Summary
Detta protokoll beskriver användningen av ett tangentiellt flöde med ihåliga fibrer ultrafiltrering provkoncentration systemet och en värme dissociation som alternativa steg för påvisande av vattenburna
Abstract
Cryptosporidium och Giardia arter är två av de vanligaste protozoer som orsakar vattenburna diarrésjukdomar sjukdomsutbrott över hela världen. För att bättre karaktärisera förekomsten av dessa patogener, var EPA Method 1623 utvecklas och användas för att övervaka nivåerna av dessa organismer i USA dricksvattenförsörjning 12. Metoden har tre huvudsakliga delar: den första är den provkoncentration vid vilken minst 10 liter rå yta vattnet filtreras. Organismerna och infångas debris elueras därefter från filtret och centrifugerades för att ytterligare koncentrera provet. Den andra delen av den metod använder en immunomagnetisk separation förfarande där den koncentrerade vatten provet appliceras till immunomagnetiska pärlor som specifikt binder till Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia möjliggör för specifikt avlägsnande av parasiter från den koncentrerade skräp. Dessa (OO) cystor därefter lösgörs från de magnetiska pärlorna genom en syradissociering förfaranderandet. Den sista delen av metoden är den immunofluorescensfärgning och räkning var (oo) cystor tillämpas på en bild, betsad och räknas i mikroskop.
Metod 1623 har fyra noterade system provkoncentrationen att fånga Cryptosporidium oocystor och cystor Giardia i vatten: Envirochek filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filter (Pall Corporation), Filta-Max filter (IDEXX, Westbrook, MA), eller kontinuerligt flöde Centrifugering (Haemonetics, Braintree, MA). Har dock Cryptosporidium och Giardia (oo) återvinningar cysta varierade kraftigt beroende på källan vattnet matrisen och filter används 1,14. En ny tangentiell strömning ihåliga fibrer ultrafiltrering (HFUF) system har nyligen visat sig vara effektivare och mer robust att återvinna Cryptosporidium oocystor och Giardia cystor från olika vatten matriser, dessutom är det billigare än andra kapseln filteralternativetS och kan koncentrera flera patogener samtidigt 1-3,5-8,10,11. Dessutom tidigare studier av Hill och kollegor har visat att HFUF signifikant förbättrad Cryptosporidium oocyster återvinningar när direkt jämföras med de Envirochek HV filter 4. Ytterligare ändringar av nuvarande metoder har också rapporterats för att förbättra metoden. Byta syran dissociation förfarandet med värme dissociation visade sig vara mer effektivt att skilja Cryptosporidium från de magnetiska pärlorna i vissa matriser 9,13.
Detta protokoll beskriver en modifierad metod 1623 som använder det nya systemet HFUF filtrering med värme dissociationssteget. Användningen av HFUF med denna modifierade metod är ett billigare alternativ till dagens EPA Metod 1623 filtrering alternativ och ger större flexibilitet genom att tillåta koncentrationen av flera organismer.
Protocol
1. Tangentiellt flöde Ihåliga fibrer Ultrafiltrering arbetsordningen
- Framställning av buffertar och lösningar:
Eluering Lösning (1 liter):
Till 1 liter reagenskvalitet vatten och tillsätt 0,1 polyfosfat g natrium, 0,1 ml Tween-80 och 0,01 ml Y-30 skumdämpningsmedel. - Förbered filteraggregatet (figur 1) i ett biologiskt säkerhetsskåp:
- Sätt Masterflex I / P 73 lab slang genom en Masterflex I / P Easy-Load pumphuset är ansluten till en Masterflex I / P precision borstlös enhet.
- Fästa slangen till en 0-60 psi, glycerol-fylld tryckmätare försedd med ett NPT gren T-anslutning uppströms pumpen huvudet med en skruvklämma, och till en HDPE-T-anslutningen nedströms pumpen huvudet.
- Montera retentatet flaskan genom att passa en Nalgene 53-B fyllning / ventilationslock med Masterflex L / S 15 lab rör och en T-anslutning och fastsättning av den vid en 1 L Nalgene tunga polypropenflaska.
- Montera Masterflex L / S 24 slang wed en nypa klämma (nypa klämma 2) och anslut den från retentatet flaskan till HDPE T-kontakt.
- Anslut Masterflex L / S 24 lab slang från manometern till Asahi Kasei Rexeed 25S high-flux dialysatorn med en skruv klämma, och från dialysatorn till retentatet flaskan. Använd skräddarsydda DIN-adaptrar för att rymma ¼ "ID slang för att ansluta slangen till den ihåliga-fiber ultrafilter.
- Montera Masterflex L / S 24 lab rör med en nypa klämma (nypa klämma 1) och anslut den till en 10 ml plastpipett med spetsen och bomull plug bort för att fungera som provet upptag linjen och sedan ansluta slangen till HDPE T- kontaktdonet.
- Passa en ände av Masterflex L/S-36 lab rör med en ramp klämma och ansluta slangen till utflödet porten placerad nära utgången av filtret. Placera den andra änden i avfallsbehållaren.
- Tillsätt 0,01% (vikt / volym) natriumpolyfosfat till 10 liter vatten provet och blanda under 3 minuter.
- Stäng nypa klämma 2och avlägsna ventillocket från retentatet flaskan. Alla andra klämmor bör vara öppen.
- Ställ pumpen riktningen för att flytta vätska från T-kontakt till manometern (höger till vänster följande figur 1). Justera varvtal till 25% av den maximala hastigheten och slå på pumpen.
- När retentatet flaskan är 2/3 full, öppen nypa klämma 2 och snabbt byta ventilen locket till retentatet flaskan. Kontrollera alla linjer och kopplingar för att säkerställa att det inte finns några läckor.
- Öka pumpens varvtal till önskat filtrationshastighet (cirka 1,5 l / min), leta efter läckage. Användning av en graderad cylinder och en timer eller flödesmätare, kontrollera filtratet hastigheten hos vattnet som kommer ut från utloppet linjen (blå L / S 36 slangen i fig 1). Luftbubblor kan typiskt bildas vid utgångsänden av filtret gör det svårt att uppnå en stabil tryck och filtreringshastigheten. Detta korrigeras genom att klämma utflödet linjen hand för ett ögonblick. Denna åtgärdkommer i allmänhet koax luftbubblan till filtratet hamnen och avsluta via utflödet linjen. Upprepa efter behov, med tanke på att ärt storlek luftbubblor är ofta oundvikliga.
- Övervaka filtreringen. Mäta och registrera det tryck och den filtreringshastigheten efter behov. Trycket får inte överstiga 20 psi. Det rekommenderas att filtreringen inte bör överstiga 2,0 L / min. Det är viktigt att volymen vatten i retentatet flaskan övervakas för att säkerställa att det aldrig tömmer. Det är normalt för volymen att öka eller minska något. Om vattnet volymen i retentatet flaskan faller under 1/3 full och ta sedan bort ventilen locket och nära pinch klämma 2 på retentat flaskan linjen. Ta volymen tillbaka till ca 2/3 full, öppna klämman och snabbt ersätta ventillocket, vilket garanterar en tät förslutning. Om volymen i retentatet flaskan sjunker snabbt och kontinuerligt, sedan se till retentatet flaskan locket är tät och ventilen hatten är säkert på plats, och att Tubing fortfarande är i kontakt med vattenprovet. Om dessa frågor inte förekommer, är det troligt att tätningen i retentatet flaskan locket är dåligt och bör bytas ut.
- När provet behållaren är tom, omedelbart stänga nypa klämma 1, minska pumpens varvtal till 20% av sin maximala, ta bort ventilen locket från retentat flaskan och stäng rampen klämman.
- Justera volymen av provet i retentatet flaskan till ca 200 ml genom att dra åt eller lossa rampen klämman. När volymen är ca 200 ml, dra rampen klämma för elueringssteg (1,11-1,12).
- Tillsätt 500 ml av elueringslösningen till provbehållaren och skölj insidan av behållaren. Placera 10 ml pipett är ansluten till provet upptaget linjen i behållaren som innehåller elueringen lösningen. Säkerställa att rampen klämman är sluten. Öppet nypa klämma 1 och nära nypa plint 2 momentant att utarbeta elueringen lösningen.
- Efter 500 ml elueringslösning upprättasNära nypa klämma 1 och öppen nypa klämma 2. Tillåta elueringslösningen att cirkulera under 5 minuter med en pumphastighet av 20% av dess maximum.
- Justera volymen av provet i retentatet flaskan till ca 100 ml genom åtdragning eller lossande av rampen klämman på utflödesledningen. Dra åt rampen klämman och tillåta provet att cirkulera under 1 minut. Undvik att dra in luft i slangen genom att volymen av provet i retentatet flaskan är tillräckligt hög för att täcka L / S 15 slang in i retentat flaskan.
- Vända riktningen av pumpen, vilket tvingar provet i retentatet flaskan. Tillåta pumpen att köra i motsatt i 20 sekunder resulterar i en totalt ~ 225 ml i retentatet flaskan. Stänga av pumpen.
- Ta bort Masterflex I / P 73 slang från pumpen huvudet och koppla tryckmätaren. Koppla loss Masterflex L / S 24 slang ut ur den ihåliga fibrer ultrafilter. Hålla slangen ovan retentatet flaskan för att tvinga eventuellt kvarvarande provet iretentat flaska.
- Koppla bort alla slangar från flaskan och ersätta avluftningskåpan med en icke-ventilationslock.
- Fortsätt till IMS / IFA procedur med ~ 225 ml retentat.
2. Immunomagnetisk separation Förfarande
- Framställning av buffertar och lösningar:
- Låt buffertar som ingår i Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit för att nå rumstemperatur.
- 1X SL-buffert A: Tillsätt 1 ml 10X SL-buffert A till 9 ml reagenskvalitet vatten.
- Överföra ~ 225 ml vätska från retentatet flaskan till en märkt 250 ml koniskt centrifugrör. Skölj retentat flaskan två gånger med 10 ml reagens vatten och tillsätt sköljningar den koniska centrifugrör. Centrifugera suspensionen vid 1500 xg under 15 min vid 4 ° C utan broms.
- Noggrant aspirera supernatanten från den luft-vatten gränsytan med 5 ml ovanför den packade pelleten för varje 0,5 ml pellet volym (dvs. aspirat till 15 ml ovan en pellet volym av 1,3 ml och aspirera till 5 ml under en pellet av 0,5 ml eller mindre).
- Grundligt suspendera pelleten i supernatanten genom att vortexa och / eller pipett blandning. Överför varje 5 ml volym av vätskan till den platta ensidiga Dynal L10 rör innehållande 1 ml vardera av 10X SL-buffert A och 10X SL-buffert B. Skölj koniskt centrifugrör två gånger med 2,5 ml reagens vatten och tillsätt skölj i i L10 röret, vilket ökar det totala volymen i L10 röret till 12 ml, inklusive buffertar.
- Tillsätt 100 pl vardera av välblandade resuspenderade anti-Cryptosporidium och anti-Giardia Dynabeads till L10 röret. Rotera L10 röret vid 18 rpm under 1 timme vid rumstemperatur på en rotator bländare.
- Placera den platta sidan av L10 röret mot MPC-6 magnet och försiktigt handen Rock the röränden-to-end, 180 ° i 2 minuter.
- Hålla L10 röret i MPC-6 magnet med magneten uppåt, dekantera supernatanten bort från kulan / (oo) cysta komplex bound till magneten. Avlägsna L10 röret från magneten och tillsätt 0,5 ml 1X SL-buffert A till röret. Överföra suspensionen med användning av två sköljningar i 0,5 ml 1X SL-buffert A i en 1,5 ml mikrocentrifugrör hålls i MPC-S med magneten i den vertikala positionen.
- Skaka röret i MPC-S magneten 180 ° under 1 minut. Med magneten på plats, aspirera supernatanten med användning av en Pasteur-pipett riktad mot botten av mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 ml 1X PBS till framsidan av mikrocentrifugrör, ta bort magneten och rocka röret försiktigt bara tills pärlorna återsuspenderas. Ersätta magneten i den vertikala positionen och skaka försiktigt på röret 180 ° under 1 minut. Aspirera PBS sköljning utan att störa pärlpelleten, med användning av en Pasteur-pipett för att avlägsna så mycket skräp som möjligt.
- Avlägsna magneten och tillsätt 50 | il av reagens vatten till den bakre sidan av mikrocentrifugrör. Vortex röret vid full hastighet i 50 sekunder,därefter inkubera röret vid 80 ° C under 10 minuter följt av en 30 sekunders vortex. Ersätta magneten i MPC-S i den lutande positionen, binder pärlorna till en magnet och lämnar (OO) cystor i vätskan. Applicera (oo) cysta suspension till en SingleSpot väl bild.
- Upprepa steg 2,10, applicering av vätska till samma brunn som innehåller den första dissociation. Placera objektglaset på en 37 ° C bild varmare i 1 timme för att torka suspensionen till bilden väl.
3. Färgning och examination
- Framställning av buffertar och lösningar:
Arbetar DAPI-lösning: Tillsätt 25 | il av DAPI stamlösning (2 mg / ml i metanol) till 25 ml 1X PBS. Betesdjur och fungerande lösningar mellan 1 ° C och 10 ° C i mörker. - Applicera 50 pl av metanol till bilden väl och låt den torka vid rumstemperatur.
- Tillsätt 50 pl av den arbetande DAPI-lösning vid sliden brunn och inkubera under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Använd en Kimwipe för att suga av DAPI från brunnen. Tillämpas 50 pl EasyStain. Inkubera vid 35 ° C under 30 minuter.
- Veke fläcken bort och med en Kimwipe, och därefter långsamt 300 | il kall EasyStain fixering buffert, så att den flyter över kanten väl. Inkubera under 2 min vid rumstemperatur.
- Använd en Kimwipe att sugas bufferten från brunnen och tillsätt 10 pl EasyStain Mounting Medium.
- Applicera försiktigt ett täckglas, ta bort eventuella luftbubblor som uppstår. Täta täckglas med tydlig nagellack.
- Skanna hela bilden med hjälp av FITC-filter vid 200 gångers total förstoring, för ovala eller sfärisk äppelgrön fluorescerande objekt som liknar en oocyster eller cysta. Undersök alla sådana objekt med DAPI filtret vid 1000 ggr totalt förstoring och sedan med DIC, även vid 1000 ggr totalt förstoring. Spela storlek med hjälp av en kalibrerad okulär mikrometer och morfologiska egenskaper.
- Dokument resultat.
OBS! Ytterligare informationinformation om den ursprungliga proceduren kan hittas i december 2005 års version av EPA Method 1623 12. Den tangentiella flödet ihåliga-fiberproduktion ultrafiltrering förfarandet beskrivet användes i stället för avsnitt 12,0 EPA Method 1623. Värmen dissociation modifierar avsnitt 13.3.3 av EPA Method 1623. Förfarandet beskriver också en extra PBS sköljning under IMS process som kan sättas in i december 2005 års version av metod 1623 efter avsnitt 13.3.2.16. Den kompletta listan över förbrukningsvaror, reagens och utrustning som används för EPA Method 1623 inklusive dessa modifieringar finns med i utrustningslistan.
4. Representativa resultat
Cryptosporidium oocystor och cystor Giardia återvunnits genom processer av filtrering och immunmagnetisk separation detekteras genom mikroskopisk analys. Vid 200 gångers total förstoring, varje organism som uppvisar en typisk färgningsmönster, storlek och form som visas i figur 2 Cryptosporidium är en äggformad att sfäriskt objekt 4 till 6 nm i diameter som uppvisar lysande äppelgrön FITC fluorescens med starkt markerade kanter (Figur 3A ). Med DAPI UV, kommer en oocyster uppvisa ett av följande typiska funktionen kategorier: ljusblå intern fläckar med en grön kant och ingen distinkt kärnor (DAPI negativ), intensivt blå intern färgning, eller upp till fyra distinkta, himmelsblå kärnor (DAPI positiv - Figur 3B). Atypiska funktioner inkluderar avvikelser i färg, struktur eller DAPI fluorescens (t.ex. alltför många färgade kärnor, röd fluorescerande interna strukturer). Om det fluorescerande objektet har uppfyllt kriterierna för typiska FITC och DAPI färgning, det undersöks med hjälp av kon differential störningkontrasten (DIC). Föremålet undersöks för atypiska yttre eller inre morfologiska egenskaper, såsom cellvägg ornamentering, eller en eller två stora kärnor fyllning av cellen. Om atypiska strukturer inte iakttas, är objektet registreras i det totala IFA räknas och kategoriseras som en tom amorf struktur eller med en till fyra sporozoiter nuvarande (figur 3C). På samma sätt är Giardia-liknande föremål undersöks med avseende på FITC och DAPI färgning samt DIC egenskaper, såsom axonemes, median organ och kärnor Giardia cystor är runda för att ovala briljanta äppelgrön objekt, 8 - 18 nm lång och 5 - 15 m bred med starkt markerade kanter (Figur 3D). Med DAPI UV kommer Giardia cysta uppvisar DAPI-negativ infärgning eller DAPI-positiva egenskaper (figur 3E). Den fluorescerande ändamål undersöktes genom DIC för typiska och atypiska drag på samma sätt som beskrivits för Cryptosporidium.Om atypiska funktioner som inte observeras, är objektet registreras i det totala IFA räknas och kategoriseras som tomma innehåller amorf struktur, eller med en eller flera typer av interna strukturer som finns (Figur 3F).
Varje organism som observeras ha atypiska funktioner bör inte räknas som en (oo) cysta. Mikroskopisk analys av miljöprover kan vara en utmaning eftersom det finns organismer som kan auto-fluorescerar eller korsreagerar med FITC-konjugerat anti-Cryptosporidium och / eller anti-Giardia-antikroppar 1. Det rekommenderas att en analytiker vara väl förtrogen med vattenlevande mikrober och dussintals översyn av diabilder att skaffa erfarenhet att identifiera Cryptosporidium och Giardia. Ska kännetecknas före varje session i mikroskop Minst tre (oo) cystor på positiv färgning kontrollen bild.
Kvalitet kontrollprover kan spetsas med (oo) cystor för att bestämma procent RECOvery för varje protozo med beräkningen:
(Oo) cysta procentuella återhämtningen = ((QC Prov Count - Räkna från ospetsade Prov) / Spike) x 100.
Figur 1. Grafisk representation av den tangentiella flödet med ihåliga fibrer ultrafiltreringssystem. Slangen är färgkodad för att underlätta monteringen är i systemet.
Figur 2. Representativa fluorescensbild av Cryptosporidium och Giardia (OO) cystor. Cryptosporidium-oocystor och Giardia-cystor färgades med FITC-märkta anti-Cryptosporidium / Giardia antikroppar. Pilar, Giardia cystor, pilspetsar, Cryptosporidium-oocystor. Totalt fyra Cryptosporidium oocystor och sex Giardia cystor hittades i planet i fokus. Proverna observerbaraED i 200 gångers förstoring.
. Figur 3 Representativa mikroskopiska bilder av Cryptosporidium-oocystor och Giaridia cystor som används för karakterisering Cryptosporidium oocyster (A - C).. Brilliant äppelgrön FITC fluorescens av sfäriska föremål 4 till 6 m i diameter med starkt markerade kanter (A) som innehåller upp till fyra distinkta, himmelsblå DAPI kärnor (B) och en till fyra sporozoiter (S) per oocyst (C). Giardia cystor (D - F). Brilliant äppelgrön FITC fluorescens runt till ovala föremål 8 - 18 m lång och 5 - 15 um bred med starkt markerade kanter (D) som innehåller upp till fyra himmelsblå DAPI kärnor (E) och med en eller flera märkbara interna struktur, som kärnor (N), median kropp (M) och eller axonemes (A) (F). Vita pilar, lysande äppelgrönt fluorescensfärgning Cryptosporidium-oocystor och Giardia cystor wVäggar, vita pilspetsar, DAPI positiva kärnor. Prover observerades under 1000 ggr förstoring.
Discussion
Tangentiellt flöde med ihåliga fibrer ultrafiltrering är en alternativ och effektiv teknik för den initiala koncentrationen av Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia från vatten. Ihåliga fibrer ultrafiltrering är billigare än de traditionella filter. Eftersom det har förmågan att koncentrera Cryptosporidium oocystor och cystor Giardia från en mängd olika vatten matriser är ett användbart alternativ till de nuvarande filtrerings teknik som används för EPA Method 1623. Som med de flesta andra filtrering metoder, är ihålig-fiber ultrafiltrering benägen att nedsmutsning med extremt grumliga prover. Högt vattentryck skulle bli följden av filtret påväxt, därför rekommenderas att övervaka trycket under filtreringen körningen. Förutom Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia har ihålig-fiber-ultrafiltrering visats vara i stånd att koncentrera bakterier och virus 1-3,5,8. Ihåliga fibrer ultrafiltrering outlined i denna metod kan användas för att koncentrera flera organismer i ett enda prov. Det är anmärkningsvärt att erhålla en slutlig volym mellan 200 och 250 ml är det kritiska sista steget i koncentrationen förfarandet så att extra centrifugeringssteg, som kan resultera i (oo) cystor förlust undviks (steg 2,2). Emellertid kan låta volymen i flaskan för att släppa för låg några negativa effekter på de återkrav eftersom det inte kommer att räcka vätskevolym för att tvinga alla oocystorna eller cystor i retentat flaskan. Därför rekommenderas att bibehålla en slutlig volym mellan 200 och 250 ml.
Värme dissociation är ett alternativ till den syradissociering steg i metod 1623. Detta alternativ steg har visat sig förbättra Cryptosporidium oocyst återhämtning och minska metoden variation när isolerat från antingen floden eller reagens vatten 9. En sida-vid-sida jämförelse av syra och värme dissociation metoder visat att användning av värme för att dissociate organismerna från immunomagnetiska pärlor produceras högre genomsnittliga återvinningar för både Cryptosporidium och Giardia. Dessutom var den precision av Cryptosporidium och Giardia återvinningar bättre i prover behandlade med värme dissociation jämfört med syradissociering 9.
Införlivandet av HFUF som koncentrationen steg ger större flexibilitet genom att ge möjlighet att koncentrera sig flera organismer. Dessutom är ett billigare alternativ till dagskursmetoden 1623 filtrering alternativ.
Disclosures
USA Environmental Protection Agency genom sitt kontor för forskning och utveckling i samarbete med kontoret av grundvatten och dricksvatten: s tekniska support finansierade forskningen beskrivs här. Allt arbete fick stöd på plats på den amerikanska EPA, Cincinnati, Ohio. Även om den information som beskrivs i denna artikel har finansierats helt eller delvis av USA: s Environmental Protection Agency enligt avtal (avtal EP-C-06-031) till Shaw Miljö-och infrastruktur, Inc, inte nödvändigtvis de åsikter som byrån och ingen officiell bekräftelse bör sluta. Det har varit föremål för byrån granskning och godkänts för publicering.
Acknowledgments
Vi vill tacka Ann Grimm och Michael Zimmerman för kritisk granskning av detta manuskript och Doug Hamilton för hans tekniska support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R | |
| I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole-Parmer | EW-06408-73 | |
| L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
| L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-15 | |
| L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-36 | |
| I/P Precision Brushless Drive | Cole-Parmer | EW-77410-10 | |
| I/P Easy Load Pump Head | Cole-Parmer | EW-77601-10 | |
| Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" | US Plastics | 62064 | |
| Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole-Parmer | EG-30613-12 | |
| Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole-Parmer | EW-06257-10 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C | |
| Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B | Cole-Parmer | EW-06258-10 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | A-680-46-10 | |
| Straight coupling, NPT(F), 1/4" | Cole-Parmer | EW-06469-18 | |
| NPT branch tee, natural pp | Cole-Parmer | A-30610-75 | |
| Pinch clamps, 1/2" | Cole-Parmer | EW-06833-00 | |
| Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B | |
| Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q | |
| Keck ramp clamp, 14mm | Cole-Parmer | EW-06835-10 | |
| Sodium polyphosphate | Sigma-Aldrich | 305553 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 72050 | |
| Antifoam Y-30 emulsion | Sigma-Aldrich | A5758 | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| 10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR international | IR314-0025 | |
| Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 | |
| 250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 | |
| Disposable funnel | Cole-Parmer | U-6122-10 | |
| Wash bottle | Cole-Parmer | U-06252-40 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-15R | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | ARIES SX4750 | |
| Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter Inc. | 349849 | |
| 200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 | |
| VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 | |
| 5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Falcon BD | 352098 | |
| Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 | |
| Timer | VWR international | 23609-202 | |
| Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D | |
| 1 ml pipettes | VWR international | 53283-700 | |
| 1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P1000/DF1000ST | |
| 100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P100/DF100ST | |
| 9 inch Pasteur pipettes | VWR international | 14672-412 | |
| Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D | |
| Vortex | VWR international | 14216-188 | |
| Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 | |
| Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 | |
| Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Single Spot slides | IDEXX | 30201 | |
| Cover glass | Corning | 287018 | |
| EasyStain direct kit | BTF | - | |
| 10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P10 & DF10ST | |
| 4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 | |
| Methanol | Fisher Scientific | L6815 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 | |
| Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon Instruments | MXA20234 | |
| Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon Instruments | MBA 77000 | |
| Plan APO 100X oil objective | Nikon Instruments | MRD01901 | |
| Plan Achro 20X | Nikon Instruments | MRL00202 | |
| FITC filter | Nikon Instruments | 96302 | |
| DAPI filter | Nikon Instruments | 96301 | |
| X-cite fluorescence illuminator | Nikon Instruments | 87540 | |
| Lens paper | Nikon Instruments | 76997 | |
| Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D | |
| Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 | |
| 3 % hydrogen peroxide | VWR international | BDH3540-2 | |
| Bleach | Fisher Scientific | 1952030 | |
| Wypall | Kimberly Clark | 34790 |
References
- DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
- Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
- Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
- Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
- Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
- Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
- Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
- USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
- Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
- Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).
