Summary
لتنقية بيضات ملقحة من
Abstract
بيضات ملقحة هي وسيطة بين فرداني الأساسية والدول مضاعفا في دورة حياة العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الخميرة (الشكل 1) 1. S. خميرة بيضات ملقحة تنتج عن دمج خلايا من نوع فرداني التزاوج متميزة (ماتا، MATalpha) وتؤدي إلى diploids مستقرة المقابلة التي تولد تباعا ما يصل إلى 20 سلالة مضاعفا نتيجة لانقساماتهم الإنقسامية غير المتماثلة لافت للنظر 2. ودبرت تشكيل البيضة الملقحة عن طريق سلسلة معقدة من الأحداث: في هذه العملية، والعوامل القابلة للذوبان التزاوج ربط المستقبلات المشابهة، مما اثار مستقبلات بوساطة أجهزة الطرد المركزي التي تسهل إشارة توقف دورة الخلية وتبلغ ذروتها في الخلية خلية الانصهار. ويمكن اعتبار بيضات ملقحة نموذجا للسلف أو وظيفة خلايا الجذعية.
على الرغم من أن تم تعلمه الكثير عن تشكيل بيضات ملقحة وعلى الرغم من استخدام بيضات ملقحة للتحقيق في الخلية الجزيئية مسائل signif العامicance، تقريبا جعلت جميع الدراسات استخدام الخلائط التزاوج الذي يتم مختلط بيضات ملقحة التي تتألف غالبية سكانها من الخلايا فرداني 3-8. كثير من جوانب الكيمياء الحيوية من تشكيل البيضة الملقحة والحياة المستمرة لاقحة تبقى دون تحقيق ذلك.
تقارير تنقية بيضات ملقحة الخميرة وصف بروتوكولات يعتمد على خصائص الترسيب على 9؛ إلا أن هذا الإجراء يستند إلى الترسيب لم تسفر عن ما يقرب من 90٪ النقاء في أيدينا. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه عيب وتتعرض الخلايا لالسوربيتول مفرط التوتر. ولذلك وضعت إجراء تنقية تنوعا. لهذا الغرض، وكان أزواج من الخلايا فرداني معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء شارك في المحتضنة للسماح تشكيل لاقحة، تحصد في أوقات مختلفة، وعلى بيضات ملقحة وتنقيته مما أدى باستخدام بروتوكول تدفق الخلوي على أساس الفرز. هذه التقنية يوفر تقييم مريحة البصرية من النقاء والنضج. نقاء المتوسطمن الكسر ما يقرب من 90٪. وفقا لتوقيت الحصاد، يمكن استرداد بيضات ملقحة من درجات متفاوتة من النضج. العينات النقية توفير نقطة انطلاق لمريحة "، OMIC" دراسات، لاسترداد ذرية الأولية، وللتحقيق المنتظم لهذه الخلية السلف.
Protocol
1. فرداني نمو الخلايا
- تنمو S. خلايا خميرة من الخلفية S288C (BY4741) تحت الظروف القياسية 10.
- تحويل النباتات الاحاديه للتعبير عن أي من علامات الفلورسنت 2 اضح 10. علامات الاختيار هي للذوبان أعرب GFP في السيتوبلازم (pEG220، URA3/YIp، خطي مع BglII 11) وبروتين واحد الريباسي، RPL25، تنصهر مع mCherry (pAJ1661، URA3/CEN، من جونستون A.). نتوقع أن يعادل بروتوكولات تنقية اللونين يمكن الاستفادة من البروتينات الفلورية الأخرى الزاهية التي تم تجميعها من قبل خلايا الوالدين فرداني. وبدلا من ذلك، يمكن أن يسمى جدار الخلية مع يكتينس الفلورسنت.
- على اقحة تنقية اليوم السابق، تطعيم 5 مل من كل الثقافات نوع من الخلايا وزراعتها مع اهتزاز بين عشية وضحاها في 23 ° C للوصول A600 لا تتجاوز 1.0. تنمو transformants GFP (ATY4442) في المتوسطة الاصطناعية كاملة بما في ذلك الجلوكوز 2٪ (CSM-الجلوكوز) إلىالثانية RPL25-mCherry transformants (ATY4552) في وسط انتقائية تفتقر الاصطناعية اليوراسيل 10. الحفاظ على الثقافات الموازية من كل نوع من الخلايا مع اهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
2. إجراء الصليب
- ضبط الكثافة الضوئية (A600) من كل عينة إلى 1.0 في المتوسط الطازجة. [1 وحدة الكثافة البصرية ~ 3 × 10 7 خلية / مل]
- خلط أحجام متساوية من الثقافتين، دوامة لفترة وجيزة 3 مرات، ثم وقتا أطول لمدة 10 ثانية الدوامة.
- إعداد CSM-الجلوكوز لوحات. لوحات مماثلة لتلك المستخدمة لنمو الروتينية وتم تجفيفها بعد 45 دقيقة صب والتصلب من أجار 10.
- توزيع ما يقرب من عشرين مل 40-قطرات من مزيج 1 سم من على حافة سطح CSM-الجلوكوز لوحات. عندما يتم تطبيق لأول مرة على سطح قطرات بدء موقت لقياس الوقت المنقضي. مرة واحدة وقد تم استيعاب السائل (حوالي 30 دقيقة)، وتغطي لوحات وتركهم دون عائق في روم درجة الحرارة.
3. حصاد الاستعدادات
- عينات الحصاد بعد 1،75-2،5 ساعة عند 23 ° C عن طريق الغسيل مرارا قطرات المجففة الفردية من لوحة باستخدام 150 مل الباردة CSM-الجلوكوز، والحفاظ على لوحات على الجليد. غسل المنطقة بشكل متكرر قطرة 10-20 مرات مع نفس المتوسط لتعظيم الانتعاش. جمع أنابيب فالكون في 15 مل على الجليد.
- بحث يصوتن العينات 10X في السعة 60٪ مع sonicator FB120 فيشر (120Watt، 120Volt، الصناعي Freq 20KHz) على الجليد.
- تحقق في المرحلة التي المجهر المجاميع قليلة أو لا تزال قائمة. ومن المتوقع أن 15-50٪ من الخلايا قد كون بيضات ملقحة في هذه المرحلة.
- ترك الأنبوب من الخلايا في وضع عمودي دون عائق على الجليد لمدة 10 دقيقة كإجراء وقائي إضافي (للسماح لتسوية الركام).
- استرداد 90٪ أعلى من حجم وتصفية عليه من خلال شبكة من النايلون (البولي بروبيلين أنبوب فالكون BD مع مصفاة أصغر (المرجع 352235)). في تجربة نموذجية، 10 7 خلاياتم انتشال من لوحة واحدة في هذه المرحلة تضعف إلى 4 مل من الجلوكوز CSM.
4. تدفق الخلوي
- الخلايا باستخدام نوع انعكاس يوفق سوني الموديل قياس التدفق الخلوي، (فرز الآلي للغاية وبالتوازي) مع طرف HAPS1 ميكرون 100. لإثارة GFP، استخدم اللون الأزرق أيون الأرجون، 250 ميلي واط الليزر في 488 نانومتر. لإثارة mCherry، استخدم الليزر 100 في 561 ميلي واط نانومتر. على الرغم من أننا لم يكن لديك خبرة مع أجهزة أخرى، نتوقع أن بيكتون ديكنسون FACSAria، بيكتون ديكسون تدفق أو بيكمان كولتر XDP MoFlo سيكون على ما يرام عندما مجهزة ليزر الصحيح.
- قاعدة الفرز المعلمات على مؤامرة مبعثر إلى الأمام مقابل من أجل العودة إلى بوابة على خلايا قابلة للحياة. إنشاء مؤامرة الانبعاثات من 615 + / - 30 نانومتر ممر الموجة مرشح (mCherry) مقابل 525 + / - 25 نانومتر ممر الموجة مرشح (GFP) لتقسيم الأحداث إلى أربعة أجزاء، "الأحمر + الأخضر"، "الأحمر + الأخضر +"، "الأحمر الأخضر "، و" الاحمر والاخضر + "(الشكل S2). استخدام الخلايا nonfluorescent باعتبارها معيار وأو تحديد رباعي "الأحمر والأخضر و".
- خلايا نوع مع الضغط غمد 21.5 رطل لكل بوصة مربعة، تردد 43400 قطرة من قطرات / ثانية، وضغط عينة قدرها 20.5 رطل لكل بوصة مربعة.
- فرز الأولي ("وضع الاسترداد"): جمع العينات في أنابيب إيبندورف المبردة التي تحتوي على 250 مل من البرد CSM-الجلوكوز. الرواسب 10 ثانية في سرعة قصوى في microfuge المبردة (تومي MRX-150، 15،000 دورة في الدقيقة) ونضح الحل التدفق (تدفق غمد حل الخلوي (PBS مع EDTA ملي 1) BioSure رقم كتالوج 1027). resuspend في 500 مل الباردة الجلوكوز CSM.
- الترتيب الثاني ("الوضع الطهارة"): إجراء هذا النوع أما بالنسبة لنوع الأولية، وذلك باستخدام "واسطة نقاء" الخيار. الرواسب و. تنقية الخلايا و resuspend الكريات في 500 مل-1.0 مل الجلوكوز CSM يهز لمدة 15 دقيقة في 24 لوحات جيدة في C ° 23 إلى السماح باستعادة الأيض.
5. DeltaVision المجهر
- إعداد منصات الاغاروز على النحو التالي: إحضار تعليق الاغاروز 1.5٪ (عالى النقاءالاغاروز، إينفيتروجن، كتالوج # 15510-07) في الجلوكوز CSM ليغلي، لفترة وجيزة الدوامة، ومن ثم تطبيق 0،3 مل عينات من الحل الاغاروز على سطح أفقي الشرائح الزجاجية القياسية وتغطيتها في آن واحد مع شريحة الثانية (دون الضغط).
- بعد التبريد لمدة 10 دقيقة، وإزالة بلطف الشريحة العليا من انزلاق أفقيا، مع الحرص على ترك سطح أملس وعدم تعكير صفو طبقة الاغاروز. (عندما تمت إزالة الشريحة العليا، ينبغي تطبيق عينة من الخلايا في غضون 1-2 دقائق، وعندما يحتفظ بها في غرفة الرطبة في درجة حرارة الغرفة دون إزالة الشريحة العليا، ويمكن تخزين ما يصل إلى منصات ليوم واحد قبل الاستخدام.)
- عينات الرواسب ودائع مليلتر مأخوذة 1 من بيليه على منصات الاغاروز (دون لمس السطح). تغطية مباشرة مع عينة ساترة مربع رقم 1. تقليم بعيدا الزائدة مع الاغاروز razorblade واحد ذو حدين. ختم الاستعدادات مع الفازلين الاستغناء عن حقنة.
- الصورة باستخدام Deltavision (التطبيقية Precisioن) مع هدف النفط الغمر 100X دون binning (أوليمبوس UPlanApo 100x/1.40؛ ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve Z-المداخن باستخدام برنامج 5.0.0 softWoRx ( http://www.api.com/softworx.asp ) ومعالجة الحد الأدنى. تم جمع عموما المتعاقبة Z-طائرات 0،2-0،4 ميكرون على فترات.
6. ممثل النتائج
مستويات كثافة مضان في الخلايا تحولت فرداني: ويتضح مستوى مضان في النباتات الاحاديه فى S1 الشكل. قبل الصليب، والفحص أثبتت أن epifluorescent أساسا جميع transformants GFP كانت خضراء وأن جميع transformants mCherry، على الرغم من خفوتا في كثير من الأحيان، كانت حمراء. لضمان أن جميع الخلايا المستخدمة للصليب كانت في الواقع الفلورسنت، واستخدمنا حيوانية مع إشارة ألمع الفلورسنت.
العائد: After هذا النوع الأولي، و+ + عينة الأحمر الأخضر (الشكل S2) عادة ما تضم 8-20٪ من عدد المدخلات من الخلايا وعدد كبير من الخلايا فرداني، ربما بسبب التصاق الخلايا خلايا الثابتة. لأنه لا يتحقق تخصيب عالية مع نوع واحد، يجب أن تكون العينة النقية جزئيا التحقيق sonicated مرتين في السعة 60٪ تليها إعادة الفرز. (أنواع استعادة الماضي عادة بين 1-2 ساعة، في حين أن النوع الثاني يتطلب سوى 15 دقيقة) من الخلايا تخضع لنوع الثاني، شملت + أحمر أخضر + عينات 23-52٪ من خلايا الإدخال.
أظهرت دراسة بواسطة المجهر النقيض من المرحلة أن نقاء إعداد اقحة النهائي بلغ متوسط ما يقرب من 90٪ أكثر من 21 التحضير (تتراوح بين 86٪ إلى 91٪): الفحص المجهري المرحلة. كانت الملوثات إما أخضر أو أحمر النباتات الاحاديه، أو زوجا من النباتات الاحاديه التي كانت على اتصال مع بعضها البعض. الشكل 3 في المئة من بجدولة بيضات ملقحة التي لديهالا برعم والبراعم وسطي (MED)، براعم الجانبية (اللات) أو البراعم الطرفية (المدى)، وعدد من النباتات الاحاديه الاقتران من نفس اللون ("2Same") أو لون مختلف ("2Hap")، النباتات الاحاديه الفردية وكذلك ( HAP). وعندما كانت تحصد الخلايا بعد 1،75 ساعة، unbudded أكثر من 50٪ ومثلت الفئات الفرعية الأخرى على قدم المساواة (مع البراعم، والإنسي الوحشي، أو محطة). بعد 2،5 ساعة كانت هناك أعداد متساوية تقريبا من بيضات ملقحة في كل من الفئات الأربع (unbudded، مع البراعم، والإنسي الوحشي أو محطة).
ملاحظات مجهرية (الشكل 4):
هيكل بيضات ملقحة يبدو أن تبقى على حالها خلال تنقية. وفقا لمدة الصليب، كان السكان بنسب مختلفة من بيضات ملقحة unbudded وازهر، كما هو موضح أعلاه. نظرا لأن كلا من النباتات الاحاديه الأخضر والأحمر وأظهرت تباين كبير في شدة إشارة الفلورسنت، وكانت بعض بيضات ملقحة الحمراء في الغالب في حين أن آخرين كانوا في الغالب الخضراء، كما لوحظ من قبل comparin ز الصور أحادية اللون إلى الصور مجتمعة في الشكل 4. نلاحظ أيضا أن GFP (MW 26kDa) يدخل نواة ويمكن العثور عليها في النواة حتى عندما نوى لم تنصهر. الفجوات تبرز بوصفها مجالات غير الفلورية السوداء.
المنتج النهائي من تنقية ينتج مجموعة متنوعة من السكان في مراحل مختلفة من التنمية. المسمى بيضات ملقحة A الانصهار لم تخضع. وunbudded نوع B بيضات ملقحة. نوع C يكون برعم صغير. D نوع يكون لها أكبر برعم، ونوع E بيضات ملقحة على وشك الخضوع الانقسام السيتوبلازمي. نلاحظ أيضا أن الكثير من بيضات ملقحة في وقت سابق يحمل تزال غير الفلورسنت خط تقسيم الإنسي (*)، والتي يمكن في كثير من الأحيان فجوي "هيكل الميراث" (I) 12 أن ينظر إلى تمتد من البيضة الملقحة في مهدها. في بعض الحالات، إعادة توزيع الإشارة الخضراء في الشريك إلى حد أكبر بكثير من أن الاشارة الحمراء. هذا يعكس التأخير في نقل التي هي من سمات polysomes (Tartakoff، قيد الإعداد).
الحمار = "jove_content"> بدءا من زوج من الثقافات لوغاريتمي 5 مل من الخلايا فرداني، نستعيد تقريبا 1-2 × 10 6 بيضات ملقحة، وهو ما يكفي لimmunoblots كثيرة، باستخدام إجراءات الكشف chemiluminescent. باستخدام بروتوكولات العزل الفينول كلوروفورم نحن استخراج حوالي 1.5 ملغ من الحمض النووي الريبي من هذا العدد من الخلايا.
منذ تم برد بيضات ملقحة تنقيته، قبل إجراء مزيد من التحليل نوصي الحضانة عند 23 درجة مئوية في المتوسط النمو.
الشكل 1. التسلسل الزمني لتشكيل البيضة الملقحة. بيضات ملقحة كمادة وسيطة بين النباتات الاحاديه وdiploids. هذا الرسم البياني يبين تفعيل الكلاسيكية (shmooing) من النباتات الاحاديه، والانصهار فيها، وتشكيل برعم الأولي. يمكن أن تكون براعم الإنسي إما (M)، الأفقي (L) أو محطة (T).
الشكل 3. تم حصادها من أصناف بيضات ملقحة في مخاليط التزاوج تنقية الكسور. بعد 1،75 ساعة أو 2.5 لاستعادة الكسور المخصب في مقابل بيضات ملقحة في وقت مبكر نسبيا أكثر نضجا نسبيا. وأجريت ثمانية تجارب مستقلة، يعينه ألوان مختلفة، لكل نقطة الوقت. الرسوم البيانية تشير إلى الأعداد النسبية للبيضات ملقحة التي هكتارهاء أنماط متميزة من الناحية المكانية تشكيل برعم. نظرا للمدة وجيزة من الحضانة (أقل من 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة) لاحظ جميع البراعم هي الأولي في مهدها لاقحي الأحداث.
الشكل 4. تم فحص DeltaVision فحص كسور المخصب. حقل نموذجي بواسطة المجهر Deltavision. الرسوم التوضيحية تظهر إما على حد سواء الألوان الأحمر والأخضر أو واحد. الأحمر يتوافق مع التسمية polysomal (Rpl25p-mCherry) والأخضر لGFP عصاري خلوي. لاحظ تخصيب عالية من بيضات ملقحة، والميزات المخصصة التحت خلوية: في (V) الفجوات والبراعم (ب)، نواة (ن)، فجوي "هيكل الميراث" (ط)، وقسم (*) الذي يظهر لفصل الأبوية في المجالات بيضات ملقحة في وقت مبكر نسبيا. لون متغير بشكل عام يعكس كثافة النسبية للأن تنصهر النباتات الاحاديه. في الحالات التي المجالات اثنين الوالدين الاحتفاظلون مميز، وكان من علامات موازنة (GFP حشوية، mCherry الموسومة polysomes) غير مكتملة. الوقت الفاصل بين الدراسات تبين أن التقدم في إعادة توزيع GFP للذوبان قبل polysomes. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
أساطير التكميلية
الرقم S1. تم فحص الخلايا معربا عن polysomes mCherry الموسومة للكشف عن إشارة خضراء: مضان من الخلايا فرداني أقصى اليسار. تم تعيين إطار مستطيل لتجنب الخلايا السلبية. الرسم البياني الأوسط: تم تحليل الخلايا معربا عن GFP عصاري خلوي، والتي تبين بوضوح مشرق السكان من ايجابيات كبيرة. اليمين المتطرف: تم تحليل الخلايا معربا عن polysomes mCherry الموسومة. المستطيل (مماثلة لأهلية على أقصى اليسار) ويشمل ألمع الخلايا ويسمح لجميعيجب تجنب السلبيات. تعيين "R2" يشير إلى النسبة المئوية للخلايا داخل المستطيل تعافى المشار إليه.
الرقم S2. توزيع الخلايا في الفرز الأول والثاني. هذه المؤامرات اللونين تشير إلى نسبة الخلايا + + الأحمر الأخضر في الربع العلوي الأيمن (R5). هذه النسبة ترتفع إلى 52٪ في الفرز الثاني. المحور الأفقي: إشارة خضراء. المحور الرأسي: الاشارة الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توافر بيضات ملقحة تنقية ينبغي أن تيسر الدراسات البيوكيميائية بما في ذلك البروتيوميات، وtranscriptomics lipidomics، وكذلك التحقيق في الآليات التي تخضع لدورة الخلية بيضات ملقحة إعادة الدخول، إعادة عرض الحائط الخلية، والخصائص الناشئة والميراث، وما إلى ذلك وبدلا من ذلك، يمكن إنشاء ابتداء بيضات ملقحة مع سلالات تحمل طفرات مميزة في أحد الوالدين أو كليهما. وعلاوة على ذلك، فإن بيضات ملقحة تنقيته، أما بالنسبة فرداني أو مضاعفا الخلايا، يمكن تجميد في المتوسط تحتوي على 15٪ والجلسرين إذابة في وقت لاحق لرصد جوانب مهدها المتكررة.
التجارب الأولية باستخدام علامات الفلورسنت أخرى مناسبة لأغراض المجهرية (الهستونات المفتاحية مثل البروتينات أو الميتوكوندريا) لم تسمح الانتعاش موثوق بيضات ملقحة، ومع ذلك، فمن المرجح أنه يمكن تحقيق تنقية مماثلة بدءا من الخلايا التي فرداني جدار الخلية اقترن إلى الأحمر أو الأخضر fluorophores. لقد تجنبنا قإجراءات اوك لأنها قد يفرض ضغوطا إضافية تؤثر والمراحل الأولى من تشكيل البيضة الملقحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور مايكل R. Sramkoski للمساعدة في التدفق الخلوي، والدكتور والدكتور جايسوال بورنيما وو دي لفي وقت سابق المدخلات وAylyarov ايليا للحصول على مساعدة مع الرسوم التوضيحية. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM089872 والخلوي ومرفق التصوير الأساسية المجهر المركز الشامل للسرطان حالة (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
