Summary
הקמת מודל orthotopic גידול בשלפוחית השתן להעריך את ההשפעות נוגדות הגידולים של סרנה נמסר intravesically וצמיחה ניטור הגידול והדמיה על ידי אולטרסאונד bioluminescent.
Abstract
אנו מציגים שיטה חדשה לטיפול בסרטן שלפוחית השתן עם מסירת intravesically הפעלת RNA קטן (סרנה) בשנת המודל orthotopic העכבר xenograft שלפוחית השתן הגידול. מודל העכבר הוא הוקם על ידי צנתור השופכה בשאיפה תחת הרדמה מלאה. כוויה כימית הוא הציג אז את רירית שלפוחית השתן באמצעות פתרון השלפוחית כסף חנקתי לשבש את שכבת glycosaminoglycan שלפוחית השתן מאפשר לתאים לצרף. אחרי כמה שטיפות עם מים סטריליים, סרטן שלפוחית השתן האנושית KU-7-luc2-GFP תאים החדירו דרך קטטר לתוך שלפוחית השתן להתעכב במשך 2 שעות. לאחר צמיחה של גידולים בשלפוחית השתן הוא אישר ומפוקחים על ידי אולטרסאונד שלפוחית השתן vivo והדמיה bioluminescent. הגידולים מטופלים אז intravesically עם סרנה נוסח חלקיקים שומנים בדם (LNPs). הגידול מנוטר עם אולטרסאונד ביולומינציה. כל השלבים של התהליך הזה הם הפגינו בסרטון המצורף.
Protocol
הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.
1. תא הכנה
- שלפוחית השתן האנושית סרטן תאים קו KU-7-luc2-GFP (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) הוא גדל RPMI-1640 Media השלימו עם סרום 10% שור עוברית 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין.
- תרבויות נשמרים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם התקשורת משתנה כל יומיים שלושה.
- התאים נקצרו על ידי עיכול טריפסין וספר באמצעות hemocytometer. ההשעיה תא בודד של 2 x 10 6 תאים μl 50 הוכן פוספט שנאגרו מלוחים ושמרה על הקרח.
2. שלפוחית השתן Orthotopic גידול דגם
- נשים בעירום (נו / נו) עכברים 8-10 שבועות (סימונסן מעבדה, Gilory, CA) היו בשימוש.
- מניחים על משטח סטרילי וילון חימום לשרתSA כירורגית פלטפורמה. סיכה ריבה סטרילית, 24 guage צנתרים עם מחטים stylet, תמיסת כסף חנקתי, מים סטריליים מוכנים.
- הרדמה כללית מושרה של עכברים עם isoflurane בשאיפה (3% לזירוז, 1-2% לצורך תחזוקה) ומתוחזק דרך nosecone. משחת עיניים סטרילית מוחל על העיניים של בעלי חיים, ועל משטח חום משמש כדי לשמור על חום הגוף.
- מניחים את העכבר במצב שכיבה.
- בעדינות לתפוס הפות של החיה עם מלקחיים לייצוב.
- באמצעות קטטר 24-guage תוך ורידי עם stylet מחט הוסר, השופכה העכבר צינתור. שימון מספיק יש להשתמש. פרקדן עם העכבר, השופכה ממוקם האחורי מיד את קפלי בפות ו הקדמי אל הנרתיק. זווית של 45 מעלות הוא נלקח תחילה על מנת cannulate השופכה ועוברים מתחת לעצם הערווה. זווית רדודה יותר נלקח מכן לעבור דרך השופכה לתוך השלפוחית. פרה האגן עדינותבטוח ליישר השופכה יכול לעתים לעזור. יש להקפיד להימנע לדחוף חזק מדי כנגד התנגדות, כמו זה יכול להוביל נקב השופכה או בשלפוחית השתן. שתן לראות בתוך קטטר מאשרת את המיקום בתוך לומן שלפוחית השתן.
- Aspirate השתן מן לומן קטטר לשלפוחית השתן באמצעות מחט stylet. מחט stylet משמש את כל השאיפות וזריקות הבאות, והשאיר את הקטטר במקום. זה מאפשר הזרקה של כמויות מדויקות על ידי ביטול שטח מת, תוך קטטר, וזה גורם צנתורים חוזרים ונשנים מיותר.
- לפגוע בשכבת glycosaminoglycan של urothelium שלפוחית השתן, 10 μL של חנקתי M 0.5 כסף מוזרק ואפשר לשבת במשך 10 שניות. זה עלול להיווצר משקע לבן עם השתן שנותר.
- Aspirate וזורקים את תלולה שלפוחית השתן תוכן באמצעות מחט stylet.
- לשטוף את שלפוחית השתן על ידי הזרקת מים סטריליים 100 μL. Aspirate וזורקים את המים. Repeב לשטוף עם מים סטריליים 3 פעמים עבור סכום כולל של 4 שוטף.
- מניחים עניבת משי סביב 4-0 meatus השופכה כדי לחסום את השופכה לקראת הסרת הקטטר.
- מוכן להזריק בעבר 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP תאים μL 50 באמצעות מחט stylet.
- במקביל להסיר את הקטטר ואת המחט stylet, עוזב את השופכה האפילו על ידי עניבה ממשי.
- עכבר יישמר בהרדמה מלאה למשך 2 שעות לפני עניבת המשי יוסר חיות מתעורר.
3. אולטראסאונד
- הרדמה כללית מושרה עם isoflurane אדי ומתוחזק באמצעות חרטומו.
- Vevo VisualSonics 770 in vivo ברזולוציה גבוהה Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, טורונטו, אונטריו, קנדה) עם RMV-40 704 MHz החללית היה בשימוש.
- מניחים את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת אולטרסאונד.
- להבטיח את הרגליים האחוריות של החיהעם הקלטת, כדי למנוע עודף תנועה במהלך מניפולציה של בדיקה אולטרסאונד.
- החל ג'ל אולטרסאונד לאגן העכבר.
- מנמיכים RMV-704 (40 MHz) בדיקה אולטרסאונד על האגן העכבר כדי להשיג תמונות רוחביים או האורך.
- אם הגידול נמצא, התמונות ניתן לשמור על מידה של ממדים סרטניים.
4. Bioluminescent הדמיה
- לבצע הזרקת intraperitoneal של μL 200 (150 מ"ג / ק"ג) מצע luciferin.
- לגרום הרדמה כללית עם אדי isoflurane ולשמור באמצעות חרטומו.
- מניחים עכברים במצב שכיבה בתוך imager ביולומינציה.
- חמש דקות לאחר ההזרקה luciferin, למדוד את ביולומינציה מבעל חיים ב פוטונים בשנייה.
5. סרנה הכנה
- לסנתז RNA oligonucleotides בקנה מידה של μmol 50-100.
- לחשל משלימים יחיד תקועים oligonucleotides אניn כדי דופלקס saRNAs.
- שומנים בדם nanoparticle (LNP)-סרנה מוכנים עם השומנים ionizable 1,2-dilinoleyl-4 (2 - dimethylaminoethyl) - [1,3], dioxolane (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl כולין, כולסטרול, PEG-DMG באמצעות שלפוחית היווצרות ספונטנית הליך ניסוח כפי שתואר לעיל. 1
6. מינהל השלפוחית של סרנה נוסחה
- לאחר הקמת מודל orthotopic גידול בשלפוחית השתן, עכברים מטופלים השלפוחית הפעלת RNA קטן (סרנה) ניסח חלקיקים שומנים בדם (LNPs) (טבלה 1).
- הרדמה כללית הוא הוקם ומתוחזק עם אדי isoflurane, וכן חומר סיכה עיניים סטרילית מוחל.
- מניחים את חיה במצב שכיבה.
- לבצע צנתור השופכה כפי שתואר לעיל.
- מניחים עניבת משי 4-0 סביב השופכה קטטר.
- לשאוב את כל קטטר שתן ושלפוחית השתן באמצעות מזרק ריק מחט stylet.
- להזריק LNP-סרנה intravesically במינון כולל של μL 50 (3 מ"ג / ק"ג). במקביל להסיר את הקטטר ואת המחט stylet, עוזב את השופכה האפילו על ידי עניבה ממשי.
- העכבר יישאר בהרדמה עם השופכה האפילו במשך 2 שעות.
- טיפול השלפוחית LNP-סרנה החלה ביום 4 לאחר ההשתלה הגידול. העכברים טופלו סדרתי, כל 3 ימים, עבור סכום כולל של 14 טיפולים.
7. נציג תוצאות
גידולים בשלפוחית השתן הנובעים KU-7-luc2-GFP בתאים יכול להיות פיקוח על ידי בלוציפראז bioluminescent הדמיה (איור 1 א 'ו - C) אולטרסאונד שלפוחית השתן (איור 1 ב' ו ד). הגידולים הם לעתים קרובות לזיהוי בתוך 3-5 ימים לאחר חיסון התא. מצאנו ההשתלה המוצלחת גידול שלפוחית השתן ב 90% מעל של עכברים. כטיפול עם dsRNA השלפוחית מתפתח, התקדמות של הגידול ניתן לפקח Wiה שיטות אלה. לאחר חיה הוא הקריב, הגידול יכול להיות גם אישר באמצעות GFP פלואורסצנטי. באופן כללי, אומר ביולומינציה בקורלציה עם ממדים אולטרסאונד ממוצע של גידולים בשלפוחית השתן, כפי שניתן לראות ויזואלית ב 1C דמויות ו 1D. עם זאת, לאחר החיות הוקרבו ואת הגידול אושרה על ידי ה-GFP, מצאנו כי ביולומינציה מתואמים באופן הדוק יותר עם נוכחות של גידול בר קיימא מאשר מדידות אולטרסאונד. זה היה בולט במיוחד בקרב העכברים שטופלו סרנה (בניגוד שולטת) כי רקמת צלקת שיורית בעכברים שטופלו היה פעם דמיינו ידי אולטרה סאונד אך לא ניתן היה להבדיל בין גידול לחיות.
באיור 1. קינטיקה הגידול של גידולים בשלפוחית השתן. (א) הדמיה ביולומינציה מודד את הפעילות בלוציפראז בתוך גידולים בשלפוחית השתן כדי לאשר את מיקומם וצמיחה. (ב) ultrasoun שלפוחית השתן vivoד באמצעות בדיקה 40MHz מפיקה תמונות גידול שמידותיו ניתן למדוד באופן מדויק. (ג) גרף המדגים עלייה הדרגתית של הגידול בממדים ביולומינציה ו אולטרסאונד. הערכים מייצגים אומר (+ / - סטיית התקן) מדידות של 6 בעלי חיים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל orthotopic העכבר xenograft גידול בשלפוחית השתן בעקבות הטיפול השלפוחית של גידולים עם סרנה LNP ניסח שמכוונת את האמרגן של p21 CIP1/WAF1 (p21) להפעלה תעתיק. 2, 3 גידולים כתוצאה יכול להיות אישר פיקוח עם הדמיה bioluminescent ו אולטרסאונד שלפוחית השתן. מודלים Orthotopic עשוי להיות עדיף על intraperitoneal, תת עורית, או על ידי מתן תוך ורידי מודלים בסביבה של שתן urothelium כי נוסף קרוב יותר לסרטן שלפוחית השתן אנדוגני. מגוון רחב של גידולים בשלפוחית השתן orthotopic עכבר הוקמו הן באמצעות שלפוחית השתן ישירה הקיר הזרקת כמו גם החדרה השלפוחית. 4-8 החדרה השלפוחית של הגידול, כפי שעולה כאן, באופן הדוק יותר מחקה גידולים בשלפוחית השתן אדם המתחילים שטחית ב אפיתל הרירית ולגדול עמוק יותר כפי שהם להתקדם. שלנו שיטת באמצעות כסף חנקתי כדי להתאים bladסונדרס לספיגה הגידול הוא זול ופשוט מבחינה טכנית.
Hadaschik et al. תיאר החדרה השלפוחית של גידולים בשלפוחית השתן בעכברים ודיווח אמין הגידול הערכה bioluminescent. 5 אנחנו דומה נמצא שיעור גבוה של השתלה מוצלחת עם גידול צנתור ו החדרה התא. גידולים שלנו לא אושרו רק ביולומינציה אלא גם על שלפוחית השתן אולטרסאונד vivo, מתן שיטה נוספת לכימות התקדמות הגידול.
בפרוטוקול זה, נציין מספר שינויים לטכניקה של אחרים. העסקנו החדרה של תמיסת כסף חנקתי לשבש glycosaminoglycan תאי השלפוחית בשכבה להשתלה תאים סרטניים, במקום electrocautery. מצאנו שזו שיטה זולה, פשוטה ואמינה, כי למזער אפשרות של טעות המשתמש. במהלך הערכת אולטרסאונד של שלפוחית השתן, מצאנו אותו צורך לבצע צנתור השופכהמראש. כל עוד בעל חיים לא היה נתון במצוקה משמעותית כדי לעודד הטלת שתן לפני שעברו הרדמה, שלפוחית השתן העכבר היתה נפוחה בצורה אמינה במהלך ההדמיה, כדי לאפשר ויזואליזציה הגידול מעולה. ללא ספק, צינתור השופכה היה הצעד הפחות אמין לפרוטוקול. מניסיוננו, צנתור של עכברים בעירום athymic קשה יותר מאשר עכברים בעכברים C57. עם זאת, עם הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה ווידאו, מעל 90% של בעלי חיים היו צינתור שוב ושוב בהצלחה החדרה הן הטיפול הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL הוא ממציא בשם ממתינים על בקשות לפטנטים הקשורים סרנה אשר הוגשו על ידי אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ו ברשיון Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הנרי AACR סרטן שלפוחית השתן שפרד מענק מחקר (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
