Summary
Å rense zygoter av
Abstract
Zygoter er viktige mellomprodukter mellom haploid og diploid stater i livssyklusen til mange organismer, inkludert gjær (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat fra fusjon av haploide celler av distinkte parring type (Mata, MATalpha) og gi opphav til tilsvarende stabile diploider som suksessivt genererer så mange som 20 diploid avkom som et resultat av deres påfallende asymmetriske mitotiske divisjoner 2. Zygote formasjonen er orkestrert av en kompleks sekvens av hendelser: I denne prosessen, oppløselige parring faktorer bindes til beslektet reseptorer, utløser reseptormediert signalmolekyler kaskader som letter avbrudd av cellesyklusen og kulminerer i celle-celle-fusjon. Zygoter kan betraktes som en modell for stamfar eller stamcelletransplantasjon funksjon.
Selv om mye har blitt lært om dannelsen av zygoter og selv zygoter har blitt brukt til å undersøke celle-molekylære spørsmål av generell betydicance, nesten alle studier har benyttet seg av parring blandinger der zygoter er blandede med en majoritetsbefolkningen av haploide cellene 3-8. Mange aspekter av biokjemi zygote formasjon og den fortsatte livet av zygote derfor forbli undersøkte.
Rapporter om rensing av gjær zygoter beskriver protokoller basert på deres sedimentering egenskaper 9., men gjorde dette sedimentering-baserte prosedyren ikke gi nesten 90% renhet i våre hender. Videre har den den ulempe at cellene er utsatt for hyperton sorbitol. Vi har derfor utviklet en allsidig rensing prosedyre. For dette formålet ble par haploide celler som uttrykker røde eller grønne fluorescerende proteiner inkubert for å tillate zygoten formasjon, høstes på ulike tidspunkter, og de resulterende zygoter ble renset ved hjelp av en flowcytometri-basert sortering protokollen. Denne teknikken gir en praktisk visuell vurdering av renhet og modning. Gjennomsnittlig renhetav fraksjonen er ca 90%. Ifølge tidspunktet for høsting, kan zygoter av varierende grad av modenhet gjenopprettes. Renset prøvene gir en praktisk utgangspunkt for "-omic" studier, for gjenvinning av første avkom, og for systematisk undersøkelse av denne stamceller.
Protocol
1. Haploid Cell Vekst
- Grow S. cerevisiae celler fra S288C bakgrunn (BY4741) under standard betingelser 10.
- Transformere haploids å uttrykke en av to iøynefallende fluorescerende markører 10. Markørene av valget er løselig GFP uttrykt i cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearisert med Bglll 11) og en enkel ribosomal protein, RPL25, smeltet sammen med mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, fra A. Johnston). Vi forventer at tilsvarende to farger rensing protokoller kan gjøre bruk av andre brightly fluorescerende proteiner som er syntetisert av haploide foreldrenes celler. Alternativt kunne celleveggen merkes med fluorescerende lektiner.
- På dagen før zygote rensing, inokuler 5 ml kulturer av hver celletype og dyrke dem med risting over natten ved 23 ° C for å nå A600 høyst 1,0. Grow GFP transformanter (ATY4442) i fullstendig syntetisk medium inkludert 2% glukose (CSM-glukose) ennd RPL25-mCherry transformanter (ATY4552) i syntetisk selektivt medium mangler uracil 10. Vedlikeholde parallelle kulturer av hver celletype med risting ved romtemperatur.
2. Gjennomføre en Cross
- Juster den optiske tetthet (A600) av hver prøve til 1,0 i friskt medium. [1 optisk densitet Enhet ~ 3 x 10 7 celler / ml]
- Bland like mengder av de to kulturene, vortex kort 3 ganger, etterfulgt av en lengre vortex i 10 sek.
- Forbered CSM-glukose plater. Platene er identiske med de som brukes for rutinemessig vekst og har blitt tørket 45 min etter strømme og størkning av agaren 10.
- Distribuere så mange som tjue 40-ml dråper av blandingen 1 cm fra kanten av overflaten av CSM-glukose platene. Når dråpene første påført overflaten starte timeren for å måle tiden som har gått. Når væsken er blitt absorbert (ca. 30 min), dekker platene og la dem uforstyrret ved room temperatur.
3. Innhøsting Forberedelser
- Høste prøver etter 1,75 til 2,5 timer ved 23 ° C ved gjentatte vaske individuelle tørkede dråper av platen ved bruk av 150 ml kald CSM-glukose, holde platene på is. Gjentatte vaske dråpen området 10-20 ganger med det samme medium for å maksimere utvinningen. Samle seg i 15 ml Falcon-rør på is.
- Sondere sonicate prøvene 10x på 60% amplitude med en Fisher FB120 sonikator (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) på is.
- Kontroller i en fase mikroskop som få eller ingen aggregater gjenstår. 15-50% av cellene er forventet å ha dannet zygoter på dette punktet.
- Forlate røret av celler i en vertikal posisjon uforstyrret på is i 10 min som en ytterligere forholdsregel (for å tillate tilslag å avgjøre).
- Gjenvinn øverste 90% av volumet og filtrerer den gjennom en nylon mesh (BD Falcon polypropylenrør med sil hetten (Ref 352235)). I et typisk forsøk, 10 7 cellerutvinnes fra en plate ble på dette punktet fortynnes i 4 ml CSM-glukose.
4. Flowcytometri
- Sorter celler ved hjelp av Sony iCyt Reflection Modell flowcytometeret, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 med en 100 micron tips. For GFP eksitasjon, bruker du den blå argon-ion, 250 milliwatt laser på 488 nm. For mCherry eksitasjon, benytte 100 milliwatt laser på 561 nm. Selv om vi ikke har erfaring med andre maskiner, forventer vi at Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson tilstrømningen eller Beckman Coulter MoFlo XDP ville være fint når utstyrt med de riktige lasere.
- Base sortering parametere på en forward vs tilbake spredningsdiagram for å gate på levedyktige celler. Etablere et utslipp tomt på 615 + / - 30 nm båndpassfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm båndpassfilter (GFP) for å dele hendelsene i fire kvadranter, "Red + Green-", "Rød + Grønn +", "Red- grønn-"og" Red-Grønn + "(Figur S2). Bruk nonfluorescent celler som en standard feller bestemmelse av "Red-Green-" kvadrant.
- Sorter celler med en skjede press av 21,5 psi, en dråpe frekvens 43.400 dråper / sek, og et eksempel på trykk på 20,5 psi.
- Initial Sorter ("Recovery Mode"): Samle prøver i kjølt Eppendorf rør som inneholder 250 ml kaldt CSM-glukose. Sediment 10 sek på toppfart i en nedkjølt mikrosentrifuge (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) og aspirere flyten løsning (Flowcytometri skjede løsning (PBS med 1 mM EDTA) BioSure Catalog No 1027). Resuspender i 500 ml kaldt CSM-glukose.
- Second Sorter ("Purity Mode"): Gjennomføre slags som for første typen, med "renhet modus" alternativet. Sediment renset cellene og resuspender pellets i 500 ml-1,0 ml CSM-glukose. Rist i 15 min i 24-brønns plater ved 23 ° C for å tillate metabolsk utvinning.
5. DeltaVision Mikroskopi
- Forbered agarose pads som følger: Ta en suspensjon av 1,5% agarose (ultrarentAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) i CSM-glukose til en byll, vortex kort, og deretter bruker 0,3 ml prøver av agarose løsningen til overflaten av horisontale standard glassplater og dekke dem med en gang med en andre glider (uten trykk).
- Etter avkjøling i 10 min, fjern forsiktig øvre sleide ved å skyve den horisontalt, ta vare å forlate en glatt overflate og ikke til å forstyrre Agarose laget. (Når den øvre sleide er fjernet, bør prøven av celler påføres innen 1-2 min. Da holdt i et fuktig kammer ved romtemperatur uten å fjerne den øvre sleide, kan elektrodene lagres i opp til en dag før bruk.)
- Sedimentprøver og innskudd 1 ml alikvoter av pelleten for agarose pads (uten å berøre overflaten). Umiddelbart dekke prøven med en firkant No 1 dekkglasset. Klipp vekk overflødig agarose med en enkel gjennomgang barberblad. Forsegle preparater med vaselin utlevert fra en sprøyte.
- Bilde ved hjelp DeltaVision (Applied Precision) med en 100x neddyppingsobjektivet uten binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve z-stabler ved hjelp softWoRx 5.0.0 programmet ( http://www.api.com/softworx.asp ) og behandle minimalt. Etterfølgende z-flyene ble generelt samlet på 0,2 til 0.4 mikron intervaller.
6. Representant Resultater
Fluorescensintensitet nivåer i transformerte haploide celler: Nivået av fluorescens i haploids er illustrert i Figur S1. Før korset, epifluorescent undersøkelse viste at hovedsak alle GFP transformanter var grønn og at alle mCherry transformanter, selv om det ofte svakere, var røde. For å sikre at alle celler som brukes til korset var faktisk fluorescerende, brukte vi en undergruppe med den lyseste fluorescerende signal.
Yield: After den første typen, Red + Grønn + prøve (figur S2) inneholder vanligvis 8-20% av input antall celler og en overdreven antall haploide celler, kanskje på grunn av vedvarende celle-celle adhesjon. Siden høy anrikning ikke oppnås med en enkelt sortere, bør det delvis rensede prøven være sonden sonikert to ganger ved 60% amplitude etterfulgt av re-sortering. (Recovery sorterer vanligvis vare mellom 1-2 hr, mens den andre typen trenger bare 15 min.) Av cellene underkastet andre sorter, inkluderte Rød + Grønn + prøvene 23-52% av innsettingscellene.
Fase mikroskopisk undersøkelse: Undersøkelse etter fasekontrast mikroskopi viste at renheten av den endelige zygote forberedelse gjennomsnitt omtrent 90% over 21 preparater (som varierer fra 86% til 91%). Forurensningene var enten grønne eller røde haploids eller parene av haploids som var i kontakt med hverandre. Figur 3 tabulates prosenten av zygoter som haringen bud, mediale knopper (Med), lateral knopper (Lat) eller terminal knopper (Term), antall sammenkoblede haploids av samme farge ("2Same") eller annen farge ("2Hap"), så vel som individuelle haploids ( hap). Når cellene ble høstet etter 1,75 hr, ble mer enn 50% og de andre unbudded underkategorier (med mediale, lateral eller terminal knopper) ble likt representert. Etter 2,5 time var det omtrent like mange zygoter i hver av fire kategorier (unbudded, med medial, lateral eller terminal knopper).
Mikroskopiske Observasjoner (figur 4):
Strukturen av zygoter synes å forbli uendret under rensing. Henhold til varigheten av korset, hadde befolkningen forskjellige andeler av unbudded og budded zygoter, som forklart ovenfor. Siden både grønne og røde haploids viste betydelig variasjon i fluorescerende signal intensitet, var noen zygoter overveiende rødt mens andre var hovedsakelig grønt, som er observert ved comparing de ensfargede bilder til den kombinerte bilder i Figur 4. Merk også at GFP (MW 26kDa) entrer kjernen og kan bli funnet i kjernen selv når kjernene ikke har smeltet. Vakuoler skiller seg ut som svarte, ikke-fluoriserende kuler.
Sluttproduktet av rensing gir en mangfoldig befolkning på ulike stadier av utviklingen. Zygoter merket A ikke har gjennomgått fusjon. Type B zygoter er unbudded. Type C har en liten knopp. Type D har en større knopp, og Type E zygoter er i ferd med å gjennomgå cytokinese. Merk også at mange av de tidligere zygoter fremdeles oppviser en ikke-fluorescerende medial divisjon linje (*), og at den vacuolar "arv struktur" (I) 12 kan ofte ses å strekke seg fra zygote inn knoppen. I noen tilfeller, har den grønne signal omfordelt i partner til en mye større utstrekning rødt signal. Dette gjenspeiler forsinkelsen av overføringen som er karakteristisk for polysomes (Tartakoff, under forberedelse).
6 zygoter, som er tilstrekkelig for mange immunoblots, hjelp kjemiluminescerende deteksjons prosedyrer. Bruke fenol-kloroform isolasjon protokoller vi trekke omtrent 1,5 mg RNA fra dette antall celler.
Siden de rensede zygoter har vært kjølt, før videre analyse vi anbefaler inkubering ved 23 ° C i dyrkningsmedium.
Figur 1. Kronologi av zygote formasjon. Zygoter som et mellomledd mellom haploids og diploider. Dette diagrammet viser den klassiske aktivering (shmooing) av haploids, deres fusion, og dannelsen av den første bud. Knopper kan være enten mediale (M), lateral (L) eller terminalen (T).
Figur 3. Varianter av zygoter i de rensede fraksjoner. Mating blandinger ble høstet etter 1,75 eller 2,5 timer å gjenopprette fraksjoner beriket i relativt tidlige vs relativt mer moden zygoter. Åtte uavhengige eksperimenter, utpekt av distinkte farger, ble utført for hvert tidspunkt. Grafene viser den relative antall zygoter som have romlig forskjellige mønstre av bud formasjon. Gitt den korte varigheten av inkuberingen (mindre enn 2,5 timer ved romtemperatur) alle knopper observert er innledende zygotic spirende hendelser.
Figur 4. DeltaVision undersøkelse av beriket fraksjoner. En typisk feltet ble undersøkt av DeltaVision mikroskopi. Illustrasjonene viser enten både røde og grønne eller enkel farger. Den røde tilsvarer polysomal etiketten (Rpl25p-mCherry) og grønt til cytosoliske GFP. Obs høy anrikning av zygoter, og den utpekte subcellulære funksjoner: vakuoler (V), knopper (b), kjernen (N), vacuolar "arv struktur" (i), og skilleveggen (*) som ser ut til å skille foreldrenes domener i relativt tidlige zygoter. Deres variable samlet farge reflekterer den relative intensiteten av haploids som smeltet. I tilfeller der de to foreldrenes domener beholderen tydelig farge, var likevekt av markører (cytoplasmisk GFP, mCherry-merkede polysomes) ufullstendig. Time-lapse undersøkelser pågår viser at løselige GFP distribuerer før polysomes. Klikk her for å se større figur .
Utfyllende Legends
Figur S1. Fluorescens av haploide cellene Far venstre:. Celler som uttrykker mCherry-merket polysomes ble undersøkt for å oppdage et grønt signal. Det rektangulære vinduet ble satt for å unngå de negative celler. Middle grafen: Celler som uttrykker cytosoliske GFP ble analysert, viser tydelig lyse store bestand av positive. Helt til høyre: Celler som uttrykker mCherry-merket polysomes ble analysert. Rektangelet (identisk med helt til venstre) omfatter de skarpeste cellene og lar allenegativer å unngås. Betegnelsen «R2" indikerer prosentandel av celler utvinnes innenfor den indikerte rektangelet.
Figur S2. Cell distribusjon i første og andre sortering. Disse to-farge plott indikerer andelen grønn + Rød + celler i den øvre høyre kvadrant (R5). Denne andelen øker til 52% i den andre typen. Horisontal akse: grønt signal. Vertikal akse: rødt signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilgjengeligheten av rensede zygoter bør legge til rette biokjemiske studier inkludert transcriptomics, proteomikk og lipidomics, samt etterforskning av mekanismer som zygoter gjennomgår cellesyklus re-entry, celleveggen remodeling, spirende og arv egenskaper, etc. Alternativt kan zygoter bli generert starter med stammer bærer karakteristiske mutasjoner i en eller begge foreldre. Videre, de rensede zygoter, som for haploide eller diploide celler, kan fryses i medium inneholdende 15% glycerol og senere opptint å overvåke aspekter tilbakevendende spirende.
Foreløpige eksperimenter ved hjelp andre fluorescerende markører egnet for mikroskopiske formål (f.eks tagged histoner eller mitokondrie proteiner) har ikke tillatt pålitelig gjenoppretting av zygoter, men, er det sannsynlig at sammenlignbare rensing kunne oppnås starter med haploide celler der celleveggen har blitt koblet til rødt eller grønne fluoroforer. Vi har unngått such prosedyrer siden de kunne pålegge ekstra stress og påvirke tidlige stadier av zygote formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Michael Sramkoski for hjelp med flowcytometri, Dr. Purnima Jaiswal og Dr. Di Wu for tidligere innspill og Ilya Aylyarov for hjelp med illustrasjonene. Støttet av NIH Grant R01GM089872 og cytometri & Imaging Mikroskopi Kjerne Facility av Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
