Summary
Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.
Abstract
Hemócitos de insetos (equivalente a mamíferos células brancas do sangue) têm um papel importante em vários processos fisiológicos ao longo do ciclo de vida de um inseto 1. Em estágios larvais de insectos pertencentes à ordem dos lepidópteros (borboletas e traças) e Diptera (moscas verdadeiras), são formados a partir de hemócitos do gânglio linfático (um órgão especializado hematopoiética) ou células embrionárias e pode ser carregado até à fase adulta. Hemócitos embrionários estão envolvidos na migração de células durante o desenvolvimento e a quimiotaxia de regulação durante a inflamação. Eles também participam de apoptose das células e são essenciais para a embriogênese 2. Hemócitos mediar o braço celular da resposta imune inata de insectos, que inclui várias funções, tais como a agregação de células de células difusão, formação de nódulos, e a fagocitose de encapsulamento de invasores estranhos 3. Eles também são responsáveis por orquestrar específicas de insectos defesas humorais durante a infecção, tais como a produção de péptidos antimicrobianos e outras moléculas efectoras 4, 5. Hemócitos morfologia e função têm sido principalmente estudados em modelos genéticos ou fisiológica de insectos, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, os mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e o hornworm tabaco, Manduca sexta 10, 11. No entanto, pouca informação existe atualmente sobre a diversidade, classificação, morfologia e função de hemócitos em espécies não-modelo de insetos, especialmente aqueles coletados de 12 a selvagem.
Aqui nós descrevemos um protocolo simples e eficiente para extrair hemócitos de lagartas selvagens. Usamos penúltimo estádio Lithacodes fasciola (amarelo Traça lesma) (Figura 1) e Euclea delphinii (spiny lesma carvalho) lagartas (Lepidoptera: Limacodidae) e mostram que os volumes suficientes de hemolinfa (sangue do inseto)pode ser isolado e os números contados a partir de hemócitos larvas individual. Este método pode ser utilizado de forma eficiente para estudar tipos de hemócitos nestas espécies, bem como em outras lagartas relacionados colhidas a partir do campo, ou pode ser facilmente combinado com ensaios imunológicos concebidos para investigar a função hemocitária após infecção com micróbios ou parasitas 13.
Protocol
1. Preparação de material
- Prepare agulhas (1-2 ponta fim e cone 3-4 mm) de tubos de vidro de borosilicato capilares e um extrator micropipeta. Configurações do instrumento: rampa: 561, velocidade: 20; calor: 560; atraso: 1; tração: 100; pressão: 500.
- Preparar a solução de recolha: 60% de meio de Grace (GM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 20% de Tampão de anticoagulante (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA e 41 mM de ácido cítrico, pH 4,5 ). A solução acima é preparada em condições estéreis e mantido em gelo em todos os momentos.
- Preparar a solução de tampão de incubação: 90% do GM suplementado com 10% de FBS. Esta solução também é preparada e mantida em gelo em todos os momentos.
- Preparar um total de, pelo menos, 15 ul × o número de insectos para a recolha e as soluções de incubação.
2. Injeção de Lagartas com solução de coleta
- Anestesiar ins penúltimaslarvas de alcatrão por arrefecimento com gelo durante 20 minutos antes da extracção hemocitária.
- Coloque a extremidade romba de uma agulha limpa capilar (calibre 16) para dentro do tubo que está ligado a uma seringa de vidro de 20 ml (Figura 2). Deixar o tubo que contém a solução de recolha de abrir na bancada do laboratório e lentamente encher o capilar pelo tampão. O capilar é normalmente preenchido com aproximadamente 10-15 uL de solução de recolha, dependendo do tamanho da lagarta (cerca de 1 ul de solução por 10 mg de lagarta massa corporal total = 0,01% da massa corporal total). Descanse a agulha em uma bola de argila que é colocado ao lado do microscópio de dissecação.
- Coloque a lagarta em uma placa de Petri. O insecto deve ser posicionada para o lado, de modo que os espiráculos são claramente visíveis (Figura 3).
- Durante a visualização sob um microscópio de dissecação, manter a lagarta no local com um par de pinças e colocar a agulha perto de um dos espiráculos, em que o emcutícula seita é geralmente mais macia. Pressione suavemente a agulha capilar contra o corpo do inseto. Uma vez que a agulha penetrou a cutícula, injectar o volume total da solução para a lagarta (Figura 3). É importante evitar a injecção de bolhas de ar dentro da lagarta. Do corpo da lagarta vai inchar (por exemplo, aumento do volume em 20%) após a injeção, mas não deve estourar ou vaza.
- Retorne a lagarta para o gelo, colocando o inseto dorsalmente para evitar tampão de vazar para fora da ferida (Figura 3).
- Repita os passos de 2,1-2,4 para cada lagarta usada para extração de hemolinfa. Nesta fase, permitir que todos os insectos para arrefecer em gelo durante 30 min antes de prosseguir.
3. Extração de Hemócitos
- Coloque a lagarta em uma placa de Petri com o microscópio de dissecação.
- Faça uma incisão (2-3 mm de comprimento) rasa na região posterior da lagarta utilizando um scalpe estéril l (Figura 3). Tome cuidado para não danificar o intestino ou outros órgãos internos, o objetivo é perfurar a cutícula cuidadosamente e recolher o mix de buffer / hemolinfa contendo hemócitos de insetos individuais.
- Aperte a lagarta delicadamente usando uma pinça de plástico flexíveis ao coletar a mistura hemolinfa (aproximadamente 10-20 ul) com uma ponta de pipeta 10 jul, novamente tomando cuidado para não ferir os tecidos internos (Figura 3). Hemolinfa é coletado da minúscula gotinha do corpo da lagarta. Descartar restos da lagarta.
- Colete hemolinfa de cada indivíduo em separado lagarta rotulados siliconizado 0,5 microtubos ml.
- Adicionar um volume igual de solução de incubação (cerca de 10-20 ul) de cada uma das amostras recolhidas a partir da hemolinfa de uma lagarta individual. Manter as amostras de hemolinfa sobre gelo em todos os momentos.
- Repita os passos de 3,1-3,5 para cada lagarta utilizados no experimento.
- Misturar a amostra e hemolinfa a solução imediatamente antes da incubação hemócitos contagem. Este tratamento permite uma adequada separação de hemócitos e impede aglomeração.
- Usar uma pipeta para transferir limpo 10 ul de amostra de hemolinfa misturado com a solução de incubação para um hemocitómetro.
- Usando um microscópio composto, contar e registar o número de hemócitos em pelo menos 15 dos grandes quadrados (área de um quadrado de 0,04 mm 2, a profundidade: 0,1 mm) da grelha central do hemocitómetro (Figura 3). Adicionar esses valores para obter uma soma total do número de hemócitos nos 15 quadrados.
- Lave o hemocitômetro e seu slide cobertura, cuidadosamente, com um frasco de lavagem com água destilada e deionizada e seque com Kimwipes (Kimberly-Clark) entre cada amostra.
- Repita os passos de 4,1-4,4 para cada amostra de hemolinfa.
- Calcula-se a média do número de hemócitos por ml de hemolinfa volume para cada uma lagarta, como se segue:
O volume total de cada quadrado da grelha de hemocitómetro: (0,04 mm 2 de área) x (0,1 mm de profundidade) = 0,004 mm 3 × 15 quadrados = 0,06 mm 3 = o volume total de todos os 15 quadrados contados.
(Soma de o número total de hemócitos em 15 quadrados contados / volume do total de todos os 15 quadrados contados) x factor de diluição 2 = o número de hemócitos / mm 3 x 1,000 = o número de hemócitos / ml de hemolinfa.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito permite a recolha de um volume mínimo de 10-20 ul de hemolinfa de larvas de insectos individuais. Hemócitos recolhidas utilizando este método são livres de agregação de células, defeitos de melanização, restos de tecido ou outros contaminantes. Portanto hemócitos podem ser facilmente observados e contados sob o microscópio, e vários insectos pode ser observado no prazo de uma Hosur poucos. Observou-se que a maioria dos hemócitos em nossas amostras consistiu de 3 (plasmatócitos hemócitos espalhando assimetricamente) (Figura 4). Estamos actualmente a caracterizar os diferentes tipos de hemócitos encontrados nestes lagartas em detalhe (Stoepler et al., Dados não publicados). O método descrito aqui fornece um meio rápido e preciso para a contagem total de números de hemócitos de lagartas obtidas de experimentos de campo.
Embora a densidade hemócitos podem variar muito entre e dentro de espécies de insetos 1 </ Sup>, descobrimos que os números de hemócitos de L. fasciola lagartas gama de 1,10 x 10 6-8,23 x 10 6 células / ml de hemolinfa (média: 3,51 x 10 6, n = 31 lagartas), e estão no intervalo de valores previamente reportados em outras espécies de lepidópteros 14.
Figura 1 Fotografia de um penúltimo estádio Lithacodes fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Lagarta. Comprimento do corpo típico destas larvas varia entre 10-15 mm na penúltima para estádios finais. Crédito da foto: John T. Lill.
Figura 2. Configuração agulha de injeção. Uma seringa de vidro é ligado a uma agulha capilar através de uma agulha de extremidade romba e tubos de plástico (Os painéis 1-4). Um pedaço de massa de plástico é utilizado para descansar a agulha capilar (5). A lagarta é colocado numa placa de Petri por injecção com a solução de recolha (6).
Figura 3. Método de extracção de hemócitos. (A) A lagarta refrigerada é injectada com a solução de recolha, (b) após a injecção, do corpo da lagarta vai inchar ligeiramente, e o insecto injectado é permitido descansar em gelo durante 30 min, (c, d) é feito um corte através um bisturi limpa, a lagarta é espremida através de um par de pinças de plástico para forçar a hemolinfa para fora do corpo através da incisão e, hemócitos são recolhidos com uma pipeta, (e) hemócitos são contadas utilizando um hemocitómetro.
Figura 4. Pi Microscopiacture mostrando hemócitos extraído de Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) lagartas (aumento de 20x).
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Discussion
Métodos para a extração de hemócitos de insetos de importância médica e insetos lepidópteros modelo foram relatados 9, 14. Métodos de extração de hemócitos são adaptados de acordo com as espécies de insetos, o estágio de desenvolvimento do inseto e suas características morfológicas. Por exemplo, o isolamento a partir da hemolinfa de larvas Manduca pode ser prontamente realizada cortando o chifre curvo perto do fim do abdómen 15. Porque lagartas Slug (Limacodidae) não possuem essa estrutura abdominal, desenvolvemos um protocolo distinto para a extração de hemolinfa de pequeno porte lagartas coletadas em campo. Este método mostra-se eficiente para isolar volumes suficientes de hemolinfa contendo um grande número de células de hemócitos que podem ser armazenados ou processados para experimentação adicional. Além disso, a recolha de hemócitos de mosquitos adultos inclui um passo demorado que envolve a remoção cuidadosa de pernas, asas e a ponta do abdómen 16
Temos a intenção de utilizar este método em estudos futuros para caracterizar morfologicamente os tipos de células de hemócitos de diferentes estágios de desenvolvimento da floresta colhida lagartas. Este ensaio também pode fornecer um primeiro passo crítico para o isolamento de hemócitos saudáveis de analisar em pormenor vários aspectos fisiológicos da resposta imune celular de insectos, incluindo o efeito de vários estágios de desenvolvimento e condições nutricionais sobre o número total de hemocitos em lagartas ingênuos ou infectados obtidos de seus ambientes naturais. Dada a exposição crónica de larvas de lepidópteros a uma gama de patogénios diferentes na natureza, bem como, potencialmente, a presença contínua de seus simbiontes microbianos, antecipa-se que estes insectos possuem tipos de hemócitos com propriedades diferentes em comparação com as células imunes encontrados em laboratório-criados insetos. Além disso, este protocolo de extracção de hemócitos também pode ser aplicado a estudos com outros grupos de insetos, permitindo imunológicas relacionadas com ensaios para ser incorporada em estudos de campo ecológicas, aumentando assim a nossa compreensão dos mecanismos de defesa celular em espécies não-modelo de insectos agrícolas ou ecológica importância. Em conclusão, o nosso método irá fornecer um recurso valioso para os biólogos, ecologistas insetos e aqueles interessados em compreender a interação funcional entre a abundância de hemócitos ea capacidade das populações de insetos selvagens para suportar microbiana ou parasitiinfecções c.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
TMS foi apoiado pela confiança Harlan Fellowship (UGT) durante este estudo. O financiamento para a coleta de campo e criando L. fasciola e E. delphinii foi fornecido pela concessão do NSF DEB 0642438 para JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
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