Summary
Nous décrivons une méthode pour mesurer directement la force musculaire, la force musculaire, de la cinétique contractile et la fatigabilité des muscles squelettiques isolés dans un
Abstract
Décrit ici est une méthode de mesure de la contractilité des muscles squelettiques isolés. Des paramètres tels que la force musculaire, la force musculaire, de la cinétique contractile, la fatigabilité, la fatigue et la récupération après peuvent être obtenues à évaluer des aspects spécifiques du couplage excitation-contraction (ECC) de processus tels que l'excitabilité, contractile machines et Ca 2 + capacité de manutention. Cette méthode supprime l'innervation et de sang et se concentre sur le muscle squelettique isolé lui-même. Nous avons l'habitude d'utiliser cette méthode pour identifier les composantes génétiques qui altèrent la propriété contractile du muscle squelettique si moduler Ca 2 + voies de signalisation. Ici, nous décrivons un phénotype musculaire squelettique nouvellement identifiés, à savoir l'alternance mécanique, comme par exemple des informations diverses et riche qui peut être obtenu en utilisant le test in vitro avec la contractilité du muscle. Combinaison de ce test avec des dosages de cellules simples, des approches génétiques et biochimiquestests strY peut fournir des indications importantes sur les mécanismes de ECC dans le muscle squelettique.
Introduction
Attacher les muscles du squelette à os du squelette et de générer des forces de contraction sous le contrôle du système nerveux central. Couplage excitation-contraction (CEC) se réfère au processus de conversion d'un stimulus électrique à une réponse mécanique. Ca 2 + signalisation est une composante essentielle de la fonction contractile dans le muscle squelettique. Efficace de mobilisation de Ca 2 + du réticulum sarcoplasmique (SR) est une composante importante de la CPE en 1, 2 cellules musculaires, et les variations de Ca 2 + intracellulaire de signalisation sous-tendent la dysfonction contractile correspondant à un certain nombre de 3-5 maladies musculaires. Une évaluation correcte de la contractilité musculaire est essentiel et complémentaire à Ca 2 + imagerie et d'autres analyses afin de mieux comprendre en fonction du muscle squelettique, et pas seulement au niveau contractile, mais aussi au niveau cinétique. La force et la vitesse peuvent également être obtenus à informer la propriété importante d'la force musculaire et l'état du processus des CEC dans différentes conditions physiologiques et physiopathologiques.
Ce champ fécond de la recherche a une histoire très riche et de nombreuses théories de la contraction musculaire est apparu plus de deux millénaires 6. Recherche sur les muscles moderne commence probablement en 1674-1682 avec l'observation microscopique des stries transversales et des myofibrilles dans les fibres musculaires par Leeuwenhoek 6. Près d'un siècle plus tard, Luigi Galvani observer que les contrats de muscle de grenouille vigoureusement quand le nerf est touché avec un scalpel lors d'une décharge d'étincelles d'une machine distante électrique 7-9. Contraction pourrait également être produite en connectant le nerf au muscle jambe par un conducteur métallique. Les détails du mécanisme de signalisation électrique complexe préconisées par Galvani ont finalement été formulée par Hodgkin, Huxley et Katz dans leur fameuse équation 10, 11, qui est devenu le fondement de l'électrophysiologie. Les observations remarquables de Ringer sur les effets de Ca 2 + extracellulaire sur la contractilité du cœur et les muscles squelettiques de grenouille 12-15 représentent la première étape importante dans la reconnaissance de Ca 2 + comme un régulateur clé de 16 contractilité du muscle, 17. A partir des années 1980 à nos jours un afflux de découvertes dans le domaine de la contractilité du muscle a été réalisé grâce à l'introduction de la contractilité musculaire et fatigabilité protocoles dans les muscles squelettiques murines 18. Jones et Edwards ont été les premiers à suggérer que la fatigue de basse fréquence intermittente (induite par l'exercice de réduction des effectifs) 19 a été associée à des changements dans la machinerie ECC et non l'appareil contractile. Dans la fin des années 1980 et au début des années 1990, Kolkeck et al 20, Kolbeck et Nosek 21, et Reid 22 ont été en utilisant le muscle du diaphragme à partir des modèles de rongeurs pour étudier les effets de la théophylline, cortiosterone, et des radicaux libres sur la contractilité du muscle squelettique, tandis que Brooks et Faulkner ont été les premiers à faire rapport sur les mesures de force répétées et des mesures de puissance en rapide et lente des muscles de souris 22. En outre, Lannegren, Westerblad, Agneau, et Westerblad ont été les premiers à relier directement la contractilité ex vivo avec Ca 2 + intracellulaire réglementation et a commencé à s'interroger sur le rôle de l'acidose dans 23 la fatigue musculaire, 24.
Nos laboratoires ont contribué de manière significative depuis le début des années 2000 vers la compréhension de nouveaux gènes avec modulateur et de la réglementation sur le muscle ECC avec des rôles critiques dans la contractilité des muscles, fatigabilité, et le vieillissement en utilisant une combinaison d'études sur les souris intactes contractilité musculaire, concentration intracellulaire de Ca 2 Surveillance + dans fibres musculaires intactes et sans peau et de génétique moléculaire des manipulations 3-5, 25-29.
Ici, nous avons détaillé le protocole expérimental de mesure de la contractilité du muscle soléaire murins isolés et extenseur commun des orteils (EDL) muscles, qui correspondent à une lente surtout-oxydant (de type I et des fibres musculaires IIa) et surtout un muscle rapide glyocolytic (type IIb et IIx fibres musculaires) ayant des propriétés contractiles. Dans ce protocole, intactes de muscle-tendon complexes ont été isolés et baigné dans un système ADI PowerLab Radnotti chambre alimentée en oxygène pur ou un mélange d'oxygène (95%) et de CO 2 (5%). Forces contractiles ont été générés par des stimulations électriques provenant d'un stimulateur Grass et détectés à l'aide d'un capteur de force qui a été intégré à un système ADI PowerLab/400, permettant la personnalisation des routines macro pour contrôler l'acquisition, la collecte, la numérisation et le stockage des données. Cette configuration permet de mesurer la force musculaire, la force musculaire, ainsi que la relation force fonction de la fréquence, de la fatigue musculaire, la récupération de la fatigue musculaire, la vitesse et l'ensemble des propriétés cinétiques de la contraction musculaire. En outre, les effets des drogues sur la contraction musculaire peut être contrôlé grâce à ces expériences. Avantages de cette méthode réside dans l'élimination des composants neuronaux et vasculaires loin du muscle squelettique, ce qui permet une évaluation directe des propriétés intrinsèques de contracter le muscle. En outre, les anciens tests in vivo contractilité permettre la manipulation du milieu extracellulaire qui entoure les muscles isolés, ce qui permet l'utilisation de manipulations pharmacologiques des différents canaux ioniques et des transporteurs de perméation afin de définir leurs rôles physiologiques de la fonction du muscle squelettique.
Ce système ex vivo nous a permis de découvrir récemment un comportement alternane distincte dans certaines préparations de muscle mutant, qui étaient liées aux altérée Ca 2 + intracellulaire propriétés de manipulation 4. Alternance sont définis comme des épisodes d'éclatement fluctuation de la force contractile durant la phase de déclin du profil fatigant. Lors de ces événements forces contractiles augmenter momentanément au-dessus de son niveau précédent de la force du cours de la stimulation pénible, peut-être parce soit plus de Ca 2 + est relâché ou que la machinerie contractile est devenue plus sensible à Ca 2 + 30. Le traitement de l'acide cyclopiazonique (CPA), un bloqueur réversible de sarcoplasmique de calcium du réticulum endoplasmique-ATPase (SERCA), la caféine, un agoniste de la ryanodine canal (RyR) et répété fatigue stimulations peuvent tous provoquer une alternance mécanique 4, ce qui suggère que l'alternance sont directement liés à modulation du processus de couplage CE. Démonstration de la méthode pour induire et enregistrer alternance mécaniques dans la contractilité in vitro dans la configuration sert d'exemple pour montrer les paramètres expérimentaux diversifiés qui pourraient être obtenus avec ce système ou d'autres similaires, fondées sur des intérêts individuels de recherche.
Cette méthode peut être intéressante pour les chercheurs qui étudient la physiologie musculaire. Configuration similaire peut également être utilisé pour des complexes isolés muscle-tendon/ligament squelettiques provenant d'autresemplacements anatomiques, ainsi que pour les fibres individuelles et des bandes de muscle.
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Protocol
Composition de la solution:
2,5 mM de Ca 2 + Tyrode solution: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2,5 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM et 10 mM de glucose
0 mM Ca 2 + Tyrode solution: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 2 mM, 0,1 mM d'éthylène glycol tétraacétique (EGTA) et 10 mM de glucose
Note: La solution de baignade devrait être saturé avec 100% d'O 2 si vous utilisez la solution ci-dessus, mais avec 95% d'O 2 avec 5% de CO 2 si l'utilisation des tampons à base de bicarbonate pour maintenir le pH constant. 2,5 mM de Ca 2 + est ajouté au tampon de bain de récapituler le niveau de Ca 2 + dans l'espace extracellulaire et 10 mM de glucose est important car les mitochondries sont encore en fonctionnement dans ces muscles pour produire en continu l'ATP en présence de glucose.
1. Mise en place de l'Expérience Ex vivo en utilisant la contractilitéle système ADI PowerLab
- Un dessin schématique d'un système à 4 canaux ex vivo contractilité est illustré à la figure 1. Un ordinateur commande d'un stimulateur pour générer des impulsions rectangulaires, qui sont filtrés par l'unité d'isolement pour atteindre une paire de fil de platine isolé entourant chacune musculo-tendineux complexe. Il est également appelé stimulation de champ. La contraction du muscle répondant à la stimulation a été détectée par un capteur de force, le signal généré à partir de laquelle a été amplifié, filtré et transféré à l'ordinateur par un convertisseur A / D (conditionnement de signaux). Le signal est ensuite numérisé et peut être enregistrée pour des analyses ultérieures.
- Pour préparer un essai contractilité ex vivo, à son tour sur la première zone de stimulation, le convertisseur A / N (dans le cas d'alimentation de laboratoire ADI) ou similaire d'un logiciel (par exemple, LabView), suivie par l'ordinateur.
- Ouvrez Chart4 logiciel (ou une version autre logiciel compatible avec le système) et initiatch 4-canaux tâche, la communication correcte du logiciel et le matériel de départ est indiquée par la configuration du matériel, et le bouton START du logiciel devient opérationnel (en direct), la fonction 4-canaux permet la mesure simultanée d'une paire de muscles de un type sauvage et une souris mutantes, ou 2 EDL et 2 muscle soléaire de la même souris, et il peut être utilisé pour d'autres muscles comme le diaphragme (diaphragme entier, hémi-diaphragme, ou des bandes de muscle diaphragme) et le jambier antérieur; il peut également être utilisé pour la préparation du muscle cardiaque et pour des faisceaux de muscles, en particulier si l'on utilise les muscles de rat. Dans ce cas, la taille des muscles peut limiter la diffusion de l'oxygène afin faisceaux musculaires sont donc un meilleur choix. Cependant, les techniques de dissection d'experts sont nécessaires pour la préparation de faisceaux musculaires.
- Calibrage du capteur de force: il s'agit de garantir la comparabilité des données générées au niveau des canaux différents et à des heures différentes. Démarrez l'enregistrement, sequentially accrocher un 1-g, 2-g et 5 g-poids sur le bois d'échantillon du capteur de force, arrêter l'enregistrement, calculer les changements correspondants dans mV indiqués dans chaque canal de Chart4 logiciel, tracer la ΔmV et le poids de vérifier la linéarité et déterminer le facteur de conversion entre mV et g-force. Nous vous recommandons d'effectuer ces étalonnages soit au début ou à la fin de chaque expérience pour assurer un étalonnage spécifique est obtenue pour chaque expérience spécifique.
- Vérifier la connexion correcte du tube en Téflon, vidanger tout liquide présent dans le tube bain de tissu, lavez les chambres à trois reprises ou plus avec ddH 2 O et de remplir avec 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca 2 + Tyrode solution. Ca 2 + et le glucose sont fournis dans la solution de bain pour aider à maintenir l'intégrité des membranes, optimal Ca 2 + chargement de la SR, et une source d'énergie facilement disponible pour la production d'ATP par le muscle lui-même, étant donné que les mitochondries restent parfaitement fonctionnels dans ces préparations.
- Vérifier la connexion correcte de l'alimentation en oxygène, ouvrez le réservoir d'oxygène, et régler le débit d'oxygène à fournir bouillonnement de diffusion et homogène de la chambre. Les niveaux d'oxygène peut facilement être déterminé en fonction de la force contractile en fonction du temps. Un débitmètre peut aussi être installé, en particulier si les chercheurs sont intéressés à étudier les effets de l'hypoxie ou hyperoxie. Si les muscles deviennent hypoxiques, la force diminue naturellement. Alors que l'hyperoxie peuvent également endommager les muscles, mais ses effets peuvent être plus difficiles à détecter parce que la plupart des expériences sont effectuées dans des conditions artificielles hyperoxiques pour compenser l'absence d'un apport sanguin normal vers les muscles. Dans la plupart des systèmes, il est possible de les différentes chambres à bulles avec la même quantité d'oxygène simplement en contrôlant le débit d'oxygène constant à chaque chambre.
- Pour régler la sensibilité de tous les canaux afin d'assurer la résolution force maximale sans saturer le canal. Sensibilité de la voie peut varier considérablement en fonction d'unâge d de l'animal, la température expérimentale, les manipulations génétiques, la taille musculaire, de la souche de souris, et la capacité de l'expérimentateur de bien disséquer les muscles libres de dommages et intérêts. Dans notre expérience, lorsque l'on mesure la force contractile soléaire, la sensibilité varie de 0,5 à 10 mV / cm, tandis que dans le cas de l'EDL, la sensibilité peut varier de 1 à 20 mV / cm.
- Un protocole pour la stimulation fatigue doit être établi. Dans le logiciel Chart4 une macro peut être utilisée. Pour programmer une nouvelle macro: dans le logiciel Chart4, cliquez sur démarrer la mesure, puis cliquez sur Macro, Macro commande, lancez l'enregistrement, commencez à répéter, choisissez la fréquence du stimulus désiré, puis de fin de reprise. Pour un protocole d'équilibration, stimulus est répété toutes les minutes pendant 30 min et pour fatiguer protocole, stimulus est répété toutes les 2 secondes pendant 5 min. Ces changements dans la périodicité de la stimulation, une incidence directe sur le cycle de travail, qui est également fonction de la durée de stimulation. Ces paramètres peuvent être modifiés pour tester différents aspects de la contractilité et la fatigabilité.
2. Préparation faisceaux musculaires intactes
- Dissection EDL: souris est sacrifiée en suivant les directives du NIH et du IACUC protocoles d'animaux institutionnels. Souris est sacrifiée par dislocation cervicale. Souris est alors disposé à la position latérale. EDL est un muscle rapide glycolytique avec rose pâle couleur blanc. Il est à environ 10-13 mm de long et pèse 11.8 mg de type sauvage souris C57BL / 6. L'EDL a les fonctions de l'extension orteils 2-5, et dorso-flexion du pied à la cheville. Il est innervé par le nerf sciatique poplité externe. À disséquer l'EDL, faire une incision dans la peau superficielle et couper ouvrir le fascia entre le jambier antérieur et postérieur du groupe de muscles, et localiser l'origine (proximale) où ligament est reliée à l'condyle latéral du tibia et supérieure 3/4 de la partie antérieure surface du péroné (marge interosseux). Couper avec des ciseaux le ligament ophtalmiques délicats comme distalement que possible du muscle, ce qui procedure libère l'origine proximale du muscle EDL. Tenez le ligament avec un forceps émoussé et tirez doucement pour libérer de l'EDL. Il pourrait être nécessaire de couper une partie de la périmysium qui entoure les muscles EDL et d'autres autour de l'EDL, une étape qui est cruciale, car des dommages peuvent survenir à l'EDL au cours de cette étape délicate. Ensuite, passer à la zone d'insertion où les quatre tendons distaux insérer dans les phalanges moyenne et distale de 2-5 chiffres. Couper les tendons dans la mesure du possible par les muscles.
- Transfert du muscle EDL isolé dans un plat à dissection contenant une solution de Tyrode isotonique. Certains des modèles animaux mutants, transgéniques et knock-out ont des muscles très fragiles et l'utilisation de Ca 2 +-solution de Tyrode libre est nécessaire pour empêcher Ca 2 + dommages musculaires induits avant mesures de contractilité. Ensuite, utiliser un fil chirurgical pour attacher solidement aux deux extrémités de l'EDL comme distale du muscle que possible. Une bonne mesure est de lier légèrement au-dessus de la mi-point de la longueur du ligament ou du tendon. Utiliser 6-0 suture taille de cette procédure, et transférer le muscle EDL de la 2-O saturée de bain de tissu, le muscle monter sur la rainure d'échantillonnage du capteur de force et le crochet de papeterie sur le fond de la chambre de bain, répéter l' Procédé pour l'autre branche. Nous avons aussi commencé à utiliser une nouvelle méthode qui tient les muscles avec des pinces au lieu de sutures. Si l'objectif principal est d'étudier les propriétés cinétiques et / ou pour obtenir la puissance musculaire, il est recommandé que la suture être aussi courte que possible, ou la suture être remplacée par une tige métallique.
- Dissection soléaire: le soléaire est une variété principalement lent oxydatif musculaire par la couleur rouge riche. Il est d'environ 1 mm de moins que l'EDL, mais pèse un peu plus de l'EDL. Il est innervé par le nerf tibial et il exécute l'action de flexion plantaire du pied. Afin de disséquer le muscle soléaire, accédez à la face postérieure de la jambe latérale, écarter le muscle gastrocnémien qui couvre normalement la soleus, et d'identifier le muscle par la couleur rouge foncé. À l'origine (proximale), couper les ligaments de liaison à la moitié proximale du tibia postérieur le long de la ligne proximale et soléaire 1/3 de la fibula postérieur, ensuite, à l'insertion (distale), couper le tendon calcanéen qui s'insère dans la partie postérieure calcanéum. Soin de libérer le soléaire et monter correctement le muscle soléaire dans la chambre de bain que pour l'EDL.
3. Mesure de la contractilité des muscles squelettiques isolés
- Une fois que les muscles sont montés dans chaque chambre de bain tissu, commencez l'enregistrement. La plupart des systèmes similaires permettre à zéro de la ligne de base de l'enregistrement vigueur. Cette fonction est généralement associée à l'amplificateur, dans le cas spécifique du système PowerLab, en fonction de l'amplificateur en pont. Il facilite l'observation des changements de base et offre un moyen pratique pour tous les contractions musculaires à analyser à partir de zéro. Muscles isolés sont ensuite stimulées avec carré impulsions d'ondequi peut varier largement en fonction de la taille de la chambre, le platine épaisseur des fils, la distance entre les fils, et la même composition de la solution expérimentale. Nous avons employé courant de 60 mA (nous avons noté que les courants supérieurs à 350 mA semblent être préjudiciable à des préparations de muscle) et les trains de stimulation de 350, 500 et 1000 ms, en fonction des objectifs d'un protocole spécifique. Les impulsions d'ondes carrées individuelles doivent avoir une durée allant de 0,3 à 1 ms.
- L'étape suivante consiste à sélectionner une fréquence de stimulation capable de produire une stimulation tétanique fusionnée (ex: ~ 100 Hz pour permettre la production de force maximale dans les muscles EDL et de ~ 60 Hz dans le muscle soléaire), tandis que lentement et avec précaution l'étirement des muscles pour identifier le longueur optimale de ces muscles. Comme les muscles sont soigneusement tendue, attendre 30 s et stimuler à 100 Hz, attendez 30 secondes et étirer à nouveau, puis répétez la stimulation, jusqu'à ce que le point où la force n'augmente plus.
- Ces muscles ont undergone des changements importants dans l'environnement. Il est recommandé que les muscles pouvoir s'adapter à ce nouvel environnement, une étape dans nos protocoles appelé «équilibration». Equilibrer ces muscles à la même fréquence de stimulation utilisés lors de la phase d'étirage, 100 Hz pendant 20-30 min, jusqu'à ce qu'au moins 5 consécutives contractions tétaniques sont complètement stable (pas de réduire, ne pas augmenter, ligne de base stable). Périodicité des trains de stimulation (100 Hz, 500 ms, 1 ms d'impulsion individuelle) durant l'équilibrage est 1 min, ce qui correspond à un rapport cyclique de 1,66%, une stimulation sans fatigue. Dans ce contexte, un cycle de service de 1,66% signifie que sur un total de 100%, les muscles travaillent 1,66% du temps, en augmentant les muscles du cycle de travail peut éventuellement être amené à la fatigue. Si autrement muscles de la santé, de la souris de type sauvage montrent un profil de fatigue au cours de cette période d'équilibrage, il est possible qu'ils aient été endommagés lors de la dissection, l'hypoxie se produit dans les muscles chambres / ou éléments excessivectrolysis à travers les électrodes de stimulation génère des radicaux libres. Westerblad a déjà suggéré que des courants supérieurs à 400 mA induire la formation de radicaux libres 23. De toute évidence, la platine la plus haute qualité est proposé, car d'autres métaux va certainement conduire à la formation de radicaux libres et toxicité musculaire.
- Obtenir la relation force fonction de la fréquence (FF) en stimulant les muscles avec les fréquences de stimulation 1-140 Hz suivants: (par incréments de 5-10 Hz), avec une périodicité de 30-60 s lors de la réalisation des expériences à 25 ° C. Lorsque la réalisation d'expériences à 37 ° C, de prolonger la FF pour des fréquences plus élevées allant jusqu'à 300 Hz pour le muscle du diaphragme, 180-200 Hz pour soléaire et EDL 220-250 Hz pour. Ensuite, identifier la fréquence de stimulation qui génère la force tétanique maximale (T max) et environ un demi-maximum la force tétanique (1/2 T max), parfois il est difficile d'obtenir l'exacte ½ T max pour les EDL et la soleNous muscles si une seule source stimulateur est utilisé, en raison des différences intrinsèques entre ces muscles. Une solution viable consiste à identifier une fréquence qui produit 30-70% de la T max. La justification de ces fréquences de stimulation est que T max fournit des informations importantes sur les événements de machines contractiles / modulation, tandis que le ½ T max fournit des informations plus pertinentes pour le Ca 2 + et de la réglementation du processus des CEC. Pour être certain que la force maximale a été atteinte, 10-20 mM de caféine peut être ajouté à la solution du bain, tout en stimulant les muscles. Si la force maximale a été atteinte, la force n'augmentera pas la présence de caféine. Le FF est décalée vers la droite et les forces ont tendance à être légèrement plus élevée à de plus hautes températures expérimentales. Grâce à ce système, toutes les autres fréquences de stimulation peut être effectuée si cela est souhaitable. Le profil distinct contractile d'un muscle rapide glycolytique EDL et un muscle lent oxydatif soléaire estreprésenté sur la figure 2.
- Après équilibrage, la fatigue les muscles à ½ T max pendant 5 min, avec un intervalle de stimulation de 2 s et le rapport cyclique de 25% (figure 3). Ce protocole fatigant spécifique est censé mieux refléter la contribution de l'sarcoplasmique Ca réticulum 2 Communiqué de + de 31 contractilité du muscle.
- Récupérer le muscle à ½ T max pendant 30 min ou jusqu'à ce que la force est stable, à 1 min d'intervalle. Un protocole fatigue supplémentaire peut être effectuée en utilisant maintenant T max de stimulation, qui est censé refléter l'état de la machinerie contractile 31. Une autre option est d'étendre le protocole fatigant pour intercaler des trains de stimulation qui génèrent T max et T max ½ lors de la fatigue et de récupérer les muscles avec le même type de stimulation.
- Répétez la FF comme décrit à l'étape 3.4, la raison étant que les différences phénotypiques entre les diffsouches érents modèles, les maladies ou les traitements médicamenteux peuvent être observés par l'analyse de la FF avant et après fatigue. Nous avons par exemple déjà signalé que, après la fatigue de la FF de jeunes muscles de type sauvage est décalée vers la gauche, tandis que dans les muscles des muscles âgés, elle est décalée vers la droite, ce qui suggère des effets modulateurs différentiels de fatigue du muscle squelettique en fonction du vieillissement.
- Afin de sonder la contribution du Ca 2 + extracellulaire entrée dans la contractilité du muscle, solution du bain peut être transformée en une solution ne contenant pas de Ca 2 + 0,1 mM EGTA, mais (0 mM de Ca 2 + Tyrode solution) 32. En variante, les inhibiteurs différents de magasin actionnés canal peut être appliquée à la solution du bain. Quelques exemples sont les suivants: 2-aminoéthyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, le 3,5-bis (trifluorométhyl)-pyrazole 2 (BTP-2) et azumolene, etc 33, 34. Caféine peut être utilisé pour sonder la fonction du récepteur de la ryanodine, et KCl peuvent être utilisés pour évaluer l'ensemblepropriétés de dépolarisation de ces préparations. D'autres médicaments peuvent également être utilisés pour étudier la modulation importante de la force au cours de la fatigue par la Na +, K +, et la Na +-K + pompes 35. La plupart de ces médicaments ont des tailles relativement petites et semblent rapidement se diffuser dans ces préparations de muscle, comme en témoignent par leurs effets immédiats. L'absence d'un effet par les médicaments administrés ne signifie pas nécessairement que le médicament est inefficace et essais supplémentaires en utilisant dose beaucoup plus élevée que celle utilisée dans des expériences simples de fibres musculaires sont parfois nécessaires.
- Une application unique de ce système ex vivo conduit à la découverte récente d'alternance mécanique en tric-a - / - 4, 30 muscles. Alternance sont définis comme des épisodes d'éclatement fluctuation de la force contractile durant la phase de déclin du profil fatigant. Lors de ces événements de la force contractile peut augmenter momentanément au-dessus de son niveau précédent de la force lorsfatiguer parce que la stimulation soit plus de Ca 2 + est relâché ou que la machinerie contractile est devenue plus sensible au Ca 2 +. Le déclenchement de la force contractile doit être de 50% supérieure à sa force de précédent et les foyers devraient être vus au moins 10 fois au cours du processus 5 min de stimulation de la fatigue. Alternance mécanique ne sont pas communs dans le muscle squelettique chez les souris de type sauvage, mais peut être vu dans certains muscles mutantes avec perturbation de la concentration intracellulaire de Ca 2 + processus de signalisation telles que le type trimère de cations intracellulaire du canal A (tric-a) - / - musculaire 4. Alternance mécanique peut être induite par des stimulations fatigantes, le traitement avec de l'acide caféine et cyclopiazonique (CPA), voir la figure 3 pour un enregistrement représentatif de ces alternances mécaniques. La nature de ce phénomène est assez intrigante, alors qu'un muscle qui est fatigant semble en mesure de produire momentanément plus de force. Dans notre précédente publication, Association avec un capteur unique Ca 2 + analyse révèle que l'apparence d'alternance est un résultat de Ca 2 + SR surcharge et instable. Nous croyons qu'une meilleure compréhension de l'alternance pourrait conduire à une meilleure compréhension du processus des CEC.
- A la fin de l'expérience, mesurer la longueur et le poids des muscles individuels en utilisant calibré étrier et balance analytique, surgelés du muscle dans l'azote liquide et économisez à -80 ° C, puisque les analyses biochimiques peuvent être effectuées dans ces muscles. Ces muscles peuvent également être mécaniquement peau de palpage détaillée du processus ECC, ou être chimiquement peau pour la détermination des propriétés essentielles contractiles en l'absence de mécanismes de régulation ECC.
- La force musculaire enregistrée (mV) est tout d'abord converti en gramme de force sur la base de résultats d'étalonnage et ensuite normalisée par rapport à la physiologique surface de section transversale (PCSA) en utilisant la formule suivante: force musculaire (N / cm 2) = (force (g) x muscle length (cm) x 1,06) / (poids du muscle (g) x 0,00981) 5,36. Alternativement, la force musculaire peut être normalisée par rapport à la protéine totale ou le contenu total de l'actine du muscle individu en utilisant un dosage des protéines de Bradford / quantification Commossie coloration au bleu. Dans certaines conditions, alors que la masse musculaire pourrait être durement touchée en raison de maladies, la sénescence, les traitements médicamenteux, la normalisation de force basée sur la masse musculaire, les protéines et / ou le contenu d'actine peuvent fournir une lecture plus stable.
4. Les résultats représentatifs
Typiques forces température ambiante contractiles des EDL et soléaire répondant à des stimuli faibles, moyenne et haute fréquences sont présentés dans la figure 2. La contraction induite par 5 EDL stimulus Hz demeure secousses individuelles grâce à l'action rapide de la SERCA Ca 2 + ATPase et le Ca 2 + intrinsèque des propriétés de sensibilité des machines contractile, alors que la contraction par soléaire 5 Hz commence à fondre (lent ATPase und une plus grande sensibilité au Ca 2 + de l'appareil contractile), mais les forces maximales sont encore séparés. À 20 Hz stimulation, les contractions EDL sont partiellement fusionnés tandis que celle du soléaire constitue une force complètement fondu tétanique. A la fréquence de stimulation qui produit T max de stimulation, qui peut varier à la température ambiante de 80 à 110 Hz pour les EDL et 60-90 Hz pour soléaire, course ascendante rapide et relaxation rapide de la force tétanique dans EDL sont notés, ce qui est contraire à les caractéristiques lentes du muscle soléaire. Figure 2b montre que la courbe force-fréquence du muscle EDL est décalé vers la droite par rapport au muscle soléaire, ce qui indique que le soleus sont plus sensibles à la libération de Ca 2 + à une fréquence donnée de stimulation due à la présence de la myosine et les isoformes de troponine lente. En outre, le mécanisme contractile répond avec plus de force relative dans le muscle soléaire dans les basses fréquences. Figure 3 montrentprofil normal sa fatigue du muscle EDL (panneau supérieur) et soléaire (panneau du milieu). Notez la baisse plus rapide de la force contractile sous stimulation fatigue dans les muscles EDL et la plus forte décroissance en vigueur à la fin du protocole de 5 minutes la fatigue. Enfin, un profil alternane mécanique typique d'un muscle mutant a été montré dans la figure 3 (panneau inférieur), qui a été définie en tant que foyers de force momentanés pendant la phase de déclin de profil de la fatigue musculaire. Le déclenchement de la force contractile doit être de 50% supérieure à sa force de précédent et les foyers devraient être vus au moins 10 fois au cours du processus 5 min de stimulation de la fatigue.
Figure 1. Schéma de principe d'un système 4-channel ex vivo de la contractilité. Square-ondes impulsions sont générées par un ordinateur commandant un stimulateur Grass. Deux unités d'isolement de stimulation filtrer le stimulus provenant de l'élecunité de stimulateur trique pour éliminer les fluctuations du signal électrique et d'établir un signal d'onde carrée stable. Ce signal électrique filtré est envoyé aux chambres de baignade 4 contenant les fils-électrodes de platine autour de chaque muscle isolé. En fin de compte, c'est le courant à travers les deux électrodes de stimulation (appelé champ) qui génèrent un potentiel d'action, induire la contraction du muscle. Cette contraction est détecté par un des capteurs de force spécifiques, transmis aux amplificateurs de pont, filtré, en moyenne (transmetteur) et enregistré par un logiciel informatique par le biais d'un convertisseur A / D.
Figure 2. . Représentant forces contractiles du muscle soléaire et EDL (A) des forces contractiles induites par 5 Hz (panneau supérieur), 20 Hz (panneau central) et la force tétanique maximale (T max) (panneau inférieur); entrée montre une trace de la force contractile d'un endommagé musculaire, (B) unensemble représentatif montrant les contractions individuelles d'une force en fonction du rapport de fréquence dans EDL (FF, panneau supérieur) et la courbe tracée résultant de la FF (panneau inférieur). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Représentant fatigue profil et alternance mécaniques. Un profil typique déclin rapide de la fatigue musculaire EDL (panneau supérieur) et le lent déclin fatiguer le profil du muscle soléaire (panneau du milieu). Fatigue stimulation conduit à l'apparition d'alternance mécaniques dans un tric-a - / - muscle avec perturbés Ca 2 + (propriétés de manipulation panneau inférieur).
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Discussion
Mesure de la force contractile et la fatigabilité est important pour l'évaluation globale de la fonction du muscle squelettique. Le but principal de cet essai est d'identifier les changements dans la force musculaire et la fatigue engendrée par les propriétés sous certaines conditions pathologiques, comme la sarcopénie et la fatigue musculaire, et de tester l'effet de la drogue / réactifs sur la contractilité musculaire. Puisque la force musculaire est étroitement liée avec intracellulaire Ca 2 +, Ca 2 + extracellulaire entrée et la diaphonie entre les deux, nous pouvons également recueillir des informations sur le Ca 2 + signalisation d'état dans le muscle squelettique en utilisant cette méthode. Ici, nous avons montré un phénotype unique appelée «alternance mécanique" lorsque les épisodes en rafale fluctuation de la force contractile durant la phase de déclin du profil de fatigue ont été observées sous un SR surchargé et instable. On pourrait s'attendre à ce qu'une variété de phénotypes musculaires squelettiques, y compris la force altérée, FF, la fatigabilité, la cinétique de contraction et de reprise abilité après la fatigue peut être détectée à l'aide de l'essai de la contractilité in vitro dans différentes conditions pathologiques.
L'étape la plus critique pour cet essai est d'isoler les muscles entiers intacts (ou faisceaux musculaires et des bandes musculaires) qui sont exempts de dommages. Un tel objectif est plus facile à atteindre dans les préparations de muscles entiers. Nous démontrons ici que laissant suffisamment de ligaments et les tendons pour attacher les muscles entiers est très important de prévenir attacher le muscle lui-même, ce qui conduit à des lésions musculaires et la mort du muscle par la suite. De plus, les solutions de barbotage constant avec soit 100% de O 2 dans le cas de solutions à base d'HEPES ou un mélange de O 2 et CO 2 pour des solutions de bicarbonate est critique. Hypoxie et hyperoxie la prévention est important alors qu'un débitmètre peut être utilisé. Nous avons aussi utilisé dans certaines situations un dispositif spécifique qui mesure l'oxygène dissous dans les liquides baignant le tissu. Dans certaines conditions où les muscles sont more sujettes à des dommages, la manipulation du muscle isolé dans un Ca 2 + sans solution avant le montage sur le capteur de force aidera à détendre les muscles et réduire au minimum les dommages musculaires avant l'expérience. Des médicaments tels que le 2,3 - butanedione monoxime (BDM) ou la N-benzyl-p-toluène sulfonamide (BTS) peuvent également être ajoutés lors de la dissection pour minimiser les dommages, en particulier si les faisceaux musculaires ou des bandes musculaires sont préparés, ce qui est courant pour l'étude de la contractilité de la membrane 37, 38. Pendant l'enregistrement, les préparatifs endommagés normalement générer moins de force et ont augmenté bruit de fond et les fluctuations (voir entrée de la figure 2), et les résultats de ces muscles peut être exclu de l'ensemble de données d'analyse, sauf si elle fait partie de l'expérience pour analyser les réponses du endommagée les muscles. Un autre point qui peut être facilement ignoré ou oublié, c'est que la stimulation électrique lui-même peut être une source de toxicité pour les muscles. Nous vous recommandons de nettoyer périodiquement les électrodes et la chamber avec une solution d'hypochlorite de 1% pour éliminer les contaminants, de résidus de protéines, l'accumulation de l'oxydation, etc précautions spéciales doivent également lors du réglage de la longueur du muscle monté. Il est important de s'étirer dans de petits pas pour éviter de trop solliciter que l'alignement optimal de filaments fins et épais est essentielle pour un fonctionnement efficace de pont fonctionnement 39. En outre, il est recommandé que la position relative des faisceaux musculaires montés aux électrodes de stimulation sur le terrain est maintenue constante et aligné parmi tous les canaux afin de s'assurer que la même quantité de courant électrique est appliqué aux muscles isolés. Dans nos conditions expérimentales, les muscles de jeunes souris de type sauvage rester stable pendant plus de 12 heures et même plus si les antibiotiques, 0,2% de FBS, et les acides aminés sont ajoutés à la solution du bain.
Avec des soins et un contrôle approprié, ce système ex vivo pourrait fournir des informations sur la corrélation entre le Ca 2 + signalant unecontraction musculaire d sans la complexité du système vasculaire, endocrinien et le système nerveux. Par exemple, la perte de la dépendance à Ca 2 + extracellulaire est une signature du muscle squelettique personnes âgées tout en Ca 2 + communiqué de la dysfonction donne habituellement faible force contractile et rapide profil fatigant. Comme exampled ici, l'apparence d'alternance mécanique indique SR instable, que nous croyons n'est pas limité à tric-a - / - muscles, mais aussi dans d'autres muscles squelettiques dans des conditions pathologiques génératrices de Ca 2 + de surcharge et d'instabilité. Cette configuration permet un accès direct sur le muscle pour diverses manipulations physiologiques et pharmacologiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'AHA SDG 10SDG2630086 Zhao X, RO1-AR061385 à Ma J et GO Grant RC2AR05896 à M. Brotto
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-APB | Tocris | 1224 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc. |
| SKF96365 | Sigma | SKF-96365 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc. |
| BTP-2 | Millipore | 203890-5MG | Relatively specific SOC blocker |
| CPA | Sigma | C1530 | Reversible SERCA blocker |
| caffeine | Sigma | C0750 | Fast action RyR agonist |
| Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System | Radnoti | 159920 | |
| Combination Tissue Support/Stimulating Electrode | Radnoti | 160151 | Vertical Zig Zag Type with tissue support |
| Quad Bridge Amp | ADInstruments | FE224 | |
| PowerLab/400 | ADInstruments | This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system. | |
| Force Transducers (5 mg - 25 g) | ADInstruments | MLT0201/RAD | |
| Chart v4.02 | ADInstruments | LabChart 7.3 is the latest version of Chart software. | |
| S8800 Dual Pulse Digital Stimulator | GRASS TECHNOLOGIES | This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator. | |
| RF Transformer Isolation Unit | GRASS TECHNOLOGIES | Model SIU5 |
References
- Winegrad, S. Role of intracellular calcium movements in excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Fed. 24, 1146-1152 (1965).
- Sandow, A. Excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Pharmacol. Rev. 17, 265-320 (1965).
- Thornton, A. M. Store-operated Ca(2+) entry (SOCE) contributes to normal skeletal muscle contractility in young but not in aged skeletal muscle. Aging. 3, 621-634 (2011).
- Zhao, X. Ca2+ overload and sarcoplasmic reticulum instability in tric-a null skeletal muscle. J. Biol. Chem. 285, 37370-37376 (2010).
- Brotto, M. A. Defective maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis is linked to increased muscle fatigability in the MG29 null mice. Cell Res. 14, 373-378 (2004).
- Florkin, M. Machina carnis. The Biochemistry of Muscular Contraction in its Historical Development. Med. Hist. 17, 316-317 (1973).
- Galvani, A., Aldini, J. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. ApudSocietatem Typographicam. , (1792).
- Fulton, J. F., Wilson, L. G. Selected Reading in the History of Physiology. , Charles C.Thomas. (1930).
- Piccolino, M. Luigi Galvani and animal electricity: two centuries after the foundation of electrophysiology. Trends Neurosci. 20, 443-448 (1997).
- Hodgkin, A. L. The Croonian Lecture: Ionic Movements and Electrical Activity in Giant Nerve Fibres. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 148, 1-37 (1958).
- Hodgkin, A. L. The Sherrington Lectures VII the Conduction of the Nervous Impulse. , Liverpool University Press. 71964 (1965).
- Ringer, S. A further contribution regarding the influence of the different constituents of the blood on the contraction of the heart. J. Physiol. 4, 29-42.3 Forthcoming.
- Ringer, S. Further experiments regarding the influence of small quantities of lime, and other salts on muscular tissue. J. Physiol. 7, 291-308 Forthcoming.
- Ringer, S., Buxton, D. W. Concerning the action of calcium, potassium and sodium salts upon the eel's heart and upon the skeletal muscles of the frog. J. Physiol. 8, 15-19 Forthcoming.
- Ringer, S. Regarding the action of lime, potassium and sodium salts on skeletal muscle. J. Physiol. 8, 20-24 (1887).
- Campbell, A. K. Intracellular Calcium its Universal Role as Regulator. , John Wiley and Sons. (1983).
- Mol, J. Cell Cardiol. 16, ll3-ll6 (1984).
- Ridings, J. W., Barry, S. R., Faulkner, J. A. Aminophylline enhances contractility of frog skeletal muscle: an effect dependent on extracellular calcium. J. Appl. Physiol. 67, 671-676 (1989).
- Fitts, R. H. The cross-bridge cycle and skeletal muscle fatigue. J. Appl. Physiol. 104, 551-558 (2008).
- Kolbeck, R. C., Speir, W. A. Diaphragm contactility as related to cellular calcium metabolism: Influence of theophylline and fatigue. American Review of Respiratory Disease. 139, 495 (1989).
- Kolbeck, R. C., Nosek, T. M. Fatigue of rapid and slow onset in isolated perfused rat and mouse diaphragms. J. Appl. Physiol. 77, 1991-1998 (1994).
- Moore, B. J. Diaphragm atrophy and weakness in cortisone-treated rats. J. Appl. Physiol. 67, 2420-2426 (1989).
- Lannergren, J., Westerblad, H. Force decline due to fatigue and intracellular acidification in isolated fibres from mouse skeletal muscle. J. Physiol. 434, 307-322 (1991).
- Westerblad, H. Spatial gradients of intracellular calcium in skeletal muscle during fatigue. Pflugers Arch. 415, 734-740 (1990).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ. Res. 107, 76-83 (2010).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat. Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Shen, J. Deficiency of MIP/MTMR14 phosphatase induces a muscle disorder by disrupting Ca(2+) homeostasis. Nat. Cell Biol. 11, 769-776 (2009).
- Romero-Suarez, S. Muscle-specific inositide phosphatase (MIP/MTMR14) is reduced with age and its loss accelerates skeletal muscle aging process by altering calcium homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 504-513 (2010).
- Yazawa, M. TRIC channels are essential for Ca2+ handling in intracellular stores. Nature. 448, 78-82 (2007).
- Brotto, M. A., Nosek, T. M., Kolbeck, R. C. Influence of ageing on the fatigability of isolated mouse skeletal muscles from mature and aged mice. Exp. Physiol. 87, 77-82 (2002).
- Zhao, X. Compromised store-operated Ca2+ entry in aged skeletal muscle. Aging Cell. 7, 561-568 (2008).
- Pan, Z. Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29. Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).
- Zhao, X. Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).
- Renaud, J. M. Modulation of force development by Na+, K+, Na+ K+ pump and KATP channel during muscular activity. Can. J. Appl. Physiol. 27, 296-315 (2002).
- Brotto, M. A. Functional and biochemical modifications in skeletal muscles from malarial mice. Exp. Physiol. 90, 417-425 (2005).
- Brotto, M. A. Hypoxia and fatigue-induced modification of function and proteins in intact and skinned murine diaphragm muscle. Pflugers Arch. 440, 727-734 (2000).
- Smith, M. A., Reid, M. B. Redox modulation of contractile function in respiratory and limb skeletal muscle. Respir Physiol Neurobiol. 151, 229-241 (2006).
- Bagni, M. A., Cecchi, G., Colomo, F. Myofilament spacing and force generation in intact frog muscle fibres. J. Physiol. 430, 61-75 (1990).
