
Мы отсылаем читателя к следующей исследования 2,4,10 всеобъемлющего представления оценки дофамина и его метаболитов в сочетании с показаниями от допамина регулирующие белки не только СН и ВТА, но стриатуме и прилежащем ядре, а также.
3. Анализ тканей: Всего нормализации белка и финал TH и DAT Результаты
- Поместите осажденного гранулы белка (полученных в результате обработки буфера ВЭЖХ) на льду для поддержания 4 ° C. Убедитесь, что все буфера был удален и архивных (если подтверждающего анализа не требуется). Если SN или ВТА будет обработан двусторонней (крыса только), добавить 300 мкл (SN) или 200 мкл (ВТА) в размере 1% SDS, содержащем 5 мМ трис (рН 8,3) и 1 мМ ЭДТА в гранулах и разрушать ультразвуком. Добавить 150 мкл раствора SDS С.Н. гранул или 100 мкл в VTA гранулы, если обработка ткани от односторонних вскрытия.
- Поместите образцы в ближайшее кипящей воде в течение ~ 5 минут денатурации белка и дать остыть до комнатной температуры. Убедитесь, крышки надежно удерживается на этот шаг.
- Определить концентрацию белка в образцах помощью анализа ДПС, в том числе белков стандартной кривой (альбумин стандарт) от 2 - 40 мкг белка. Анализ 5 мкл образца в трех экземплярах и использовать среднее значение, чтобы определить количество белка от стандартной кривой. Разделить на тома для анализа концентрации белка. Отметим, это первый из двух шагов для нормализации общего TH, DAT, и VMAT2 результаты полного восстановления белков.
- Подготовить образцы с образцами буфера (содержащего дитиотреитола) для снижения SDS-электрофореза в 10% акриламида гELS. В идеале, окончательное общей концентрации белка должно быть ~ 2 мкг / мкл. Причина такой концентрации выбора заключается в снижении объема образца необходимо для окончательного определения TH фосфорилирования, а ~ 100 мкг общего белка потребуется для загрузки точно количественно ser31 и ser40 TH фосфорилирования. Если желтый цвет наблюдается в образце после добавления буфера образца, выборка слишком кислым. Добавьте 1 М Трис (рН 8.2) в 10 мкл шагом, пока синий цвет восстанавливается.
- Подготовка образцов следующим по следующим определениям допамин регулирующие белки:
- TH: Против калиброванный стандарт TH белка (в нг), концентрация ТД (по состоянию на нг TH на общий белок мкг) в SN ожидается в пределах от ~ 0.05-0.27 нг TH на мкг общего белка 2,4, 7,10,11. Против линейного TH стандартной кривой, начиная от 0,5 - 5,0 нг TH и использования первичных антител к TH (Millipore кат # AB152, разведение 1:1000 в ПВП T-20 Блокирование решения), которая производит линейные стандартной кривой, оптимальная нагрузка общего белка от SN должна быть ~ 10 мкг. Концентрация ТД в VTA колеблется от ~ 0,4 до 1,0 нг TH в 4,11 мкг белка. Таким образом, общая нагрузка белка для ВТА должна быть ~ 5 мкг.
- DAT: относительное количество DAT в SN или ВТА значительно меньше, чем в родственных терминал поле регионах стриатуме и прилежащем ядре 4. Относительное выражение DAT, как нормированная на восстановленные TH белка также значительно ниже, СН и ВТА. Таким образом, белок нагрузки для количественной DAT белка в SN или VTA должны быть намного больше по сравнению с образцом нагрузок концевых участках поля. Не менее 30 мкг общего белка необходимо для точности оценки DAT в ВТА и номинальной нагрузке 50 мкг общего белка является необходимость оценки в SN. Первичных антител используется Санта-Крус, кот # SC-1433.
- VMAT2: выражение VMAT2, Как нормированная на общий белок, больше в mesoaccumbens чем нигростриатной регионах. Тем не менее, по сравнению с TH выражение, VMAT2 выражении наибольший в SN и наименее в стриатуме 4. Использование Санта-Крус-кошка # SC-15314, номинальная общая нагрузка белка ~ 40 мкг быть лучше для количественного VMAT2.
- Запустите соответствующее количество общего белка с помощью SDS-PAGE на 10% геля акриламида. Bio-Rad Превращение II электрофореза блок используется для определения, что является большой формат геля. Трансфер на белки пор 0,45 мкм нитроцеллюлозы размера. Для передачи танка Hoeffer установлено не менее 27 вольт позволяет передавать состоится в течение ночи.
- Дайте высохнуть кляксы по крайней мере 30 минут, а затем пятно раствором Понсо S (1% Понсо S в 5% ледяной уксусной кислоты) в течение ~ 5 минут. Де-пятно энергично с 0,2%-ным раствором соляной кислоты до отдельных белковых полос четко решить и фон окрашивания удаляется. Получить изображение Понсо S пятноING использование изображения J дальнейшего количественного относительной нагрузки белка в каждом переулке и нормализовать TH, DAT, или VMAT2 результаты (рис. 3).
4. Ткань Анализ конкретных участков фосфорилирования TH
Фосфорилирования TH в ser31 или ser40 может увеличить L-ДОФА биосинтеза в клетках катехоламинергической 12. Хотя количество фосфорилирования на каждом участке необходимо увеличить L-ДОФА биосинтеза в дофаминергических областях мозга, как СН и ВТА не установлено, есть свидетельства, что ser31 фосфорилирование играет важную роль в регулировании L-ДОФА биосинтез 10 и совместно с Д. колеблется ткань содержания среди стриатуме, прилежащем ядре, С. Н., 2 ВТА, 10. Тем не менее, включение ser40 определения необходимых, как показывают многочисленные исследования показывают, это может повлиять на деятельность TH, особенно, если порог фосфорилирования достигло 12.
Хотя ser19 phosphorylatiна не влияет на активность TH только 13,14, можно считать дозорных для Ca 2 +-зависимой сигнализации в DA нейронов, учитывая, что внеклеточный Са 2 + необходимо увеличить ser19 фосфорилирования под деполяризующего условиях 12. Кроме того, существует значительная положительная корреляция ser19 фосфорилирования с ser31 фосфорилирования только в СН и ВТА 10, означающее, что ser19 фосфорилирования статус может повлиять на ser31 фосфорилирования, и таким образом косвенно L-ДОФА биосинтеза.
Пример нагрузки соображений оптимального количественного сайт-специфических TH фосфорилирования стехиометрии: Ниже, соображения, необходимые для точного определения и точной сайт-специфических TH фосфорилирования в тканях расчлененный представлен. Когда это возможно, калиброванный стандарт TH фосфорилирования должны быть включены в оценку образца фосфорилирования TH. Образец нагрузки необходимо принимать во соотвount присущие стехиометрии на каждом фосфорилирования сайта, так что анализ количественно фосфорилирования в динамический рабочий диапазон антитела используются. В качестве последнего замечания, присущие общего белка, поступающих в анализе для каждого образца должно быть также загружены в стандартной полосы кривой. Это легко достигается с белком-носителем (например, печени крысы), которые не выражают TH.
- . ser19 из трех сайтов фосфорилирования, ser19 уровня фосфорилирования стехиометрии являются наибольшими в СН и ВТА, в пределах от 0,15 - 0,25 2,10,11. Рассмотрение других в том, что наши методы обнаружения, ser19 пс количественно в линейном диапазоне от 0,5 до 5,0 нг фосфора ser19 10. Учитывая эти соображения, общая нагрузка белка TH между 5 и 10 нг (что дает примерно 0,75 - 2,5 нг фосфора ser19 от образца) обеспечит надежную меру ser19 TH фосфорилирования. Мы используем Phosphosolutions первичной (кат. # p1580-19) в разведении 1:1000.
- . ser31 ser31 уровня фосфорилирования стехиометрии сравнительно меньше, СН и ВТА по сравнению с их родственными терминал поле регионов, начиная от ~ 0,04 - 0,10 2,4,10,11. По нашим метод обнаружения ser31 пс обнаружен в линейном диапазоне между 0,5 и 7,0 нг фосфора ser31 10. Учитывая эти соображения, общая нагрузка белка TH между 10 и 30 нг (что дает примерно 0,50 - 3,0 нг фосфора ser31 от образца) обеспечит надежную меру ser31TH фосфорилирования. См. рисунок 4А для примера ser31 количественное. Наша основная антител в доме аффинно очищенных антител, которые были изготовлены по 21-м веке биопрепаратов (Бостон, Массачусетс), а также для проверки специфичности фосфорно-эпитоп используя наши внутренние стандарты 2.
- ser40 ser40 фосфорилирования стехиометрии уровней СН и ВТА в диапазоне от 0,02 -. 0,06 2,4,10,11. По нашим метод обнаружения, сer40 пс обнаружен в линейном диапазоне от 0,2 до 2,0 нг фосфора ser40 10. Учитывая эти соображения, общая нагрузка белка TH между 10 и 30 нг (что дает примерно 0,20 - 1,8 нг фосфора ser40 от образца) обеспечит надежную меру ser40TH фосфорилирования. См. рисунок 4B для примера ser40 количественное. Мы используем Phosphosolutions первичной (кат. # p1580-40) в разведении 1:1000.
5. Представитель Результаты
- Допамин в SN против ВТА Существуют три показания допамина (или метаболиты), которые могут быть приняты в количественном анализе,. Как в общем оправился от вскрытия, на белок, и в ТД белка (продемонстрирована стриатуме С.Н., прилежащем ядре, а ВТА в таблице 1 ниже). Полное восстановление допамина между СН и ВТА достаточно сопоставимыми, в диапазоне от 6-9 нг на два-три короны вскрытия часть 2. Нормализация допамина восстановления общего белка покажет тхат, основанные на вскрытии применяемого метода, что ВТА будет больше дофамина в общий белок, в среднем 6-8 нг / мг белка в SN и 9-10 нг / мг белка в 2 ВТА, 4. Наконец, нормализация дофамина в общей TH восстановления также должны выявить разницу между СН и ВТА, будучи больше в VTA 10, а в диапазоне между 0,2 и 0,8 нг допамина в нг TH белка между двумя регионами 2,10.
Д.А. области Всего DA восстановления DA мг белка DA в нг TH полосатое тело 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 С.Н. 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Nucleus переменного токаcumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Всего белков: TH, DAT, VMAT2 помощью калиброванного стандарт TH белка для количественного определения, более TH восстанавливается в SN, чем ВТА от вскрытия (60 нг в SN и 26 нг в ВТА 2). Однако, когда нормированная на белок, это меняет отношения с ТД на общий белок в VTA составляет ~ 3 - 5 раз больше, чем в С. Н., (~ 0,32 нг / мг белка в ВТА и ~ 0,09 SN) 4 10.
Ожидаемое восстановление DAT в СН и ВТА похоже, с чуть более восстановления в ВТА в соответствии с общего белка или, как в общем TH восстановления 4. Примечательно, DAT белка гораздо менее распространены в этих регионах по сравнению с родственными терминал поле регионов 4 VMAT2 восстановления в соответствии с общего белка больше в ВТА по сравнению с СН 4. Однако, когда нормированная на TH белка, есть немного больше, восстановление SN 4. - Сайт-специфическая фосфорилирования TH В ряде исследований, были устойчивые результаты в ser19, ser31 и ser40 фосфорилирования количество в СН и ВТА, а также в связи с родственными регионами поле терминала. Ser19 фосфорилирования заметно больше в СН и ВТА (~ 0,2-0,3) по сравнению с стриатуме и прилежащем ядре (~ 0,05-0,15) 2,4,7,10,11. Ser31 фосфорилирования значительно меньше, в СН и ВТА по сравнению с их родственными регионами поле терминал, являющийся ~ 0,06 - 0,10 между этими регионами somatodendritic 2,4,7,10,11. Во время торможения ароматические кислоты декарбоксилазы с NSD-1015, есть 2-кратным увеличением ser31 фосфорилирования в ВТА лишь 10. Ser40 фосфорилирования колеблется между 0,02 и 0,05 в SN иВТА и в целом это стехиометрии существенно не отличаются от родственных терминал поле регионах 2,4,7,10,11.
Рисунок 1. Дофаминергической показаний от одной ткани вскрытия.
Рисунок 2. Вскрытие Техника для изоляции мозга дофаминергических нейропиля. Техника для рассечения черной субстанции (SN) с вентральной области покрышки (VTA). 1. Удаление коры и гиппокампа вышележащих (эти структуры уже были удалены на изображении выше). 2. Сделайте вертикальный разрез отделения пигментированные области С.Н. от ВТА. 3. Сделать горизонтальный разрез на или вблизи средней линии чуть выше спины и боковых большая часть SN. 4. Дразните С.Н. от остальной части мозга. После С.Н. был удален, как и дразнить ВТА отОстальная часть мозга. Замечание: этот раздел, как правило, наблюдается в точке с координатами, по сравнению с темя, в AP 5.7.
Рисунок 3. Второй (и последний) нормализация общей окраски белка нагрузки Понсо S для анализа изображений J. Белка Понсо S окрашивания определения общего TH крыс образцы субстанции черная. Первые пять полос образуют слева, стандартная общая кривая TH, в которых 28 мкг белка из гомогената печени крыс был добавлен в зеркало белковой нагрузки от субстанции образцы черная. Следующая полоса содержит молекулярный вес (MW) маркеров. Остальные полосы содержат ~ 28μg белка из крыса черная субстанция образцы. Белок нагрузки на основе концентрации белка каждого образца определяется методом BCA. Однако, несмотря на то, что должны быть равные нагрузкам, существуют различия в темноте окрашивания Понсо S между образцов указывает на небольшоеизменчивости концентрации белка, который корректируется по нормализации использования ImageJ анализа для анализа количество окрашивания Понсо S для каждого образца.
Рисунок 4. Представитель TH фосфорилирования результатов контроля и лечения. Представитель ser31 фосфорилированных тирозингидроксилазы (ПТГ) и ser40 ПТГ Западной пятна от солевой и метамфетамин крыс Вистар с предыдущим исследованием 4. А. сер 31 ПТГ у крыс образцы субстанции черная. калиброванный сер 31 ПТГ стандартный диапазон кривой от 0,3 нг до 2,0 нг и находится в линейной дальности обнаружения. Основываясь на предыдущих Вестерн-блот анализе всех уровней й, 6-нг от общего числа TH были загружены для каждого образца. B. ser40 ПТГ у крыс вентральной покрышки образцов. калиброванный ser40 ПТГ стандартный диапазон кривой от 0,2 нг до 1,5 нг и находится в линейной дальности обнаружения. Основываясь на предыдущих Вестерн-блот анализе всех уровней й, 9-нг от общего числа TH были загружены для каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как указано на рисунке 1, описанные выше методы должны дать показания нескольких дофамина и его регулирующие белки TH, DAT, и VMAT2 от одного образца СН или VTA получены либо из крысы или мыши. Опять же, выгоды от проведения этого протокола в том, что следователь может получить оперативно подобранные показания о том, как допамин регулируется в естественных условиях практически в любой экспериментальной парадигмы и, тем самым, значительно сэкономить экспериментальных ресурсов за счет сокращения числа животных, необходимых в любой эксперимента.
Это абсолютно необходимо, чтобы следователь наблюдения за температурой требованиям, предъявляемым при вскрытии (4 ° С), хранение тканей (по крайней мере -70 ° C), ткань ультразвуком (непосредственный ультразвука после отстранения от температуры хранения) в ледяной буфера и высокоэффективной жидкостной хроматографии последующего формирования гранул и переработки. После того, осадок обрабатывают ультразвуком и кипятят в растворе SDS, образцы могут оставаться Фюртэ обрабатываются при комнатной температуре. Хранение архива ВЭЖХ анализируемого образца и образца буфера подготовленных образцов для анализа белков должно быть при температуре -80 ° C.
Опять же, основным преимуществом протокола является врожденной подход к оперативно-результаты матчей, относящихся к регулированию допамина в естественных условиях. Кроме того, допамин нормализации показаний ткани маркеров дофаминергической нейропиля (TH, DAT) обеспечивают большую степень уверенности, что следователь рассечения SN или VTA с точностью и аккуратностью. Принимая во внимание участие дофамина в зависимость, психические расстройства, и опорно-двигательного арен, этот протокол может быть использован во многих экспериментах. Одним из заметных ограничений в том, что интерпретация результатов TH фосфорилирования должно быть консервативным, так как не известно, на данный момент, в какой степени увеличение фосфорилирования в ser31 или ser40 требуется в естественных условиях увеличения L-ДОФА биосинтеза. Однако, как уже упоминалось, есть еidence что ser31 фосфорилирования появляется регулировать L-ДОФА биосинтеза и играет важную роль в регуляции общего содержания дофамина в тканях центральной нервной системы 2,10. В настоящее время стандарты белка и TH TH фосфорилирования не на коммерческой основе. Тем не менее, эта лаборатория сохранить и расширить такие стандарты, основанные на те, которые используются при первой работе по TH фосфорилирования регулирования в естественных условиях была опубликована 11. Тем не менее, можно нормализовать содержание дофамина в тканях восстановления TH белка в этих дискретных областей с помощью этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансирование этой работы, а также привел 2,10, была представлена, в частности, на исследование предоставляет гранты на MF Сальваторе от Американской федерации по проблемам старения исследований, Эдвард П. Stiles Целевого фонда и фонда биомедицинских исследований Северо-Западной Луизианы, и BS Pruett от Айк Muslow Predoctoral стипендий, ЛГУ Health Sciences Center-Шривпорт.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
|||
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
|||
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
|||
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
|||
Pump: Shimadzu LC-10AD |
|||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
|||
| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
|||
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
|||
References
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
