Summary
For at oprense zygoter af
Abstract
Zygoter er vigtige mellemprodukter mellem haploide og diploide stater i livscyklus mange organismer, herunder gær (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat af fusion af haploide celler af forskellig parringstype (MATa, MATalpha) og give anledning til tilsvarende stabile diploider, der successivt genererer så mange som 20 diploid afkom som følge af deres påfaldende asymmetriske mitotiske afsnit 2. Zygote formation organiseret af en kompleks sekvens af begivenheder: I denne proces binder opløselige hinanden passende faktorer til beslægtede receptorer, udløser receptormedierede signaleringskaskader, der letter afbrydelse af cellecyklussen og de samles i celle-cellefusion. Zygoter kan betragtes som en model for stamcelle eller stamcelle-funktion.
Selv om meget er blevet lært om dannelsen af zygoter og selvom zygoter er blevet anvendt til at undersøge celle-molekylære spørgsmål af generel betyicance, næsten alle studier har gjort brug af samvirkende blandinger, hvori zygoter er blandet med et flertal population af haploide celler 3-8. Mange aspekter af biokemi af zygote dannelse og den fortsatte liv i det befrugtede æg derfor fortsat ikke undersøgt.
Rapporter om oprensning af gær zygoter beskriver protokoller baseret på deres sedimentation egenskaber 9; dog dette sedimentation-baserede procedure ikke giver næsten 90% renhed i vores hænder. Desuden har den den ulempe, at celler udsættes for hypertonic sorbitol. Vi har derfor udviklet en alsidig oprensningsprocedure. Til dette formål blev par af haploide celler, der udtrykker røde eller grønne fluorescerende proteiner co-inkuberes for at tillade zygote formation, høstet på forskellige tidspunkter, og de resulterende zygoter blev oprenset under anvendelse af en flow-cytometri-baseret sortering protokol. Denne teknik giver en bekvem visuel vurdering af renhed og modning. Den gennemsnitlige renhedsgradaf fraktionen er omkring 90%. Ifølge timingen af høsten, kan zygoter af varierende grader af modenhed skal tilbagebetales. De oprensede prøver giver et bekvemt udgangspunkt for "-miske" undersøgelser, til inddrivelse af initial afkom, og for systematisk undersøgelse af denne progenitorcelle.
Protocol
1. Haploide Cell Growth
- Grow S. cerevisiae-celler fra S288C baggrund (BY4741) under standardbetingelser 10.
- Omdan haploider at udtrykke en af to iøjnefaldende fluorescerende markører 10. De markører er opløselige GFP udtrykkes i cytoplasmaet (pEG220, URA3/YIp, lineariseret med BglII 11) og en enkelt ribosomale protein, RPL25, fusioneret med mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, fra A. Johnston). Vi forventer, at ækvivalente tofarvet oprensningsprotokoller kunne gøre brug af andre lyst fluorescerende proteiner, der syntetiseres af de haploide parentale celler. Alternativt kan cellevæggen mærkes med fluorescerende lectiner.
- Dagen før zygote rensning, podes 5 ml kulturer af hver celletype, og dyrke dem under omrystning natten over ved 23 ° C for at opnå A600 på højst 1,0. Grow GFP-transformanter (ATY4442) i komplet syntetisk medium herunder 2% glucose (CSM-glucose) ennd RPL25-mCherry transformanter (ATY4552) i syntetisk selektivt medium uden uracil 10. Opretholde parallelle kulturer af hver celletype under omrystning ved stuetemperatur.
2. Gennemførelse af en Cross
- Justere den optiske densitet (A600) i hver prøve til 1,0 i frisk medium. [1 Optical Density Unit ~ 3 x 10 7 celler / ml]
- Bland lige store volumener af de to kulturer, vortexes kort 3 gange, efterfulgt af en længere vortex i 10 sek.
- Forbered CSM-glucoseplader. Pladerne er identiske med dem, der anvendes til rutinemæssig vækst og er blevet tørret 45 minutter efter at hælde og størkning af agaren 10.
- Distribuere så mange som tyve 40 ml dråber af blandingen 1 cm fra kanten af overfladen af CSM-glucoseplader. Når dråberne først påføres overfladen starte timeren for at måle den forløbne tid. Når væsken er blevet absorberet (ca. 30 minutter), dække pladerne og lade dem uforstyrret ved room temperatur.
3. Høst Forberedelser
- Høst prøver efter 1,75-2,5 timer ved 23 ° C ved flere gange vaskning individuelle tørrede dråber fra pladen under anvendelse af 150 ml kold CSM-glucose, holde pladerne på is. Gentagne gange vaskes droplet området fra 10 til 20 gange med det samme medium for at maksimere genvinding. Saml i 15 ml Falcon-rør på is.
- Probe sonikeres prøverne 10x ved 60% amplitude med en Fisher FB120 sonikator (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) på is.
- Bekræft i en fase mikroskop at få eller ingen aggregater tilbage. 15-50% af cellerne forventes at have dannet zygoter på dette tidspunkt.
- Forlader røret af celler i en vertikal position uforstyrret på is i 10 min som en yderligere sikkerhedsforanstaltning (for at tillade aggregater til afvikling).
- Gendan den øverste 90% af volumen og filtrere det gennem en nylon mesh (BD Falcon polypropylen rør med filter hætte (Ref 352.235)). I et typisk eksperiment, 10 7 cellerudvundet fra én plade var på dette tidspunkt fortyndet i 4 ml CSM-glucose.
4. Flowcytometri
- Sortere celler ved anvendelse af Sony iCyt Reflection Model flowcytometer, (Highly Automated Parallel Sorter) HAPS1 med en 100 micron spids. For GFP excitation, bruge den blå argon-ion, 250 milliwatt laser ved 488 nm. For mCherry excitation, skal du bruge 100 milliwatt laser ved 561 nm. Selv om vi ikke har erfaring med andre maskiner, forventer vi, at Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx eller Beckman Coulter MoFlo XDP ville være fint, når udstyret med de korrekte lasere.
- Base sortering parametre på en fremadrettet vs tilbage punktdiagram med henblik på at gate på levedygtige celler. Etablere en emission plot af 615 + / - 30 nm båndpasfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm båndpasfilter (GFP) at opdele begivenhederne i fire kvadranter, "Rød + Grøn-", "Rød + Grøn +", "Red- grøn-"og" rød-grønne + "(fig. S2). Anvende ikke-fluorescerende celler som en standard feller bestemmelse af "Red-Green-" kvadrant.
- Sortere celler med et hylster tryk på 21,5 psi, en smådråbe frekvens på 43.400 dråber / sek, og en prøve tryk på 20,5 psi.
- Initial Sorter ("Recovery Mode"): Saml prøver i kølet Eppendorf-rør indeholdende 250 ml kold CSM-glucose. Sediment 10 sek ved tophastighed i en afkølet mikrocentrifuge (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) og opsug flow opløsning (Flowcytometri kappe (PBS med 1 mM EDTA) BioSure katalog nr. 1027). Resuspender i 500 ml kold CSM-glucose.
- Anden Sorter ("Purity Mode"): Udfør den slags som den oprindelige slags, ved hjælp af "renhed mode" valgmulighed. Sediment det oprensede celler og resuspenderes pellets i 500 ml-1.0 ml CSM-glucose. Rystes i 15 minutter i plader med 24 brønde ved 23 ° C for at tillade metabolisk recovery.
5. DeltaVision Microscopy
- Forbered agarose puder som følger: Bring en suspension af 1,5% Agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15.510-07) i CSM-glucose til en byld, vortex kortvarigt, og derefter anvende 0,3 ml prøver af agaroseopløsningen til overfladen af horisontale standard objektglas og dække dem på én gang med en anden slæde (uden påføring af tryk).
- Efter afkøling i 10 minutter, fjernes forsigtigt den øvre slæde ved at skubbe det horisontalt, idet man efterlader en glat overflade og ikke at forstyrre Agarose lag. (Når den øvre slæde er fjernet, bør prøven af celler kan anvendes inden for 1-2 min. Når opbevares i et fugtigt kammer ved stuetemperatur uden at fjerne den øvre slæde, kan puder opbevares i op til en dag før brug.)
- Sedimentprøver og depositum 1 ml prøver af pelleten på agarose puder (uden at berøre overfladen). Umiddelbart dække prøven med en firkantet nr. 1 dækglas. Trim væk overskydende agarose med et enægget barberblad. Forsegl præparater med vaseline dispenseres fra en sprøjte.
- Billedet ved hjælp Deltavision (Applied Precision) med en 100x olieimmersionslinse mål uden binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40, ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve z-stakke ved hjælp af softWoRx 5.0.0 programmet ( http://www.api.com/softworx.asp ) og behandle minimalt. Skiftende z-fly blev generelt indsamlet på 0,2-0,4 mikrometer intervaller.
6. Repræsentative resultater
Fluorescensintensitet niveauer i transformerede haploide celler: Graden af fluorescens i haploider er vist i fig S1. Før korset, epifluorescerende undersøgelse viste, at stort set alle GFP transformanter var grøn, og at alle mCherry transformanter, men ofte svagere, var røde. For at sikre, at alle celler, der anvendes til korset faktisk var fluorescerende, vi brugte subpopulationen med den lyseste fluorescerende signal.
Udbytte: After den oprindelige art, til rød + grøn + prøve (fig. S2) omfatter typisk 8-20% af den indgående antallet af celler og et uforholdsmæssigt antal af haploide celler, måske som følge af vedvarende celle-celle-adhæsion. Da høj berigelse ikke opnås med en enkelt art, bør det delvist oprensede prøve være probe sonikeret to gange i 60% amplitude efterfulgt af fornyet sortering. (Recovery sorterer typisk varer mellem 1-2 timer, mens den anden slags kræver kun 15 min.) Af cellerne udsættes for den anden sortering, de Rød + Grøn + prøver omfattede 23-52% af den tilførte celler.
Fase mikroskopisk undersøgelse: Undersøgelse af fasekontrastmikroskopi viste, at renheden af det færdige zygote præparat gennemsnit cirka 90% over 21 præparater (fra 86% til 91%). Kontaminanterne var enten grønne og røde haploider, eller par af haploider, der var i kontakt med hinanden. Figur 3 tabulates procentdelen af zygoter der haringen bud, mediale knopper (Med), laterale knopper (Lat) eller terminale knopper (Term), antallet af parrede haploider af samme farve ("2Same") eller anden farve ("2Hap"), samt individuelle haploider ( Hap). Når celler blev høstet efter 1,75 time blev mere end 50% unbudded og de andre underkategorier (med mediale, laterale eller terminal knopper) var ligeligt repræsenteret. Efter 2,5 timer var der cirka lige mange zygoter i hver af fire kategorier (unbudded, med mediale, laterale eller terminal knopper).
Mikroskopiske observationer (figur 4):
Strukturen af zygoter synes at forblive uændret under oprensning. Ifølge varigheden af korset, havde befolkningen forskellige andele af unbudded og okulerede zygoter, som forklaret ovenfor. Da både de grønne og røde haploider viste stor variation i fluorescerende signal intensitet, nogle zygoter var overvejende rødt, mens andre var overvejende grøn, som er observeret ved comparing de ensfarvede billeder til de kombinerede billeder i figur 4. Bemærk også, at GFP (MW 26kDa) kommer ind i kernen og kan findes i kernen, selv når kernerne ikke fusioneret. Vakuoler skiller sig ud som sorte ikke-fluorescerende kugler.
Slutproduktet af oprensning giver en meget forskelligartet befolkningsgruppe på forskellige udviklingsstadier. Zygoter mærket A ikke har undergået fusion. Type B zygoter er unbudded. Type C har en lille knop. Type D have en større knop, og Type E zygoter er ved at gennemgå cytokinese. Bemærk også, at mange af de tidligere zygoter stadig udviser en ikke-fluorescerende mediale division line (*), og at vakuolær "arv struktur" (I) 12 kan ofte ses at strække sig fra zygote til knop. I nogle tilfælde har det grønne signal omfordeles til partneren i langt højere grad, at det røde signal. Dette afspejler forsinkelsen af overdragelsen, der er karakteristisk for polysomer (Tartakoff, under udarbejdelse).
6 zygoter, hvilket er tilstrækkeligt for mange immunoblots under anvendelse af kemiluminescens-detektion procedurer. Ved hjælp af phenol-chloroform isolation protokoller vi udvinder 1,5 mg af RNA fra dette antal celler.
Da de oprensede zygoter er blevet afkølet, før yderligere analyse anbefales inkubation ved 23 ° C i vækstmedium.
Figur 1. Kronologisk oversigt over zygote dannelse. Zygoter som en mellemting mellem haploider og diploider. Dette diagram viser den klassiske aktivering (shmooing) af haploider, deres fusion, og dannelsen af den oprindelige bud. Knopper kan enten mediale (M), lateral (L) eller terminal (T).
Figur 3. Sorter af zygoter i de oprensede fraktioner. Parring blandinger blev høstet efter 1,75 eller 2,5 time at inddrive fraktioner beriget i relativt tidligt vs relativt mere modne zygoter. Otte uafhængige forsøg, der er udpeget af de forskellige farver, blev udført for hvert tidspunkt. Graferne viser det relative antal af zygoter som have rumligt separate mønstre i opløbet dannelse. I betragtning af den korte varighed af inkubationen (mindre end 2,5 timer ved stuetemperatur) alle observerede knopper er indledende zygotiske spirende begivenheder.
Figur 4. DeltaVision undersøgelse af berigede fraktioner. En typisk felt blev undersøgt ved Deltavision mikroskopi. Illustrationerne viser enten både røde og grønne eller single farver. Den røde svarer til polysomal etiket (Rpl25p-mCherry) og den grønne til cytosoliske GFP. Bemærk den høje berigelse af zygoter, og de udpegede subcellulære egenskaber: vakuolerne (v), knopper (b), nucleus (n), vakuolær "arv struktur" (i), og skillevæggen (*), som synes at adskille den parentale domæner i forholdsvis tidlige zygoter. Deres variable generelle farve illustrerer den relative intensitet af de haploider at smeltet. I tilfælde, hvor de to parentale domæner bevareten tydelig farve, ækvilibrering af markører (cytoplasmatisk GFP, mCherry-mærkede polysomer) var ufuldstændige. Time-lapse igangværende undersøgelser viser, at opløselige GFP omfordeler før polysomer. Klik her for at se større figur .
Supplerende Legends
Figur S1. Fluorescens af haploide celler Yderst til venstre:. Celler, der udtrykker mCherry-mærkede polysomer blev undersøgt for at påvise et grønt signal. Det rektangulære vindue blev indstillet til at undgå de negative celler. Middle graf: Celler, der udtrykker cytosolisk GFP blev analyseret, viser tydeligt lyse større population af positiver. Far til højre: Celler, der udtrykker mCherry-mærkede polysomer blev analyseret. Rektanglet (identisk med længst til venstre) indeholder de lyseste celler og giver allenegativer kan undgås. Betegnelsen "R2" angiver procentdelen af celler udvundet inden for det angivne rektangel.
Figur S2. Cell fordeling i første og anden sortering. Disse tofarvede plots viser andelen af grønne + Rød +-celler i øverste højre kvadrant (R5). Denne andel stiger til 52% i den anden slags. Vandret akse: grønt signal. Lodret akse: rødt signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilgængeligheden af oprensede zygoter bør lette biokemiske undersøgelser, herunder transcriptomics, proteomics og lipidomics samt undersøgelse af mekanismer, hvorved zygoter undergår cellecyklus genindrejse, cellevæg remodeling, spirende og arv egenskaber, etc. Alternativt kunne zygoter blive genereret start med stammer, der bærer karakteristiske mutationer i en eller begge forældre. Endvidere er de oprensede zygoter, som for haploide eller diploide celler, kan fryses i medium indeholdende 15% glycerol og senere optøet at overvåge aspekter af tilbagevendende spirende.
Indledende forsøg under anvendelse af andre fluorescerende markører er egnede til mikroskopiske formål (f.eks mærkede histoner eller mitokondrielle proteiner) ikke tilladt pålidelige genvinding af zygoter, men det er sandsynligt, at tilsvarende oprensning kan opnås begyndende med haploide celler, hvis cellevægge er blevet koblet til rød eller grønne fluoroforer. Vi har undgået sådanne procedurer, da de kunne stille yderligere stress og påvirke tidlige stadier af zygoten formation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Michael Sramkoski for hjælp med flowcytometri, Dr. Purnima Jaiswal og Dr. Di Wu for tidligere input og Ilya Aylyarov om hjælp med illustrationerne. Støttet af NIH Grant R01GM089872 og Cytometry & Imaging Microscopy Core Facility for Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
