Summary
إنشاء ورم المثانة orthotopic نموذج لتقييم آثار antitumor من سارنا تسليم intravesically ونمو الورم الرصد بواسطة الموجات فوق الصوتية والتصوير bioluminescent.
Abstract
نحن نقدم طريقة جديدة لعلاج سرطان المثانة مع تسليم intravesically RNA تفعيل صغيرة (سارنا) في الفأر طعم أجنبي orthotopic نموذج ورم المثانة. يتم تأسيس نموذج الفأر بواسطة قسطرة الإحليل تحت التخدير العام بالاستنشاق. ومن ثم قدم حرق كيميائي على الغشاء المخاطي المثانة داخل المثانة باستخدام محلول نترات الفضة لعرقلة طبقة جلايكان المثانة وتمكن خلايا لنعلق. بعد عدة يغسل بماء معقم، الإنسان سرطان المثانة KU-7-luc2-GFP الخلايا تغرس من خلال قسطرة في المثانة ليسكن لمدة 2 ساعة. ويؤكد نمو لاحق من أورام المثانة ورصدها بواسطة الموجات فوق الصوتية في الجسم الحي المثانة والتصوير bioluminescent. ثم يتم التعامل مع الأورام intravesically مع سارنا صيغت في جزيئات الدهون (LNPs). ويتم رصد نمو الورم مع الموجات فوق الصوتية والتألق الحيوي. وأظهرت جميع خطوات من هذا الإجراء في شريط الفيديو المرافق له.
Protocol
وقد تمت الموافقة على الاجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.
1. خلية التحضير
- ويزرع في سرطان المثانة خط الخلية البشرية KU-7-luc2-GFP (الفرجار العلوم الحياتية، Hopkinton، MA) في وسائل الاعلام-1640 RPMI تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ و 50 جنتاميسين ميكروغرام / مل.
- تتم المحافظة على الثقافات على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 مع وسائل الاعلام يتغير كل يومين أو ثلاثة.
- كانت تحصد الخلايا عن طريق الهضم التربسين وعدها باستخدام عدادة الكريات. وأعدت وتعليق خلية واحدة من 2 الخلايا X 6 10 في 50 ميكرولتر في الفوسفات مخزنة المالحة ويحرص على الجليد.
2. Orthotopic نموذج المثانة ورم
- واستخدمت النساء العاريات (نيو / نو) الفئران 8-10 أسابيع من العمر (سيمونسن مختبر، Gilory، كاليفورنيا).
- وضع الستارة معقم فوق وسادة التدفئة لخدمةSA منصة العمليات الجراحية. وتعد عقيمة هلام التشحيم، 24 guage القسطرة مع الإبر مرود، محلول نترات الفضة، والمياه المعقمة.
- هو فعل مخدر عام في الفئران مع isoflurane المستنشقة (3٪ لتحريض، 1-2٪ للصيانة) والحفاظ عليها من خلال الرؤوس. ويطبق مرهم معقم للعين للعيون الحيوان، ويتم استخدام الحرارة منصة للحفاظ على حرارة الجسم.
- ضع الماوس في موقف ضعيف.
- فهم بلطف الفرج الحيوان مع ملقط لتحقيق الاستقرار.
- باستخدام قسطرة 24 guage الوريد مع مرود إزالة الإبرة، ومقسطر مجرى البول الماوس. وينبغي استخدام تزييت وافرة. مع مستلق الماوس، ويقع على مجرى البول الخلفي على الفور إلى طيات الفرج والأمامي إلى المهبل. يؤخذ في البداية وبزاوية 45 درجة من أجل يقني؛ يدخل القنية مجرى البول ويمر تحت عظم العانة. ثم يتم أخذ زاوية أكثر الضحلة لتمرير من خلال مجرى البول في المثانة. الحوض بريه لطيفتأكد من تصويب مجرى البول يمكن أن يساعد في كثير من الأحيان. يجب توخي الحذر لتجنب دفع من الصعب جدا ضد المقاومة، وهذا يمكن ان يؤدي الى ثقب مجرى البول أو المثانة. البول ينظر داخل القسطرة يؤكد موقعه داخل تجويف المثانة.
- نضح البول من تجويف القسطرة والمثانة باستخدام إبرة مرود. يتم استخدام إبرة مرود لجميع تطلعات وحقن لاحقة، وترك القسطرة في مكانها. وهذا يسمح للحقن كميات دقيقة من خلال القضاء على الفضاء الميت داخل القسطرة، ويجعل القسطرة تكرار لا لزوم لها.
- لتنال من طبقة جلايكان من الظهارة البولية المثانة، ويتم حقن 10 ميكرولتر من نترات الفضة 0.5 م وسمح ليسكن لمدة 10 ثانية. وهذا قد يشكل راسب أبيض مع البول المتبقية.
- نضح وتجاهل محتويات راسب والمثانة باستخدام إبرة مرود.
- غسل المثانة عن طريق حقن الماء المعقم 100 ميكروليتر. نضح والتخلص من المياه. Repeفي الغسيل مع الماء المعقم 3 مرات ليصبح المجموع 4 يغسل.
- يضع ربطة عنق من الحرير 4-0 حول الصماخ مجرى البول إلى انسداد مجرى البول تمهيدا لإزالة القسطرة.
- حقن معدة مسبقا 2 × 10 6 KU-7-luc2-GFP الخلايا في 50 ميكرولتر باستخدام إبرة مرود.
- إزالة القسطرة في وقت واحد وإبرة مرود، وترك مجرى البول المغطي من الحرير التعادل.
- وسيتم الحفاظ الماوس تحت تخدير عام لمدة 2 ساعة قبل أن يتم إزالة ربطة عنق من الحرير وايقظ الحيوان.
3. الموجات فوق الصوتية
- هو فعل تخدير عام مع isoflurane المتبخرة وحافظت عبر مخروط الأنف.
- وVEVO VisualSonics 770 في الجسم الحي عالية الدقة المتناهية الصغر نظام تصوير (VisualSonics المؤتمر الوطني العراقي، تورونتو، أونتاريو، كندا) مع التحقيق RMV-704 ميغاهيرتز 40 تم استخدامه.
- ضع الماوس في موقف ضعيف على منصة الموجات فوق الصوتية.
- تأمين أرجل الحيوان هندمع شريط لتجنب الحركة الزائدة خلال التلاعب في مسبار الموجات فوق الصوتية.
- تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية لمنطقة الحوض الماوس.
- أدنى RMV-704 مسبار الموجات فوق الصوتية (40 ميغاهيرتز) على الحوض الماوس للحصول على صور عرضية أو طولية.
- إذا تم العثور على الورم، ويمكن حفظ الصور لقياس أبعاد الورم.
4. Bioluminescent التصوير
- أداء حقن داخل الصفاق من 200 ميكروليتر (150 ملغ / كلغ) luciferin الركيزة.
- حث تخدير عام مع المتبخرة isoflurane والحفاظ على طريق مخروط الأنف.
- وضع الفئران في موقف ضعيف في تصوير التألق الحيوي.
- بعد خمس دقائق من حقن luciferin، قياس التألق الحيوي من هذا الحيوان في الفوتونات في الثانية الواحدة.
5. سارنا التحضير
- توليف الجيش الملكي النيبالي [أليغنوكليوتيد] على مقياس من 50-100 μmol.
- يصلب تكميلية واحدة [أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل أناn لsaRNAs المزدوجة.
- مستعدون للدهون، جسيمات متناهية الصغر (الشرطة الوطنية الليبيرية)-سارنا مع دهن ionizable 1،2-dilinoleyl-4-(2 - dimethylaminoethyl) - [1،3]-dioxolane (DLinKC2-DMA)، disteroylphosphatidyl الكولين، والكولسترول، وPEG-DMG باستخدام تشكيل حويصلة عفوية إجراء صياغة كما هو موضح سابقا. 1
6. داخل المثانة الإدارة وضعت من سارنا
- بعد تأسيس ورم المثانة orthotopic نموذج، يتم التعامل مع الفئران داخل المثانة RNA تفعيل صغيرة (سارنا) التي صيغت في جزيئات الدهون (LNPs) (الجدول 1).
- تم تأسيس تخدير عام والمحافظة عليها مع المتبخرة isoflurane، ويتم تطبيقها العقيمة تشحيم العيون.
- وضع الحيوان في موقف ضعيف.
- إجراء قسطرة مجرى البول كما هو موضح سابقا.
- يضع ربطة عنق من الحرير 4-0 حول مجرى البول والقسطرة.
- نضح كل البول من القسطرة والمثانة باستخدام حقنة فارغة وإبرة مرود.
- حقن الشرطة الوطنية الليبيرية، سارنا intravesically لجرعة ما مجموعه 50 ميكرولتر (3 ملغ / كلغ). إزالة القسطرة في وقت واحد وإبرة مرود، وترك مجرى البول المغطي من الحرير التعادل.
- وسوف تظل الماوس تخدير مع مجرى البول المغطي لمدة 2 ساعة.
- بدأ العلاج داخل المثانة مع الشرطة الوطنية الليبيرية، سارنا في يوم 4 بعد زرع ورم. عولجت فئران متسلسل، كل 3 أيام، على ما مجموعه 14 العلاجات.
7. ممثل النتائج
يمكن رصد أورام المثانة الناجمة عن KU-7-luc2-GFP الخلايا عن طريق التصوير bioluminescent luciferase المراسل (الشكل 1A وجيم) والموجات فوق الصوتية المثانة (الشكل 1B و D). الأورام غالبا ما تكون قابلة للكشف في غضون 3-5 أيام بعد تلقيح الخلية. وجدنا نجاح زرع المثانة ورم في أكثر من 90٪ من الفئران. كما المعاملة مع الرنا المزدوج الجديلة داخل المثانة تستتبعه، ويمكن رصد تطور ورم وايعشر هذه الطرائق. بعد أن تتم التضحية الحيوانية، ويمكن أيضا نمو الورم وأكد أن استخدام GFP مضان. بشكل عام، تعني التألق الحيوي يرتبط الأبعاد بالموجات فوق الصوتية سيلة لأورام المثانة، كما يرى بصريا في أرقام 1C و 1D. ومع ذلك، بعد أن تم التضحية بالحيوانات وتأكدت الورم عن طريق GFP، وجدنا أن التألق الحيوي يرتبط بشكل وثيق مع وجود ورم قابلة للحياة من فعل قياسات بالموجات فوق الصوتية. وكان هذا واضح بشكل خاص بين الفئران التي عولجت مع سارنا (على العكس من الضوابط) لأن المتبقي ندبا في الفئران التي عولجت في كثير من الأحيان تصور بواسطة الموجات فوق الصوتية ولكن لا يمكن تفريقها عن ورم الحية.
الشكل 1. حركية نمو الورم من أورام المثانة. (A) التصوير ضوء بارد يقيس luciferase النشاط ضمن أورام المثانة لتأكيد مكان ونموها. (ب) في ultrasoun المثانة فيفود باستخدام مسبار 40MHz تنتج صورا ورم أبعادها يمكن قياسها بدقة. (ج) الرسوم البيانية التي توضح زيادة الورم التقدمية في أبعاد التألق الحيوي والموجات فوق الصوتية. تمثل القيم يعني (+ / - الانحراف المعياري) في الفترة من 6 قياسات الحيوانات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم لبروتوكول لإنشاء نموذج الفأر طعم أجنبي orthotopic ورم المثانة يليها العلاج داخل المثانة من الأورام مع سارنا الشرطة الوطنية الليبيرية وضعت والتي تستهدف مروجي P21 CIP1/WAF1 (P21) لتفعيل النسخي. 2، 3 والاورام الناتجة يمكن أن تكون وأكد ورصدها مع التصوير بالموجات فوق الصوتية وbioluminescent المثانة. نماذج قد تكون متفوقة على Orthotopic داخل الصفاق، تحت الجلد، أو نماذج عن طريق الوريد من خلال توفير بيئة البول والظهارة البولية الذي يقترب على نحو أوثق الذاتية سرطان المثانة. وقد وضعت مجموعة متنوعة من orthotopic أورام المثانة فأر باستخدام كل جدار المثانة الحقن المباشر، فضلا عن تقطير داخل المثانة. 4-8 تقطير داخل المثانة من ورم، كما هو موضح هنا، بشكل وثيق يقلد أورام المثانة الإنسان التي تبدأ بشكل سطحي في مخاطية وتنمو أعمق في جميع مراحل تطورها. لدينا طريقة استخدام نترات الفضة لاستيعاب BLADالمقررات لامتصاص ورم غير مكلف وبسيط من الناحية الفنية.
Hadaschik وآخرون. وصف تقطير داخل المثانة من أورام المثانة لدى الفئران وذكرت موثوق تقييم ورم bioluminescent. 5 وجدنا بالمثل معدلات عالية من زرع ورم ناجحة مع القسطرة وتقطير الخلية. لم تكن لدينا الأورام وأكد فقط مع التألق الحيوي ولكن أيضا مع الموجات فوق الصوتية في المثانة الجسم الحي، وتوفير وسيلة إضافية لقياس تطور الورم.
في هذا البروتوكول، نلاحظ عدة تعديلات تقنية على الآخرين. استخدمنا تقطير محلول نترات الفضة لعرقلة طبقة المثانة جلايكان خارج الخلية لزرع الخلايا السرطانية، بدلا من كاو كهربي. وجدنا هذا الخيار يكون هناك رخيصة، وأسلوب بسيط، ويمكن الاعتماد عليها أن التقليل من احتمالات الخطأ المستخدم. خلال تقييم الموجات فوق الصوتية في المثانة، وجدنا أنه لا لزوم لها لأداء قسطرة الإحليلسلفا. طالما لم يتم حيوان تعرض لمحنة كبيرة للتسبب التبول قبل ان يخضع لتخدير، ومنتفخة بشكل موثوق المثانة الماوس أثناء التصوير للسماح لرؤية الورم ممتازة. من دون شك، كان قسطرة الإحليل الخطوة الأقل موثوق للبروتوكول. في تجربتنا، والقسطرة من الفئران عارية athymic هو أكثر صعوبة مما كان عليه في C57 الفئران. ومع ذلك، مع تقنية الموصوفة في هذا البروتوكول، والفيديو، ومقسطر مرارا أكثر من 90٪ من الحيوانات على حد سواء بنجاح لتقطير الورم والعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL هو المخترع في انتظار طلبات براءات الاختراع المتعلقة سارنا التي تم رفعها من قبل جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ورخص للأدوية Alnylam.
Acknowledgments
ويتم تمويل هذا البحث من قبل المثانة AACR شيبرد هنري جرانت أبحاث السرطان (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
