Summary
Создание модели ортотопической опухоли мочевого пузыря для оценки противоопухолевого эффектов внутрипузырно доставлен Сарны и контроля роста опухоли с помощью ультразвука и биолюминесцентного изображений.
Abstract
Мы представляем новый способ лечения рака мочевого пузыря с внутрипузырно поставляется небольшой активации РНК (Сарны) в ортотопической модели мыши ксенотрансплантата опухоли мочевого пузыря. Мышах установлено уретры при катетеризации ингаляционных общим наркозом. Химический ожог затем вводится в слизистой оболочке мочевого пузыря использованием внутрипузырного раствора нитрата серебра нарушить слой мочевого пузыря гликозаминогликана и позволяет клеткам придают. После нескольких стирок стерильной водой, человеческий рака мочевого пузыря KU-7-luc2-GFP клетки привил через катетер в мочевой пузырь, чтобы жить в течение 2 часов. Последующий рост опухолей мочевого пузыря и подтверждается наблюдением в естественных условиях ультразвукового мочевого пузыря и биолюминесцентного изображений. Опухоли затем обрабатывают внутрипузырно с Сарна сформулированы в липидных наночастиц (LNPs). Рост опухоли контролируется с помощью ультразвука и биолюминесценции. Все этапы этой процедуры демонстрируются в сопроводительных видео.
Protocol
Процедуры с участием животных предметы были одобрены Уходу за животными и использованию комитета (IACUC) из Университета Калифорнии, Сан-Франциско.
1. Сотовые подготовка
- Человеческого рака мочевого пузыря линии клеток KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Хопкинтон, Массачусетс) выращивается в RPMI-1640 средств массовой информации с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкг / мл гентамицина.
- Культуры при температуре 37 ° C, 5% СО 2 со средствами массовой информации меняется каждые два-три дня.
- Клетки собирают на пищеварение трипсина и рассчитывали с использованием гемоцитометра. Суспензии отдельных клеток, 2 х 10 6 клеток в 50 мкл был подготовлен в фосфатный буферный солевой раствор и держится на льду.
2. Ортотопическая модели опухоли мочевого пузыря
- Обнаженная (Nu / Nu) мышей 8-10 недель (Симонсен лаборатории Gilory, Калифорния), были использованы.
- Поместите стерильной драпировки на грелку, чтобы служитьса хирургических платформы. Стерильные смазочных желе, 24-guage катетеры с стилет иглы, раствор нитрата серебра, и стерильной воды готовы.
- Общий наркоз индуцированных у мышей с вдыхаемым ИФ (3% для индукции, 1-2% за обслуживание) и поддерживается с помощью головная часть. Стерильный глазной мази наносится на глаза животного, а также тепло панель используется для поддержания температуры тела.
- Наведите в положении лежа.
- Осторожно понять вульвы животного щипцами для стабилизации.
- Использование 24-guage внутривенный катетер с иглой стилет удалены, мыши уретры катетер. Широкие смазки следует использовать. С помощью мышки на спине, мочеиспускательный канал расположен сразу за половые складки и передней во влагалище. Под углом 45 градусов изначально принято в целях вводить иглу в уретру и передать под лобковой костью. Более небольшим углом, принимается, чтобы пройти через мочеиспускательный канал в мочевой пузырь. Нежный тазовых давленияУбедитесь, что выпрямить уретры часто могут помочь. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать случайного нажатия сильно на сопротивление, так как это может привести к уретры или мочевого пузыря перфорации. Моча рассматривать в катетер подтверждает свое расположение в мочевом пузыре просвет.
- Аспирируйте мочи из мочевого пузыря катетером и просвета использованием стилет иглу. Игла стилет используется для всех последующих стремлений и инъекции, в результате чего катетер на месте. Это позволяет для инъекций точных объемов за счет устранения мертвого пространства в катетер, и это делает повторяющиеся катетеризации ненужным.
- Чтобы ослабить гликозаминогликана слой мочевого пузыря уротелия, 10 мкл 0,5 М нитрата серебра вводится и разрешено жить в течение 10 секунд. Это может образоваться белый осадок с остатками мочи.
- Аспирируйте и отказаться от осадка и мочевого пузыря, содержимое, используя стилет иглу.
- Вымойте мочевого пузыря путем введения 100 мкл стерильной воды. Аспирируйте и отказаться от воды. REPEна промыть стерильной водой 3 раза в общей сложности 4 стирок.
- Поместите 4-0 шелковый галстук вокруг уретры прохода к окклюзии уретры при подготовке удаления катетера.
- Вводите заранее подготовленный 2 х 10 6 KU-7-luc2-GFP клеток в 50 мкл использованием стилет иглу.
- Одновременно удалить катетер и стилет иглу, оставляя уретру окклюзии шелковый галстук.
- Мышь будет поддерживаться под общим наркозом в течение 2 часов до шелковый галстук удаляется, а животное пробуждается.
3. Ультразвук
- Общий наркоз индуцированного ИФ испаренного и поддерживается с помощью носового конуса.
- VisualSonics Vevo 770 В Vivo высокого разрешения Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Торонто, Онтарио, Канада) с RMV-704 40 МГц зонд был использован.
- Наведите в положении лежа на УЗИ платформы.
- Закрепите задние ноги животногос лентой, чтобы избежать избыточного движения во время манипуляций с ультразвуковым зондом.
- Применение ультразвуковой гель для мыши таза.
- Нижняя RMV-704 (40 МГц) ультразвуковой датчик на мышь таз для получения поперечных или продольных изображений.
- Если опухоль находится, изображения могут быть сохранены для измерения размеров опухоли.
4. Биолюминесцентный изображений
- Выполните внутрибрюшинного введения 200 мкл (150 мг / кг) люциферин подложки.
- Вызвать общим наркозом с испаренной ИФ и поддерживать через носовой конус.
- Поместите мышь в положении лежа в биолюминесценции тепловизор.
- Через пять минут после инъекции люциферин, измерение биолюминесценции от животного в фотонов в секунду.
5. Подготовка Сарна
- Синтез РНК олигонуклеотидов в масштабе 50-100 мкмоль.
- Отжиг дополнительных одноцепочечных олигонуклеотидов яНТО дуплекс saRNAs.
- Липидов наночастиц (ЛНП)-Сарны готовятся ионизируемые липидного 1,2-dilinoleyl-4-(2 - диметиламиноэтил) - [1,3]-диоксолана (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl холин, холестерин и PEG-DMG помощью спонтанного формирования пузырьков разработки процедуры, как описано выше 1.
6. Внутрипузырная администрации Сформулированные Сарна
- После установления ортотопической модели опухоли мочевого пузыря, мышей, получавших внутрипузырного небольшой активации РНК (Сарны), сформулированным в липидных наночастиц (LNPs) (табл. 1).
- Общей анестезией устанавливается и поддерживается с испаренной ИФ, и стерильной глазной смазкой применяется.
- Поместите животное в лежачем положении.
- Выполните уретры катетеризации как описано выше.
- Поместите 4-0 шелковый галстук вокруг уретры и катетером.
- Аспирируйте все мочи из катетера имочевой пузырь, используя пустой шприц и иглу стилет.
- Вводите ЛНП-Сарны внутрипузырно в общей дозе 50 мкл (3 мг / кг). Одновременно удалить катетер и стилет иглу, оставляя уретру окклюзии шелковый галстук.
- Мышь будет оставаться под наркозом с уретры закрыта в течение 2 часов.
- Лечение внутрипузырного ЛНП-Сарны началась на 4-й день после имплантации опухоли. Мышей рассматриваться поочередно, каждые 3 дня, в общей сложности 14 процедур.
7. Представитель Результаты
Опухоли мочевого пузыря, вытекающих из KU-7-luc2-GFP клеток могут контролироваться с помощью люциферазы биолюминесцентного изображения (рис. 1А и C) и мочевого пузыря, УЗИ (рис. 1В и D). Опухоли часто обнаруживаются в течение 3-5 дней после прививки клетки. Мы обнаружили, успешной имплантации опухоли мочевого пузыря у 90% мышей. В лечении внутрипузырного дсРНК вытекает, прогрессирование опухоли можно контролировать шго эти условия. После того, как животное в жертву, рост опухоли может быть подтверждена с помощью GFP флуоресценции. В целом, средняя биолюминесценции коррелирует с размерами средней ультразвука для опухолей мочевого пузыря, как это видно визуально в цифрах 1С и 1D. Тем не менее, после того, как животные были принесены в жертву и опухоль была подтверждена GFP, мы обнаружили, что биолюминесценции более тесно коррелировали с наличием жизнеспособных опухолевых чем ультразвуковых измерений. Это было особенно заметно у мышей, получавших Сарны (в отличие от контроля), так как остаточные рубцовой ткани в мышей часто визуализируется ультразвуком, но не может отличить от живых опухоли.
Рисунок 1. Опухоль кинетики роста опухоли мочевого пузыря. (A) Биолюминесценция изображений измеряет активность люциферазы в опухоли мочевого пузыря, чтобы подтвердить их расположение и рост. (B) В естественных условиях ultrasoun мочевого пузыряD Использование 40MHz зонд производит опухоли изображения, размеры которых могут быть точно измерены. (C) графики, иллюстрирующие постепенное увеличение опухоли в биолюминесценции и ультразвуковые измерения. Значения представляют собой среднее (+ / - стандартное отклонение) измерения от 6 животных. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем протокол о создании мыши ортотопической ксенотрансплантата опухоли мочевого пузыря модели следует внутрипузырного лечения опухолей с ЛЯП сформулированы Сарны, предназначенного для промоутера p21 CIP1/WAF1 (p21) для активации транскрипции. 2, 3 Полученная опухоли могут быть подтвердил и контролируется с биолюминесцентного изображений и мочевого пузыря УЗИ. Ортотопическая модели могут быть выше внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно модели, предоставляя среду мочи и уротелия, что более близкое эндогенного рака мочевого пузыря. Разнообразие ортотопической опухоли мочевого пузыря мыши были созданы с использованием как прямой впрыск стенки мочевого пузыря, а также внутрипузырной инстилляции. 4-8 внутрипузырной инстилляции опухоли, как показано здесь, более точно имитирует человеческий опухолей мочевого пузыря, которые начинают поверхностно в эпителий слизистой оболочки и углубляться как они прогрессируют. Наш метод с использованием нитрата серебра для размещения Бладаорденами опухоли поглощение является недорогой и технически простой.
Hadaschik соавт. Описаны внутрипузырной инстилляции мочевого пузыря опухоли у мышей и сообщил надежный биолюминесцентного оценки опухоли 5. Аналогично обнаружили высокие показатели успешной имплантации опухоли с катетеризацией и клеточной закапывания. Наши опухолей не только подтвердил биолюминесценции, но и в естественных условиях с ультразвуковым мочевого пузыря, обеспечивая дополнительный метод для количественного опухолевой прогрессии.
В этом протоколе, отметим некоторые изменения в технике других. Мы использовали инстилляции раствор нитрата серебра нарушить слой мочевого пузыря внеклеточной гликозаминогликана для имплантации опухоли клетки, вместо того, электрокоагуляция. Мы обнаружили, что это дешевый, простой и надежный метод, который минимуму возможность ошибки пользователя. Во время ультразвукового оценки мочевого пузыря, мы обнаружили, что нет необходимости выполнять уретральной катетеризациизаранее. Пока животное не подвергается значительным бедствие вызывает мочеиспускание до проведения анестезии, мыши пузырь надежно растянут во время съемки для обеспечения отличной визуализации опухоли. Без сомнения, уретры катетеризации был наименее надежный шаг протокола. По нашему опыту, катетеризация бестимусных голым мышам сложнее, чем в С57 мышей. Тем не менее, с методикой, описанной в этом протоколе и видео, более 90% животных были неоднократно успешно катетер для закапывания опухоли и лечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL является именем изобретателя на заявки на патенты, связанные с Сарна, которые были поданы в Университете Калифорнии в Сан-Франциско и лицензию на Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Это исследование финансируется AACR Генри Шепард Рак мочевого пузыря грант (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
