Cytométrie en flux à base de purification de Published: September 21, 2012 doi: 10.3791/4197

DOI

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Serendipity Zapanta Rinonos^1,2, Jeremy Saks¹, Jonida Toska³, Chun-Lun Ni^1,2, Alan M. Tartakoff^1,2

¹Department of Pathology, Case Western Reserve University School of Medicine, ²Cell Biology Program, Case Western Reserve University School of Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

Pour purifier les zygotes de

Abstract

Zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les haploïdes et diploïdes états du cycle de vie de nombreux organismes, y compris la levure (Figure ¹⁾ 1. S. cerevisiae zygotes résultat de la fusion de cellules haploïdes de type sexuel distinct (MATa, MATalpha) et donner lieu à des correspondants diploïdes stables qui génèrent successivement jusqu'à 20 descendance diploïde en raison de leurs divisions mitotiques étonnamment asymétriques ^2. Formation Zygote est orchestré par une séquence complexe d'événements: Dans ce processus, les facteurs d'accouplement solubles se lient aux récepteurs apparenté, déclenchant médiés par le récepteur cascades de signalisation qui facilitent l'interruption du cycle cellulaire et aboutir à fusion cellule-cellule. Zygotes peut être considéré comme un modèle pour les progéniteurs ou de la fonction des cellules souches.

Même si on a beaucoup appris à propos de la formation des zygotes et bien zygotes ont été utilisés pour étudier les cellules moléculaires des questions d'intérêt général Significance, presque toutes les études ont eu recours à des mélanges d'accouplement dans laquelle sont mélangés des zygotes avec une majorité de la population de cellules haploïdes ^3-8. De nombreux aspects de la biochimie de la formation du zygote et la vie continue du zygote restent donc d'une enquête.

Rapports de purification des zygotes levure décrire les protocoles basés sur leurs propriétés de sédimentation ^9; toutefois, cette procédure basée sur la sédimentation n'a pas donné près de 90% de pureté dans nos mains. En outre, elle présente l'inconvénient que les cellules sont exposées au sorbitol hypertonique. Nous avons donc mis au point un procédé de purification polyvalente. A cet effet, des paires de cellules haploïdes exprimant rouges ou verts protéines fluorescentes ont été co-incubées pour permettre la formation du zygote, récoltées à des moments différents, et les zygotes obtenus ont été purifiés en utilisant un protocole de triage par cytométrie de flux à base de. Cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation. La pureté moyennede la fraction est d'environ 90%. Selon le moment de la récolte, les zygotes de différents degrés de maturité peut être récupéré. Les échantillons purifiés fournir un point de départ commode pour les «-omiques» des études, pour la récupération de la descendance initiale, et une enquête systématique de cette cellule souche.

Protocol

1. La croissance des cellules haploïdes

1. Cultivez S. cerevisiae S288C de l'arrière-plan (BY4741) dans des conditions normales ^10.
2. Transformez haploïdes pour exprimer l'un des deux marqueurs fluorescents visibles ^10. Les marqueurs de choix sont la GFP soluble exprimée dans le cytoplasme (pEG220, URA3/YIp, linéarisé avec BglII ¹¹⁾ et une seule protéine ribosomique, RPL25, fusionné avec mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Nous nous attendons à ce que les protocoles de purification équivalent à deux couleurs pourrait utiliser d'autres protéines fluorescentes vives qui sont synthétisées par les cellules haploïdes parentales. Alternativement, la paroi cellulaire pourrait être étiqueté avec des lectines fluorescentes.
3. Sur la purification zygote veille, inoculer 5 ml de cultures de chaque type de cellule et les cultiver sous agitation durant la nuit à 23 ° C pour atteindre A600 ne dépassant pas 1,0. Croître les transformants GFP (ATY4442) dans un milieu synthétique complet, y compris 2% de glucose (CSM-glucose) une-RPL25 mCherry transformants (ATY4552) en milieu sélectif dépourvu d'uracile synthétique ^10. Maintenir des cultures parallèles de chaque type de cellule sous agitation à la température ambiante.

2. Réalisation d'une croix

1. Régler la densité optique (A600) de chaque échantillon à 1,0 dans un milieu frais. [1 ~ unité de densité optique 3 x 10 ⁷ cellules / ml]
2. Mélanger des volumes égaux des deux cultures, vortex brièvement 3 fois, suivies d'une longue vortex pendant 10 sec.
3. Préparer CSM-glucose plaques. Les plaques sont identiques à ceux utilisés pour la croissance et la routine ont été séchés 45 min après la coulée et la solidification de la gélose ^10.
4. Distribuer jusqu'à vingt 40-ml gouttelettes du mélange 1 cm du bord de la surface de plaques CSM-glucose. Lorsque les gouttelettes sont tout d'abord appliqué à la surface démarrer la minuterie pour mesurer le temps écoulé. Une fois que le liquide a été absorbé (environ 30 min), couvrir les plaques et les laisser reposer au rootempérature m.

3. Les préparatifs de récolte

1. Après la récolte des échantillons de 1,75 à 2,5 heure à 23 ° C par des lavages répétés individuels gouttelettes séchées à l'aide de la plaque 150 ml froid CSM-glucose, la tenue des plaques sur de la glace. Laver plusieurs fois le domaine des gouttelettes 10-20 fois avec le même milieu pour maximiser la récupération. Recueillir dans des tubes de 15 ml Falcon sur la glace.
2. Sonder soniquer les échantillons à une amplitude de 10x 60% avec un sonicateur Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) sur la glace.
3. Vérifiez dans un microscope à phase que les agrégats peu ou pas de rester. 15-50% des cellules sont censés avoir formé zygotes à ce stade.
4. Laisser le tube de cellules dans une position verticale au repos sur de la glace pendant 10 minutes comme précaution supplémentaire (pour permettre de régler les agrégats).
5. Récupérer la plus haute de 90% du volume et de la filtrer à travers un tamis en nylon (tube en polypropylène BD Falcon avec filtre bouchon (Ref 352235)). Dans une expérience typique, 10 ⁷ cellulesrécupéré d'une plaque étaient à ce point diluée dans 4 ml de CSM-glucose.

4. Cytométrie en flux

1. Trier les cellules en utilisant le modèle Sony réflexion ICYT cytomètre de flux, (hautement automatisée Trier parallèle) HAPS1 avec une pointe de 100 microns. Pour l'excitation GFP, utilisez le bleu argon-ion, 250 milliwatt laser à 488 nm. Pour l'excitation mCherry, utilisez le laser de 100 milliwatts à 561 nm. Même si nous n'avons pas d'expérience avec d'autres machines, nous nous attendons à ce que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Afflux ou Beckman Coulter MoFlo XDP serait bien s'il est équipé des lasers appropriés.
2. Base de paramètres de tri sur un terrain de diffusion vers l'avant vs rentré dans l'ordre à la porte des cellules viables. Établir un complot émission de 615 + / - 30 passe-bande nm filtre (mCherry) par rapport à 525 + / - 25 passe-bande nm filtre (GFP) pour diviser les événements en quatre quadrants, "rouge + vert-", "rouge + vert +", "rouge- Green-»et« Rouge-Vert + "(figure S2). Utilisez cellules non fluorescentes comme une norme fou la détermination du "Rouge-Vert-" quadrant.
3. Trier les cellules avec une pression de 21,5 psi gaine, une fréquence goutte de 43.400 gouttes / s, et sous une pression de 20,5 psi échantillon.
4. Trier initiale ("Recovery Mode"): Prélever des échantillons dans des tubes Eppendorf réfrigérées contenant 250 ml d'eau froide CSM-glucose. Sédiments 10 sec à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse réfrigérée (Tomy MRX-150, 15.000 tours par minute) et aspirer la solution de flux (solution gaine de cytométrie en flux (PBS avec 1 mM d'EDTA) Catalogue BioSure N ° 1027). Remettre en suspension dans 500 ml froid CSM-glucose.
5. Trier seconde (mode "Pureté"): Réaliser le genre comme pour le tri initial, en utilisant le mode "pureté" option. Sédiments l'. Cellules purifiées et remettre en suspension les culots dans 500 ml 1,0 ml CSM-glucose Agiter pendant 15 min dans des plaques 24 puits à 23 ° C pour permettre la récupération métabolique.

5. Microscopie DeltaVision

1. Préparer tampons d'agarose comme suit: Apportez une suspension de 1,5% d'agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, catalogue 15510-07) in CSM-glucose à ébullition, homogénéiser brièvement au vortex, puis appliquez échantillons 0,3 ml de la solution d'agarose à la surface des lames de verre horizontaux standard et les couvrir à la fois avec une deuxième lame (sans application d'une pression).
2. Après refroidissement pendant 10 minutes, retirez délicatement le chariot supérieur en le faisant glisser horizontalement, en prenant soin de laisser une surface lisse et ne pas perturber la couche d'agarose. (Lorsque le chariot supérieur a été retiré, l'échantillon de cellules doit être appliqué dans les 1-2 min. Lorsqu'il est conservé dans une chambre humide à température ambiante sans enlever le chariot supérieur, plaquettes peuvent être conservées pendant une journée avant de l'utiliser.)
3. Des échantillons de sédiments et dépôt aliquotes de 1 ml de la pastille sur des patins d'agarose (sans toucher la surface). Couvrir immédiatement l'échantillon avec un carré n ° 1 lamelle. Coupez l'excès d'agarose avec une lame de rasoir à un seul tranchant. Sceller les préparations avec de la vaseline distribués à partir d'une seringue.
4. Image à l'aide Deltavision (Applied Precision) avec un objectif à immersion 100x sans binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
5. Déconvolutionner z-piles en utilisant le programme Softworx 5.0.0 ( http://www.api.com/softworx.asp ) et de traiter de façon minimale. Successives z-plans sont généralement collectées à 0,2-0,4 microns intervalles.

6. Les résultats représentatifs

Les niveaux d'intensité de fluorescence dans les cellules haploïdes transformées: Le niveau de fluorescence dans les haploïdes est illustré à la Figure S1. Avant la croix, l'examen épifluorescence démontré que pratiquement tous les transformants GFP étaient verts et que tous les transformants mCherry, bien que souvent plus faibles, étaient rouges. Afin de s'assurer que toutes les cellules utilisées pour la croix étaient en effet fluorescent, nous avons utilisé la sous-population la plus brillante signal fluorescent.

Rendement: Après le tri initial, le Rouge + Vert + échantillon (figure S2) comporte typiquement 8-20% du nombre de cellules d'entrée et un nombre excessif de cellules haploïdes, peut-être en raison de la persistance adhésion cellule-cellule. Depuis fort enrichissement n'est pas atteint d'une sorte unique, l'échantillon partiellement purifié la sonde doit être traité par ultrasons deux fois à une amplitude de 60% suivie de re-trier. (Sortes de récupération durent généralement entre 1-2 heures, tandis que le deuxième type ne nécessite que 15 min.) Sur les cellules soumises à la seconde espèce, les rouge + vert + échantillons inclus 23-52% des cellules d'entrée.

Examen microscopique phase: Examen par microscopie à contraste de phase a montré que la pureté de la préparation finale zygote en moyenne à environ 90% de plus de 21 préparations (allant de 86% à 91%). Les contaminants sont soit des haploïdes vertes ou rouges, ou de paires d'haploïdes ayant été en contact avec l'autre. Figure 3 pour cent de la dépouille qui ont zygotespas de bourgeon, bourgeons médians (Med), les bourgeons latéraux (Latitude) ou des bourgeons terminaux (Term), le nombre de paires haploïdes de la même couleur ("2Same") ou de couleur différente ("2Hap"), ainsi que haploïdes individuels ( Hap). Lorsque les cellules ont été récoltées après 1,75 h, plus de 50% ont été unbudded et les autres sous-catégories (avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux) étaient également représentés. Après 2,5 h, il y avait à peu près autant de zygotes dans chacune des quatre catégories (unbudded, avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux).

Observations microscopiques (figure 4):

La structure de zygotes semble pas modifié lors de la purification. Selon la durée de la croix, la population avait des proportions différentes de zygotes unbudded et fleuri, comme expliqué ci-dessus. Puisque les haploïdes vert et rouge ont montré une variation considérable dans l'intensité du signal fluorescent, certains étaient en majorité des zygotes rouge tandis que d'autres étaient à prédominance verte, comme cela est observé par Comparing les images monochromes aux images combinées dans la figure 4. Notez également que la GFP (MW 26 kDa) pénètre dans le noyau et peut être trouvé dans le noyau, même lorsque les noyaux n'ont pas fusionné. Vacuoles se démarquer en tant que noir non fluorescents sphères.

Le produit final de purification donne une population diversifiée à différents stades de développement. Zygotes étiquetés Une fusion n'ont pas subi. Type de zygotes B sont unbudded. Type C ont un petit bourgeon. Type D ont une plus grande bourgeon, et zygotes de type E sont sur le point de subir une cytokinèse. Notez également que la plupart des zygotes antérieures présentent encore une ligne non fluorescent division médiale (*), et que la «structure d'héritage" vacuolaire (I) ¹² peuvent souvent être vus à s'étendre à partir du zygote dans l'œuf. Dans certains cas, le signal vert a redistribué dans le partenaire dans une mesure beaucoup plus grande que le signal rouge. Cela traduit le retard de transfert, qui est caractéristique des polysomes (Tartakoff, en préparation).

6 zygotes, ce qui est suffisant pour immunoblots nombreux, en utilisant les procédures de détection de chimioluminescence. En utilisant des protocoles d'isolement au phénol-chloroforme on extrait environ 1,5 mg d'ARN à partir de ce nombre de cellules.

Depuis les zygotes purifiés ont été refroidie, avant de l'analyser, nous recommandons d'incubation à 23 ° C dans un milieu de croissance.

Figure 1. Chronologie de la formation du zygote. Zygotes comme un intermédiaire entre les haploïdes et diploïdes. Ce diagramme montre l'activation classique (shmooing) des haploïdes, leur fusion, et la formation de l'œuf initial. Bourgeons peut être soit interne (M), latérale (L) ou le terminal (T).

Figure 2. Schématique du protocole de purification zygote. Après incubation à la surface des plaques de gélose dans un milieu complet avec le glucose, le mélange de cellules est récupéré par lavage et ensuite soumis à un tri initial en mode "récupération" suivi d'un second type de mode de pureté ". " La couleur jaune signifie que les deux mCherry et les signaux de GFP étaient visibles dans les zygotes.

Figure 3. Variétés de zygotes dans les mélanges d'accouplement purifiés fractions. Ont été récoltées après 1,75 ou 2,5 heures pour récupérer des fractions enrichies en zygotes relativement tôt par rapport relativement plus mature. Huit expériences indépendantes, désignées par les couleurs distinctes, ont été réalisées pour chaque point dans le temps. Les graphiques indiquent le nombre relatif de zygotes qui have spatialement modèles distincts de formation des bourgeons. Compte tenu de la courte durée de l'incubation (moins de 2,5 h à température ambiante) tous les bourgeons initiaux observés sont zygotiques événements en herbe.

Figure 4. DeltaVision examen de fractions enrichies. Un domaine typique a été examinée par microscopie Deltavision. Les illustrations montrent soit des couleurs rouges et vertes ou unique. Le rouge correspond à l'étiquette polysomique (Rpl25p-mCherry) et le vert à la GFP cytosolique. Notez le fort enrichissement des zygotes et les caractéristiques subcellulaires désignés: les vacuoles (v), les bourgeons (b), le noyau (n), "structure d'héritage" vacuolaire (i), et la partition (*) qui semble séparer l'parentale domaines de zygotes relativement tôt. Leur couleur variable globale reflète l'intensité relative des haploïdes qui fusionnés. Dans les cas où les deux domaines retiennent parentalesune couleur distincte, l'équilibrage des marqueurs (GFP cytoplasmique, mCherry étiquetées polysomes) était incomplète. Time-lapse études en cours montrent que les redistribue GFP soluble avant polysomes. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Legends supplémentaires

Figure S1. Fluorescence des cellules haploïdes Extrême gauche:. Cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été examinés pour détecter un signal vert. La fenêtre rectangulaire a été créée pour éviter les cellules négatives. Graphique du milieu: Des cellules exprimant la GFP cytosolique ont été analysés, montrant la population nettement lumineux majeur de points positifs. Extrême droite: Les cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été analysés. Le rectangle (identique à celle de l'extrême gauche) comprend les plus brillants cellules et permet à tous lesnégatifs à éviter. La désignation «R2» indique le pourcentage de cellules récupérées dans le rectangle indiqué.

Figure S2. Répartition des cellules dans le tri premier et deuxième. Ces parcelles de deux couleurs indiquent la proportion de vert + rouge + cellules dans le quadrant supérieur droit (R5). Cette proportion augmente à 52% dans la seconde sorte. Axe horizontal: signal vert. Axe vertical: signal rouge.

Discussion

La disponibilité des zygotes purifiés devrait faciliter les études biochimiques, y compris la transcriptomique, la protéomique et la lipidomique, ainsi que des enquêtes sur les mécanismes par lesquels les zygotes subissent cycle cellulaire rentrée, remodelage de la paroi cellulaire, caractéristiques en herbe et à l'héritage, etc Alternativement, les zygotes pourraient être générés à partir avec des souches porteuses de mutations caractéristiques dans l'un ou les deux parents. En outre, les zygotes purifiés, comme pour les cellules haploïdes ou diploïdes, peuvent être congelés dans un milieu contenant 15% de glycerol et plus tard décongelés pour surveiller les aspects de bourgeonnement récurrente.

Des expériences préliminaires utilisant d'autres marqueurs fluorescents utilisables à des fins microscopiques (par exemple histones marqués ou des protéines mitochondriales) n'ont pas permis une récupération fiable des zygotes, mais il est probable que la purification comparable peut être obtenu à partir de cellules haploïdes dont la paroi cellulaire a été couplé au rouge ou fluorophores verts. Nous avons évité de se telles procédures, car ils pourraient imposer un stress supplémentaire et influer sur des stades précoces de la formation du zygote.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11)	E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry	A. Johnston
Fisher FB120 sonicator	Fisher Scientific
Polypropylene tube with strainer cap	BD Falcon	Ref 352235
Refrigerated microfuge	Tomy	MRX-150
Flow cytometry sheath solution	Biosure	1027
iCyt Reflection Model Flow Cytometer	Sony
DeltaVision deconvolution microscope	Applied Precision
Upright epifluorescence microscope	Leica
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-07
CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco)	10