Medición de conductancia de la hoja hidráulica y la conductancia estomática y sus respuestas a la irradiación y la deshidratación mediante el método de evaporación Flux (EFM)

Summary

Se describe un método relativamente rápido (30 min) y al mismo tiempo realista para la medición de la conductancia hidráulica de hoja (

Abstract

El agua es un recurso clave, y el agua de la planta sistema de transporte establece límites en el máximo crecimiento y tolerancia a la sequía. Cuando las plantas abren sus estomas para lograr una alta conductancia estomática (g _s) para capturar CO ₂ para la fotosíntesis, el agua se pierde por ^1,2 transpiración. El agua que se evapora de los espacios aéreos se sustituye a partir de las paredes celulares, a su vez, sacar agua del xilema de las venas de las hojas, en el dibujo a su vez de xilema en los tallos y raíces. Como el agua es eliminada a través del sistema, experimenta una resistencia hidráulica, creando tensión en todo el sistema y un potencial hídrico de las hojas bajo (Ψ _hoja). La propia hoja es un cuello de botella crítico en el sistema de toda la planta, lo que representa una media del 30% de la resistencia de la planta hidráulica ^3. Conductancia de la hoja hidráulica (K = resistencia _hoja 1 / hoja hidráulica) es la relación de la tasa de flujo de agua con el gradiente de potencial del agua a través de la hoja, y se resume lacomportamiento de un sistema complejo:. agua se mueve por el pecíolo y a través de varios órdenes de venas, sale a la vaina del haz y pasa a través o alrededor de las células del mesófilo antes de evaporarse en el espacio aéreo y se desprendía del estomas de la _hoja K es de gran interés como una rasgo fisiológico importante para comparar las especies, la cuantificación de la efectividad de la estructura de la hoja y la fisiología para el transporte de agua, y una variable clave a investigar por su relación con la variación en la estructura (por ejemplo, en la arquitectura venación foliar) y sus impactos sobre el intercambio gaseoso fotosintético. Además, K _hoja responde fuertemente a la hoja entorno interno y externo ^3. _Hoja K puede aumentar dramáticamente con la irradiancia aparentemente debido a cambios en la expresión y la activación de las acuaporinas, las proteínas implicadas en el transporte de agua a través de membranas ^4, y la _{hoja de} K disminuye fuertemente durante drdebe, debido a la cavitación y / o el colapso de los conductos del xilema, y / o pérdida de la permeabilidad en los tejidos extra-xilema debido a mesófilo y la vaina del haz encogimiento de la célula o la desactivación acuaporina ^5-10. Debido K _hoja puede limitar g _s y la tasa fotosintética en las especies en condiciones bien regado y durante la sequía, y por lo tanto limitar el rendimiento de toda la planta, posiblemente, puede determinar la distribución de especies, especialmente las sequías aumentarán en frecuencia y severidad ^11-14.

Se presenta un método simple para la determinación simultánea de K _hoja y _s g de hojas cortadas. Una hoja transpirante está conectada por su pecíolo a un tubo de corriente a una fuente de agua en una balanza. La pérdida de agua de la balanza se registró para calcular la velocidad de flujo a través de la hoja. Cuando la transpiración estado de equilibrio (E, mmol m ^-2 • • s ^-1) se alcanza, g hoja de K dividiendo por la fuerza del agua conducción potencial determinó utilizando una cámara de presión (K = _hoja E / - Δψ _hoja, MPa) ^15.

Este método se puede utilizar para evaluar las respuestas de _K foliar a distintas irradiancias y la vulnerabilidad de la _hoja de K a la deshidratación ^14,16,17.

Protocol

1. Hoja de Medición de conductancia hidráulica para Hojas hidratados (K _max)

1. Recoge los brotes de preferencia en la tarde o noche de tal manera que las tensiones del xilema son bajos, corte en el aire y colocar en bolsa de plástico llena de oscuridad con toallas de papel húmedas. En el laboratorio, volver a cortar al menos dos nodos desde el final de cada sesión de bajo el agua. Vamos a disparar rehidratar durante la noche en agua pura, o con otra solución que se utiliza para las mediciones _hoja K. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor.
2. Cortar la hoja de la sesión con una hoja de afeitar nueva solución bajo flujo parcialmente desgasificada. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor. Se recomienda desgasificar la solución durante la noche en un matraz usando una bomba de vacío, pero otros métodos pueden ser empleados.
3. Wrap pre-estirado Parafilm alrededor del petioLe para asegurar un buen sellado entre el pecíolo y el tubo. Este paso es especialmente útil para no redondos pecíolos, como envoltura Parafilm adicional ayudará a redondear el peciolo para caber dentro de la tubería. Pasta dental puede ser aplicado a la pecíolo antes de envolver el parafilm para rellenar ranuras en los pecíolos.
4. Conecte la hoja de tubo de silicona bajo el agua ultrapura para evitar que el aire entre en el sistema. A medida que la hoja se eleva por encima de la fuente de agua, el agua en la tubería está a presión inferior a la atmosférica, y por lo tanto el sello es bueno si no se aspira aire en el tubo durante la medición. Alternativamente a sellar el pecíolo directamente en el tubo de silicona, un ajuste de compresión con la junta de goma se puede utilizar (por ejemplo, (Omnifit A2227 adaptador de orificio; Omnifit, Cambridge, UK); este enfoque es útil para pecíolos con formas especialmente complejas, o para hojas de hierba , que puede ser envuelto alrededor de una varilla de vidrio y se sella con el accesorio de compresión. Cuando sea factible, sellando el pecíolo directamente en SIlicone tubo tiene la ventaja de ser rápido y dejando una unión pecíolo tubo que es transparente, permitiendo burbujas sean más fáciles de ver. El tubo se conecta a un tubo de la hoja duro funcionando a un cilindro graduado en una balanza (± 10 g de resolución), que registra los datos cada 30 segundos a un ordenador (por ejemplo, utilizando "Link Balance" Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suiza) para el cálculo de la tasa de flujo a través de la hoja.
5. Las hojas deben realizarse hacia arriba la superficie adaxial en marcos de madera atadas con hilo de pescar por encima de un ventilador de caja grande y bajo una fuente de luz (> 1.000 m mol • ² • s ^-1 radiación fotosintéticamente activa de alta irradiancia medidas), ligeramente por encima del nivel de el menisco en el cilindro graduado. La hoja debe ser colocado por encima del agua en el cilindro graduado para asegurar que el agua en movimiento a la hoja es impulsado por la transpiración, y no entrar en la hoja bajo presión debido a la gravedad, como lo haríaser el caso si la hoja se coloca por debajo del menisco del agua en el cilindro. Los recipientes pequeños con toalla de papel húmeda se colocan dentro de la cámara de equilibrio para asegurar que el aire en el equilibrio es saturado con agua, evitando así la evaporación de la fuente de agua a la atmósfera en el equilibrio. Esta posibilidad se puede comprobar por detener el flujo dentro de la hoja usando una válvula de paso de cuatro vías en el tubo, y la comprobación de que la masa del cilindro de agua en el equilibrio no disminuye.
6. Colocar un recipiente de Pyrex claro lleno de agua por encima de la hoja para absorber el calor de la lámpara.
7. Mantener la temperatura de la hoja entre 23 ° C y 28 ° C durante todo el experimento mediante la adición de más agua fría al recipiente Pyrex de tal manera que la lámpara de calor no calienta el recipiente Pyrex suficientemente para calentar el aire alrededor de la hoja de abajo.
8. Permitir la hoja de transpirar en el aparato durante al menos 30 min, dando así tiempo suficiente para aclimatarse a alta irradiación, y additionally hasta que la velocidad de flujo se ha estabilizado, sin tendencia hacia arriba o hacia abajo, y con un coeficiente de variación <5% por lo menos, mediciones 5-10 hechas a intervalos de 30 seg de flujo. Es esencial para la velocidad de flujo para alcanzar un estado estacionario, porque este método asume una _hoja estable Ψ. Estudios anteriores encontraron estos criterios para ser suficiente para la estabilización de velocidad de flujo (E), Ψ _hoja y la _{hoja de} K; pruebas con periodos de medición más largos después de flujo estable se estableció no mostró una relación de _hoja K a tiempo de medición para cada una de las siete especies de una gama rango de capacitancia hoja ^17,18. Estabilización generalmente tarda 30 minutos o menos, pero en algunas especies puede requerir más de una hora para algunas especies.

Nota: Cuando el caudal es muy baja (<8 g s ^-1), la estabilidad se puede determinar utilizando el promedio de funcionamiento de los últimos cinco intervalos de 30 seg.

Deseche las mediciones si el flujo cambia de repente, ya sea debido a cierre de los estomas repentino o drenaje desprende del sello o bloqueo en el sistema de partículas o burbujas de aire.

Cuando el flujo se estabilice, grabar temperatura de la hoja con un termopar.

Retire rápidamente la hoja de la tubería, limanda secar el pecíolo y coloque la hoja en una bolsa sellable que previamente había sido exhalado en, para detener la transpiración.

Deje que la hoja se equilibre en su bolsa por lo menos durante 20 minutos.

Promedio de las últimas 10 mediciones de caudal. Esta será su medición E.

Cuando la hoja se equilibra, medir el potencial de agua de la hoja final (Ψ _final) con una cámara de presión.

Medir el área de la hoja con un escáner de superficie plana y software de procesamiento de imágenes, o con un medidor de área foliar.

K _hoja se calcula como E /-ΔΨ _hoja (donde ΔΨ _{hoja final} = Ψ -2 s ^-1 MPa ^-1. Debido a que la hoja se coloca justo por encima del nivel de agua en el cilindro graduado, el efecto de la gravedad en la reducción de la presión de entrada de agua en la hoja sería insignificante, especialmente en lo relativo a la _final Ψ, que siempre es> -0,1 MPa.

Para corregir los cambios en K _hoja inducidos por la dependencia de la temperatura de la viscosidad del agua ^15,19,20, normalizar los valores de _K foliar a 25 ° C mediante el uso de la ecuación siguiente:

18. La conductancia estomática (g _s) se puede determinar como E dividida por la diferencia de presión de las hojas-aire vapor, equivalente a la pressu vaporre déficit (VPD), determinados mediante un sensor de temperatura y humedad relativa adyacente a la hoja. VPD se calcula utilizando la siguiente ecuación ²¹

donde RH es la humedad relativa, VP es la presión de saturación de vapor del aire (en kPa; una función de la temperatura, de acuerdo con la ecuación Arden Buck ^22), y el AP presión atmosférica (en kPa).

2. Medición de conductancia hidráulica para la hoja Las hojas deshidratadas

1. Recoge los brotes de preferencia en la tarde o noche de tal manera que las tensiones del xilema son bajos, corte en el aire y en lugar oscuro bolsas de plástico llenas de toallas de papel húmedas. En el laboratorio, volver a cortar al menos dos nodos desde el final de cada sesión de bajo el agua. Vamos a disparar rehidratar durante la noche en agua pura, o con otra solución que se utilizará para K _leaf mediciones. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor.
2. Cortar los brotes en segmentos con al menos tres hojas en agua ultrapura y deshidratar brotes con un ventilador para diferentes períodos de tiempo a una gama de valores de _hoja Ψ.
3. Una vez que los brotes están deshidratados, coloque bolsas de cierre hermético (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, EE.UU.), que han sido previamente exhalado in) alrededor de cada hoja de la filmación, y luego coloque el rodaje todo en una bolsa sellable grande con el papel mojado toalla.
4. Que el rodaje equilibrar durante al menos 30 min (para los brotes fuertemente deshidratados más largos tiempos de equilibrio puede ser necesario).
5. Después de la equilibración, especial la hoja superior e inferior y la medida inicial _hoja Ψ (Ψ = _O) con una cámara de presión.
6. Descartar la sesión si la diferencia en la _hoja Ψ de esos dos hojas es mayor que 0,1 MPa (para stronGly hojas deshidratadas, este rango puede ser extendido a 0,3 MPa).
7. La tercera hoja se utiliza entonces para determinar K _hoja y _s g con la EFM, siguiendo los pasos 1.2 -1.18 anteriores. Notablemente, E estado estacionario se puede conseguir incluso para las hojas que han sido severamente hojas deshidratadas, como estomas todavía abrir y generar valores sustancialmente más altas que la conductancia cuticular ¹⁷ g _s.
8. Para construir las curvas de vulnerabilidad hidráulicos, calcular _hoja K utilizando la _final Ψ como en el paso 1,16, y luego la trama K valores de _hoja contra el que sea más bajo, _o Ψ Ψ o _final, es decir, el más fuerte deshidratación experimentada por la hoja durante el experimento (= Ψ _{más bajo).} De manera similar, la disminución de g _s en respuesta a la deshidratación hoja puede ser determinada por el trazado g _s contra _{más bajo} Ψ. El trabajo previo ha SH propio que la deshidratación induce al menos parcialmente la disminución irreversible de K _foliar y g _s ^14,16.
9. Se recomienda obtener al menos 6 valores _foliares de K por intervalo de 0,5 MPa de Ψ _{más bajo} (este intervalo puede reducirse a 0,25 MPa si la especie que se está trabajando es muy vulnerable a la deshidratación).
10. Realizar prueba de Dixon outlier en los valores _foliares de K para cada intervalo de agua 0,5 MPa de potencial _{más bajo} Ψ para eliminar los valores extremos de la curva de vulnerabilidad ^23.
11. Dado que las especies difieren en sus respuestas de K _foliar y _s g a la deshidratación ^14,16, aptos funciones diferentes para cada especie y seleccionar la máxima verosimilitud (menor valor de AIC, ver ¹⁴ para más detalles). Se recomienda fijar al menos cuatro funciones utilizadas anteriormente en la literatura: lineal (pg "fo: content-width =" 1.4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>), sigmoidal ( ), Logística ( ) Y exponencial ( ).

3. Los resultados representativos

La disminución de la conductancia hidráulica hoja con deshidratación varía fuertemente entre especies (Fig. 1). Sequía especies sensibles experimentan un descenso más fuerte en potenciales hídricos menos negativas que las especies más tolerantes a la sequía, cuando se mide bajo alta irradiación solar (PAR> 1.000 mol m ^-2 • • s ^-1). El aguapotencial de pérdida del 80% de la conductividad hidráulica (P ₈₀₎ para mesic hierba Helianthus annuus fue de 3 MPa menos negativa que la de Heteromeles arbutifolia, nativa de California chaparral. Heteromeles arbutifolia respondió linealmente a la disminución en el potencial de agua, mientras que Helianthus annuus mostró un no disminución lineal.

Tanto la conductancia estomática (g _s) y conductancia de la hoja hidráulica (K _hoja) también puede responder dramáticamente a la radiación (Fig. 2). Para Raphiolepis indica, la conductancia estomática disminuyó fuertemente con la deshidratación de las hojas medidos bajo alta irradiación solar (PAR> 1.000 mol m ^-2 • • s ^-1) y bajo la luz de laboratorio (PAR <6 mmol m ^-2 • • s ^-1). Bajo alta irradiación, hojas mide con el EFM que había sido deshidratada al potencial del agua que es típico para bien iluminado leaVES en plantas intactas a mediados de día mostró similar _s g de hojas como medidas en las plantas intactas con un porómetro (estrella en la fig. 2). En particular, para las hojas de máxima hidratación, K _foliar fue cuatro veces mayor para las hojas expuestas a alto de baja irradiación (11 frente a 2,8 mmol m ^-2 s ^-1 MPa ^-1), y por lo tanto K _foliar mostraron una respuesta más fuerte luz en el pozo hojas hidratados que g _s. Además, bajo alta irradiación, K _foliar se redujo más fuertemente con la deshidratación. El P ₈₀ fue de 0,93 MPa menos negativo que en condiciones de alta irradiancia baja.

Figura 1. Hojas curvas hidráulicas de vulnerabilidad de una sequía sensible (arriba) y un tolerantes a la sequía (abajo) de las especies ^(14,24). Cada punto representa un pecadogle medición de conductancia de la hoja hidráulica (K _foliar) en una hoja separada con el método de evaporación flujo (EFM). Las barras verticales representan el potencial de agua en el que las especies perdido 80% de conductancia de la hoja inicial hidráulica (P _80). Mejores funciones de ajuste utilizando máxima verosimilitud se trazan para ambas especies.

Figura 2. La respuesta de conductancia estomática (g _s) y de conductancia de la hoja hidráulica (K _foliar) a la disminución potencial hídrico foliar para Raphiolepis indicador mide bajo vs alto irradiancia baja (de ^16). (PAR> 1,000 y <6 mmol m ^-2 s • •^-1). Cada punto representa una sola medición en una hoja individual utilizando el método de evaporación de flujo (EFM), con los puntos blancos y negro que representan hojas medidos bajo irradiación de alta y baja respectivamente. Las ecuaciones de las curvas de conductancia estomática en alta irradiancia vs baja: y . Las ecuaciones para las curvas de vulnerabilidad en la radiación de alta vs baja: y . La estrella gris en el panel superior representa la media ± standard error para g _s y el potencial hídrico foliar medido en las hojas de las plantas intactas al mediodía con un porómetro. Grises y negras barras verticales en el panel inferior representa el potencial de agua en el que las especies perdido el 80% de la conductancia foliar inicial hidráulica (P ₈₀₎ bajo la irradiación de alta y baja respectivamente.

Discussion

El método de flujo evaporativo aquí se presenta permite relativamente rápida (30 min) la determinación de la conductancia de la hoja hidráulico en el laboratorio con la medición simultánea de la conductancia estomática.

El EFM es hasta ahora el método que más fielmente sigue el camino natural del agua en las hojas, ya que el agua se evapora en los espacios aéreos de hoja y se difunde desde los estomas ^15. Un número de otros métodos experimentales para la determinación de _{la hoja} existen K ^25, con tres siendo especialmente común. (1) En el método de presión de alto flujo (HPFM), el agua es empujada a través de la hoja a alta presión ^15,26. Sin embargo, las curvas de vulnerabilidad no se puede obtener con este método porque se aplican presiones positivas puede rellenar émbolos y rehidratar tejido mesófilo. (2) En el método de rehidratación cinética (RKM), K _hoja se calcula usando la analogía entre la rehidratación de las hojas deshidratadas con el charging de un condensador en serie con un ^27,28 resistencias. Este método es rápido, pero no reproduce en todo el sistema de vías naturales por transpiración en la hoja y no se puede modificar fácilmente para permitir la medición de las hojas aclimatadas a alta irradiación. (3) En el método de la bomba de vacío (VPM) de la hoja se coloca en una cámara, su peciolo conectado a una fuente de agua en el equilibrio, mientras que los vacíos de diferentes intensidades se aplican a la pérdida de agua de la hoja de conducción de la hoja ^15,26. Este método puede consumir mucho tiempo. Mediciones usando los tres métodos se han encontrado para dar resultados consistentes ^15,28,29, y por lo tanto la EFM se utiliza con frecuencia dado que se basa en su movimiento de agua por transpiración, y su relativa rapidez, y su modificación para medir _hoja K en diferentes condiciones.

Todos los métodos típicos utilizados para la determinación de _hoja K implicar un nivel de incertidumbre en la cuantificación de accurately el motor correspondiente a la transpiración ^25. En el EFM, la _hoja ΔΨ utiliza para calcular _hoja K es menor que la verdadera fuerza motriz, ya que se basa en el grueso _hoja Ψ después de la hoja se equilibra para la bomba de presión. En este punto, la mayor parte de _hoja Ψ no representa necesariamente el potencial de agua de las células al final de la vía hidráulica, donde el agua se evapora, sino más bien un promedio ponderado por volumen de las relativamente pocas células de potencial bajo de agua donde el agua es el movimiento y la evaporación, y para las células más numerosas de alto potencial hídrico que pueden ser aislados de la corriente de transpiración. ¿Cuánto de la _hoja Ψ difiere del verdadero motor depende, pues, del lugar donde el agua se evapora en la hoja. Si el agua se evapora a través de la hoja, el grueso _hoja Ψ puede estar cerca de la verdadera fuerza motriz, y si el agua se evapora sólo de c relativamente pocosells cerca de los estomas, la _{hoja de} la mayor parte Ψ sustancialmente puede subestimar la verdadera fuerza motriz, es decir, el potencial hídrico de las células puede ser en realidad mucho menor, y por lo tanto _{la hoja} K real sería inferior al determinado con el EFM. Así, el grado que la _{hoja de} K determinado por el EFM representa la _hoja verdadera K es sensible a las vías de flujo de agua, que todavía no son bien comprendidas. Mientras que el EFM proporciona los datos que coinciden con los de otros métodos de medición K _hoja (véase más arriba), y es excelente para uso comparativo, la posibilidad de variación de especie en las vías de flujo de agua a través del mesófilo necesita más investigación. En efecto, incluso para las hojas de las especies dadas, estas vías de agua puede variar bajo diferentes condiciones, por ejemplo, bajo distintas irradiancias y ^4,30 cargas de calor o del estado del agua diferente (dada la contracción del tejido) ^31. Conocimiento másde las vías de transporte de agua por lo tanto permitiría que el EFM que se utiliza para resolver los efectos de las vías cambiante sobre el transporte hidráulico hoja general.

La medición de la conductancia estomática en el EFM tiene las ventajas de permitir la determinación de las respuestas a la irradiancia y la deshidratación, y proporcionar respuestas emparejados g de _s con la _hoja K. Además, el efecto de la deshidratación hoja anterior seguido de rehidratación en g _s se puede evaluar con este método. Sin embargo, este método tiene dos inconvenientes potenciales. En primer lugar, la medición de este g _s se realiza sobre una hoja extirpada, más que en una planta intacta, y segundo, la determinación de la conductancia estomática se basa en la medición del clima a cierta distancia de la hoja, en lugar de cerca de la hoja como en una cámara de porómetro , aunque la ventilación de la hoja con el ventilador se equilibra la superficie de la hoja con el aire circundante. Para algunas especies, extirpadoslas hojas pueden mostrar diferentes respuestas de los estomas de las hojas en que una planta intacta ^16,32. Sin embargo, para varias especies g _s estimó utilizando el EFM fue similar a los valores medidos en plantas intactas con un porómetro para hojas a mediados de día Ψ _hoja ¹⁶ (Fig. 2).

El EFM se puede aplicar para una visión fisiológica, es decir, la investigación de la dinámica de K _hoja, su base en la estructura y la anatomía, y sus respuestas a los factores ambientales. Además, el método puede ser utilizado para comparar las plantas de especies dadas cultivadas en condiciones diferentes, o de diferentes edades, o para comparar las plantas de especies diferentes adaptadas a diferentes ambientes.

Mediante la construcción de curvas de hoja de vulnerabilidad, se puede obtener información sobre los mecanismos de tolerancia a la sequía especies. Durante la sequía, la cavitación y colapso celular han demostrado que se producen en el xilema hoja de algunos especies, y la contracción de células en el mesófilo durante la deshidratación también podría afectar el movimiento del agua (revisado en ^14). Futuros estudios serán necesarios para determinar la importancia relativa de cada uno de estos procesos en la conducción de la disminución de K _hoja y cierre de los estomas.

La irradiación es también un factor de fuerte influencia K _foliar y el EFM es muy adecuado para las mediciones con alta irradiación. La respuesta combinada de las acuaporinas a la irradiación y de la sequía debe tener mucho interés. Irradiancia alta conduce a una mayor expresión y / o activación de las acuaporinas que permiten el flujo de agua más rápido a través de las células vivas, el aumento de _hoja K, mientras que conduce a la reducción de expresión de deshidratación y / o de-activatation de las acuaporinas, reduciendo _hoja K. Los efectos combinados de la radiación y el suministro de agua en la _hoja K requieren investigación adicional ^4,10,16,33.

tienda de campaña "> Además, en todas estas especies, K _foliar y su vulnerabilidad ha sido relacionado con la distribución de especies con respecto al suministro de agua luz y otros recursos ^3,13,24. Las especies de zonas secas tienden a mostrar una mayor resistencia al deterioro hidráulico, frente a potenciales más negativos del agua del suelo, y por el mantenimiento de una _hoja K alto a potenciales más negativos del agua, pueden mantener una alta _s g y continuar la captura de CO ₂ para la fotosíntesis ^13,14. Así, el estudio de la hoja de propiedades hidráulicas proporciona información detallada a nivel de celda, hoja, y toda planta y sus respuestas al medio ambiente, y es probable que el rendimiento numerosos nuevos descubrimientos importantes en todas las escalas.