Summary
कीट hemocytes कई महत्वपूर्ण कार्य, कीट विकास के सभी चरणों के दौरान दोनों प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा, ले. हमारे hemocyte प्रकार और समारोह के वर्तमान ज्ञान कीट आनुवंशिक मॉडल पर अध्ययन से आता है. यहाँ, हम निकालने, बढ़ाता और जंगली कैटरपिलर से hemocytes visualizing के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
कीट hemocytes (स्तनधारी सफेद रक्त कोशिकाओं के बराबर) एक कीट के जीवन चक्र के दौरान 1 कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. Lepidoptera (पतिंगे और तितलियों) और Diptera (सच मक्खियों) के आदेश से संबंधित कीड़ों के लार्वा चरणों में, hemocytes लसीका ग्रंथि (एक विशेष hematopoietic अंग) या भ्रूण कोशिकाओं से गठन कर रहे हैं और वयस्क मंच के माध्यम से किया जा सकता है. भ्रूण hemocytes सेल प्रवास में सूजन के दौरान विकास और chemotaxis विनियमन के दौरान शामिल हैं. उन्होंने यह भी सेल apoptosis में भाग लेने के लिए और 2 embryogenesis के लिए आवश्यक हैं. Hemocytes कीट सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सेलुलर हाथ है कि सेल प्रसार, सेल एकत्रीकरण, पिंड का गठन, phagocytosis और विदेशी 3 आक्रमणकारियों के encapsulation के रूप में कई कार्यों, शामिल मध्यस्थता. उन्होंने यह भी जनसंपर्क के रूप में इस तरह के संक्रमण के दौरान विशिष्ट कीट humoral गढ़ orchestrating के लिए जिम्मेदार है,रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और अन्य effector 4 अणुओं, 5 की oduction. Hemocyte आकारिकी और समारोह मुख्य रूप से आनुवंशिक या शारीरिक कीट मॉडल में अध्ययन किया गया है, फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 6, 7, मच्छरों एडीज aegypti और एनोफ़ेलीज़ gambiae 8, 9 और तम्बाकू hornworm, Manduca Sexta 10, 11 सहित. हालांकि, थोड़ी जानकारी वर्तमान में विविधता, वर्गीकरण, आकृति विज्ञान और गैर मॉडल कीट प्रजातियों, विशेष रूप से उन जंगली 12 से एकत्र hemocytes के समारोह के बारे में मौजूद है.
यहाँ हम जंगली कैटरपिलर से hemocytes निकालने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन. हम अंत से पहले instar Lithacodes fasciola (पीले कंधों काउंटर कीट) (1 चित्रा) और (काँटेदार ओक काउंटर) Euclea delphinii कैटरपिलर (Lepidoptera: Limacodidae) का उपयोग करते हैं और पता चलता है कि hemolymph (कीट रक्त की पर्याप्त मात्रा में)अलग किया जा सकता है और व्यक्तिगत लार्वा से hemocyte संख्या गिना. कुशलतापूर्वक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य संबंधित lepidopteran क्षेत्र से काटा कैटरपिलर में इन प्रजातियों में hemocyte प्रकार का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है, या यह प्रतिरक्षाविज्ञानी माइक्रोबियल या परजीवी 13 जीवों के साथ संक्रमण के बाद hemocyte समारोह की जांच के लिए बनाया गया assays के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है.
Protocol
1. माल की तैयारी
- सुइयों (1-2 सुक्ष्ममापी टिप और 3-4 मिमी शंकु) borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब और एक micropipette डांड़ी का उपयोग कर तैयार है. साधन सेटिंग्स: रैंप: 561, वेग: 20, गर्मी: 560, देरी: 1; पुल: 100; दबाव: 500.
- ग्रेस (जीएम) मध्यम भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का 10% और anticoagulant बफर के 20% (98 मिमी NaOH, 186 मिमी NaCI, 1.7 मिमी EDTA और 41 मिमी साइट्रिक एसिड, पीएच 4.5 के साथ पूरक 60%: संग्रह समाधान तैयार ). ऊपर समाधान बाँझ शर्तों के तहत नए सिरे से तैयार किया जाता है और हर समय पर बर्फ पर रखा.
- जीएम के 90% FBS के 10% के साथ पूरक: ऊष्मायन बफर समाधान तैयार करें. यह समाधान भी नए सिरे से तैयार किया जाता है और हर समय पर बर्फ पर रखा.
- कम से कम 15 μl कुल × दोनों संग्रह और ऊष्मायन समाधान के लिए कीड़ों की संख्या तैयार.
2. संग्रह समाधान के साथ कैटरपिलर इंजेक्शन
- अंत से पहले भारतीय नौसेना पोत anesthetizeउन्हें hemocyte निकासी के लिए पहले 20 मिनट के लिए बर्फ पर द्रुतशीतन राल लार्वा.
- टयूबिंग है कि एक 20 मिलीलीटर कांच सिरिंज (2 चित्रा) से जुड़ा है में एक स्वच्छ केशिका सुई (16 गेज) की कुंद अंत फ़िट. संग्रह समाधान युक्त प्रयोगशाला बेंच पर खुला और धीरे धीरे बफर के साथ केशिका भरने के ट्यूब छोड़ दें. आमतौर पर केशिका संग्रह समाधान के लगभग 10-15 μl से भरा है, कमला के आकार पर निर्भर करता है (लगभग 1 कमला शरीर के कुल द्रव्यमान का 10 मिलीग्राम प्रति μl समाधान = कुल शरीर द्रव्यमान का 0.01%). विदारक माइक्रोस्कोप बगल में रखा गया है मिट्टी की एक गेंद पर सुई आराम करें.
- कमला एक पेट्री डिश में रखें. कीट अपने पक्ष पर तैनात किया जाना चाहिए ताकि spiracles स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 3).
- जबकि एक विदारक खुर्दबीन के नीचे देखने, संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में कमला और पकड़ spiracles की, एक सुई पास जगह जहांसंप्रदाय छल्ली आम तौर पर नरम है. धीरे कीट के शरीर के खिलाफ केशिका सुई दबाएँ. एक बार सुई छल्ली प्रवेश कर गया है, कमला (3 चित्रा) में समाधान की कुल मात्रा इंजेक्षन. यह कमला में हवाई बुलबुले इंजेक्शन लगाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. कमला शरीर (उदाहरण के लिए, 20% तक की मात्रा में वृद्धि) इंजेक्शन के बाद प्रफुल्लित लेकिन फट कीचड़ नहीं होना चाहिए या जाएगा.
- बर्फ कमला लौटें, कीट पृष्ठीय स्थिति घाव (3 चित्रा) से बाहर लीक से बफर को रोकने के.
- दोहराएँ प्रत्येक hemolymph निकासी के लिए इस्तेमाल किया कमला के लिए 2.1-2.4 कदम. इस स्तर पर, सभी कीड़ों बर्फ पर आगे बढ़ने से पहले 30 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं.
3. Hemocytes का निष्कर्षण
- विदारक खुर्दबीन के नीचे एक पेट्री डिश में कमला रखें.
- कमला के पीछे क्षेत्र में एक उथले चीरा (2-3 मिमी लंबे) एक बाँझ scalpe का उपयोग एल (3 चित्रा). देखभाल करने के लिए पेट या अन्य आंतरिक अंगों को नुकसान नहीं, लक्ष्य छल्ली ध्यान पंचर है और बफर / hemolymph व्यक्तिगत कीड़ों से युक्त hemocytes मिश्रण इकट्ठा.
- कमला धीरे निचोड़ लचीले प्लास्टिक संदंश का उपयोग करते हुए एक 10 μl विंदुक टिप के साथ hemolymph मिश्रण (लगभग 10-20 μl) एकत्रित करना, फिर से देखभाल करने के लिए आंतरिक ऊतकों (3 चित्रा) घायल नहीं. Hemolymph कमला शरीर से निचोड़ा छोटी बूंद से एकत्र किया जाता है. त्यागें कमला बनी हुई है.
- अलग लेबल siliconized 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक व्यक्ति कमला से hemolymph ले लीजिए.
- प्रत्येक hemolymph एक व्यक्ति कमला से एकत्र नमूना ऊष्मायन समाधान के बराबर मात्रा (लगभग 10-20 μl) जोड़ें. सभी समय पर बर्फ पर hemolymph के नमूने रखें.
- दोहराएँ प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल कमला के लिए 3.1-3.5 कदम.
- Hemolymph नमूना मिश्रण और ऊष्मायन गिनती hemocytes से पहले तुरंत समाधान. यह उपचार hemocytes की उचित जुदाई के लिए अनुमति देता है और clumping रोकता है.
- Hemolymph नमूना के 10 μl एक hemocytometer पर ऊष्मायन समाधान के साथ मिश्रित हस्तांतरण के लिए एक साफ विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए.
- एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग गिनती, और कम से कम बड़े वर्ग के (एक वर्ग के क्षेत्र में 0.1 मिमी: 0.04 2 मिमी, गहराई) 15 में hemocytes की संख्या रिकॉर्ड के केंद्रीय ग्रिड hemocytometer (3 चित्रा) की. 15 चौकों में hemocytes की संख्या की कुल राशि प्राप्त करने के लिए इन मूल्यों को जोड़ें.
- कुल्ला hemocytometer और उसके कवर स्लाइड अच्छी तरह से आसुत और विआयनीकृत जल के साथ एक धोने की बोतल का उपयोग करें और प्रत्येक नमूने के बीच Kimwipes (Kimberly-क्लार्क) के साथ सूखी पोंछ.
- दोहराएँ प्रत्येक hemolymph नमूना के लिए 4.1-4.4 कदम.
- Hemolymph volum मिलीलीटर प्रति hemocytes का मतलब संख्या की गणनाप्रत्येक कमला के लिए ई, के रूप में इस प्रकार है:
Hemocytometer ग्रिड के प्रत्येक वर्ग की कुल मात्रा: (0.04 मिमी 2 क्षेत्र) × (0.1 मिमी गहराई) = 0.004 3 मिमी × 15 चौकों = 0.06 3 मिमी = सभी 15 गिना वर्गों की कुल मात्रा.
(15 / गिना सभी 15 वर्गों की कुल मात्रा में गिना वर्गों में hemocytes की कुल संख्या का योग) x 2 कमजोर पड़ने कारक = hemocytes / 3 मिमी की संख्या 1,000 x = hemocytes / hemolymph मिलीलीटर की संख्या.
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Representative Results
यहाँ बताया प्रोटोकॉल व्यक्ति कैटरपिलर से कीट hemolymph की 10-20 μl की एक न्यूनतम मात्रा के संग्रह की अनुमति देता है. इस पद्धति का उपयोग करके एकत्र Hemocytes सेल clumping, melanization दोष, ऊतक मलबे या अन्य contaminants से मुक्त हैं. इसलिए hemocytes आसानी से हो सकता है और देखा जा खुर्दबीन के नीचे गिना, और कई कीड़ों कुछ होसुर के भीतर देखा जा सकता है. हमने पाया है कि हमारे नमूने में hemocytes के बहुमत 3 plasmatocytes (hemocytes asymmetrically प्रसार) (चित्रा 4) शामिल है. वर्तमान में हम अलग hemocyte विस्तार (Stoepler एट अल, अप्रकाशित डेटा) में इन कैटरपिलर में पाया प्रकार निस्र्पक रहे हैं. यहाँ वर्णित विधि व्यक्तिगत क्षेत्र प्रयोगों से एकत्र कैटरपिलर के लिए कुल hemocyte संख्या की गिनती करने के लिए एक त्वरित और सटीक साधन प्रदान करता है.
है हालांकि hemocyte घनत्व बहुत बीच और कीड़ों की प्रजाति के भीतर भिन्न हो सकते हैं 1 </> समर्थन, हमने पाया है कि एल hemocyte संख्या fasciola कैटरपिलर 1.10 से रेंज × 6 10 - 8.23 × 10 6 कोशिकाओं / hemolymph मिलीलीटर (माध्य: 3.51 × 6 10, n = 31 कैटरपिलर), और पहले की रिपोर्ट अन्य lepidopteran 14 प्रजातियों में मूल्यों की रेंज में हैं.
चित्रा 1 एक अंत से पहले instar Lithacodes (Lepidoptera: Limacodidae) fasciola कमला की तस्वीर. इन caterpillars के विशिष्ट शरीर की लंबाई परम instars के लिए अंत से पहले 10-15 मिमी से लेकर. फोटो क्रेडिट: जॉन टी. Lill.
चित्रा 2 इंजेक्शन सुई सेटअप. एक गिलास सिरिंज एक कुंद अंत सुई और प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से एक केशिका सुई से जुड़ा है (1-4 पैनल). प्लास्टिक मिट्टी का एक टुकड़ा केशिका सुई (5) को आराम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कमला एक पेट्री डिश में संग्रह समाधान (6) के साथ इंजेक्शन के लिए रखा गया है.
चित्रा 3 Hemocyte निष्कर्षण विधि. (क) ठंडा कमला संग्रह समाधान के साथ इंजेक्ट किया जाता है, (ख) निम्नलिखित इंजेक्शन, कमला शरीर थोड़ा फूल, और इंजेक्शन कीट को 30 मिनट के लिए बर्फ पर आराम करने के लिए अनुमति दी है, (ग, घ) एक कट का उपयोग किया जाता है एक साफ स्केलपेल, कमला प्लास्टिक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए hemolymph चीरा के माध्यम से शरीर के बाहर मजबूर निचोड़ा है, और hemocytes एक विंदुक के साथ एकत्र कर रहे हैं, (ई) hemocytes एक hemocytometer गिनती का उपयोग कर रहे हैं.
चित्रा 4 माइक्रोस्कोपी pi.कैटरपिलर (बढ़ाई: 20x): Euclea delphinii (Limacodidae Lepidoptera) से निकाले hemocytes दिखा cture.
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Discussion
चिकित्सकीय महत्वपूर्ण कीड़े और lepidopteran मॉडल कीड़े से hemocytes निकालने के लिए तरीके पहले 9, 14 बताया गया है. Hemocyte निष्कर्षण तरीकों कीट प्रजातियों के अनुसार अनुकूलित कर रहे हैं, कीट और उसके morphological विशेषताओं के विकास के चरण. उदाहरण के लिए, Manduca लार्वा से अलगाव hemolymph 15 पेट के अंत के पास घुमावदार सींग snipping द्वारा आसानी से प्रदर्शन किया जा सकता है. क्योंकि काउंटर कैटरपिलर (Limacodidae) इस पेट की संरचना की कमी है, हम छोटे आकार के क्षेत्र एकत्र कैटरपिलर से hemolymph निकासी के लिए एक अलग प्रोटोकॉल विकसित किया है. इस विधि पर्याप्त hemolymph hemocyte कोशिकाओं की बड़ी संख्या है कि संग्रहीत किया जा सकता है या आगे प्रयोग के लिए कार्रवाई युक्त संस्करणों को अलग करने के लिए कारगर साबित होता है. इसके अलावा, वयस्क मच्छरों से hemocyte संग्रह एक कदम समय लेने वाली है कि पैरों की सावधान हटाने, पंख और 16 पेट की नोक शामिल
हम भविष्य के अध्ययनों में इस पद्धति का उपयोग करने के लिए morphologically वन काटा कैटरपिलर के विभिन्न विकास के चरणों से hemocyte सेल प्रकार विशेषताएँ का इरादा रखते हैं. इस परख भी स्वस्थ hemocytes अलग कीट सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विस्तार में कई शारीरिक पहलुओं hemo की कुल संख्या पर विभिन्न विकास के चरणों और पोषक तत्वों की शर्तों के प्रभाव सहित, की जांच के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम प्रदान कर सकते हैंभोले या संक्रमित उनके प्राकृतिक वातावरण से प्राप्त कैटरपिलर में cytes. Lepidopteran लार्वा की पुरानी प्रकृति में विभिन्न रोगज़नक़ों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने माइक्रोबियल symbionts के संभावित निरंतर उपस्थिति की एक श्रृंखला के लिए जोखिम को देखते हुए, यह अनुमान है कि इन कीड़ों के प्रतिरक्षा प्रयोगशाला पाला में पाया कोशिकाओं की तुलना में अलग गुणों के साथ hemocytes के प्रकार के अधिकारी कीड़े. इसके अलावा, इस hemocyte निष्कर्षण प्रोटोकॉल भी कीड़े के अन्य समूहों के साथ अध्ययन करने के लिए कर सकते हैं लागू किया जा, प्रतिरक्षाविज्ञानी से संबंधित assays पारिस्थितिकी के अध्ययन के क्षेत्र में शामिल करने के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार गैर मॉडल के कीट प्रजातियों में सेलुलर रक्षा तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने या कृषि पारिस्थितिकी महत्व. अंत में, हमारे विधि कीट जीव, ecologists और कार्यात्मक hemocyte बहुतायत और जंगली कीट आबादी की क्षमता के लिए माइक्रोबियल या parasiti सामना के बीच परस्पर क्रिया को समझने में रुचि रखने वालों के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करेगाग संक्रमण.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
टीएमएस Harlan ट्रस्ट फैलोशिप (GWU) द्वारा इस अध्ययन के दौरान समर्थित किया गया. क्षेत्र के संग्रह के लिए अनुदान और एल प्रजनन fasciola और ई. delphinii JTL NSF अनुदान 0642438 देब द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
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