صممت جزيئات الفيروس الغدي لاحتواء إما غير طبيعي التماثلية الأحماض الأمينية azidohomoalanine أو السكر azido O-GlcNAz. وligated chemoselectively المجموعة أزيد من كل ردود الفعل عن طريق "فوق" كيمياء كوسيلة لتعديل سطح الفيروسية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Chemoselective تعديل السطوح الفيروسية عن طريق الكيمياء نقرة Bioorthogonal
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تلقت لتعديل جزيئات الفيروس قدرا كبيرا من الاهتمام لإمكانياتها الهائلة في التأثير على العلاج الجيني، والتطبيقات oncolytic وتطوير لقاح. 1،2،3 النهج الحالية لتعديل أسطح الفيروسية، والتي هي في معظمها على أساس علم الوراثة، وغالبا ما تعاني من التوهين تنبيغ. 4،5 الإنتاج الفيروس، والعدوى والخلوية عن طريق chemoselective الكيمياء نقرة، قمنا بتطوير نهج بديل مباشر التي الالتفاف حول هذه القضايا على حد سواء في حين تبقى مرنة للغاية ويمكن الوصول إليها. 1،2
الهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على فعالية استخدام bioorthogonal كيمياء فوق لتعديل سطح من نوع اتش 5 الجسيمات. ويمكن استخدام هذه عملية من خطوتين سواء على المستوى العلاجي 1 أو تحليلي، 2،6 لأنها تسمح لربط chemoselective من الجزيئات التي تستهدف والأصباغ أو الجزيئات الأخرى ذات الاهتمام على البروتيناتمسبقا مع وصفت به أزيد. المزايا الثلاث الرئيسية لهذه الطريقة هي أن (1) وضع العلامات الأيضية يوضح شيئا يذكر لولا تأثير على اللياقة البدنية الفيروسية، 1،7 (2) يمكن أن تستخدم مجموعة واسعة من يغاندس المستجيب، و (3) فهي سريعة بشكل ملحوظ، وموثوق بها يسهل الوصول إليها. 1،2،7
في أول خطوة من هذا الإجراء، ويتم إنتاج جزيئات اتش تحمل إما azidohomoalanine (آها، مركب ميثيونين) أو السكر غير طبيعي O-N-مرتبط azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz)، وكلاهما والتي تحتوي على أزيد (N-3) وظيفية المجموعة. بعد تنقية للجزيئات الفيروس أزيد المعدلة، وligated تحقيقا آلكاين يحتوي على شاردة طمرة فلوري بطريقة chemoselective إلى البروتينات قبل المسمى أو بروتينات سكرية. أخيرا، يجري تحليل SDS-PAGE للتدليل على الربط الناجح للمسبار على البروتينات قفيصة الفيروسية. ويرد آها التأسيس لتسمية جميع قفيصة الفيروسيةالبروتينات (Hexon، بينتون والألياف)، في حين أن نتائج دمج O-GlcNAz في وضع العلامات من الألياف فقط.
في هذا المجال المتطور، وقد تم طرق متعددة لأزيد-آلكاين ربط نجحت في تطوير، ولكن فقط وهما أننا وجدنا أن يكون الأكثر ملاءمة وأثبت هنا - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC) والنحاس والمحفز الاضافه الحلقيه أزيد-آلكاين (CuAAC) تحت جو امؤكسج.
البروتوكول
الرجوع إلى الجدول رقم 1 لإعداد جميع المخازن، ووسائل الإعلام والحلول المشار إليها في هذا البروتوكول.
1. إنتاج آها المسمى اتش
- تعد زراعة الأنسجة 11 100 ملم أطباق من خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري 293) المحافظة على كلوة الجنين البشري في 293 خلية متوسطة النمو (انظر الجدول رقم 1) في 37 درجة مئوية حتى أنها وصلت إلى 80 - 90٪ confluency. (ملاحظة: مع الثقافات confluency أكثر من 90٪ قد يكون من الصعب نقل العدوى، وربما لا تنتج فيروس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تطور ردود الفعل فوق chemoselective وbioorthogonal، بما فيها تلك التي من أزيدات، هو منطقة التطور السريع للبحوث، وبعد ذلك هناك عدد متزايد من ردود الفعل هذه للاختيار من بينها لتقديم الطلبات bioconjugation. قيدت نحن في نطاق هذا البروتوكول لتشمل اثنين فقط من الأساليب التي تم اختيارها بسبب فائدتها في مختبرنا الخاص والتجاري لجميع الكواشف.
في الطريق الأول من نوعه - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نعترف جبهة الخلاص الوطني للتمويل (CBET-0846259).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| نوع اتش 5 (Ad5) تحتوي على التحوير GFP | BCBC | 391 | |
| الكلى الجنينية البشرية (كلوة الجنين البشري 293) الخلايا | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco ومعدلة النسر متوسطة (DMEM)، ارتفاع نسبة الجلوكوز | إينفيتروجن | 11965-092 | |
| Dulbecco ومعدلة النسر متوسطة، لا الميثيونين، لا سيستين (DMEM و الأرصاد الجوية /-السيستئين)، ارتفاع نسبة الجلوكوز | إينفيتروجن | 21013-024 | |
| الأبقار العجل المصل | إينفيتروجن | 16170-078 | |
| بنسلين - الستربتوميسين 100 × الحل (القلم بكتيريا) | إينفيتروجن | 15140-122 | |
| 0.5٪ التربسين-EDTA (10 ×) | إينفيتروجن | 15400-054 | |
| 100 خلية ثقافة صحن مم، الأنسجة ثقافة البوليسترين المعالجة | دينار بحريني الصقر | 353003 | |
| خلية ثقافة CO 2 حاضنة | |||
| عدادة الكريات | |||
| مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية | |||
| معقم مرشح محقنة (0.2 ميكرون، خلات السليلوز) | VWR | 28145-477 (NA)، 514-0061 (أوروبا) | |
| أفانتي JE الطرد المركزي | بيكمان كولتر | 369001 | |
| مخروطي أنابيب (50 مل، معقمة) | دينار بحريني الصقر | 352098 | |
| أنبوب، Thinwall، فائقة الوضوح، 13.2 مل، 14 × 89 ملم | بيكمان | 344059 | |
| منبذة فائقة مجهزة 41 SW SW و 60 Rotor | بيكمان | ||
| إيبندورف بيوبور الآمن للقفل أنابيب، 1.5 مل | إيبندورف | 0030 121.589 | |
| منبذة 5418 | إيبندورف | 5418 | |
| Centri سبتمبر تدور الترشيح أعمدة هلام | فصل برينستون | CS-901 | |
| إبرة معقمة، قياس 18 | |||
| النيتروجين قفاز كيس (إذا CuAAC امؤكسج التي يتعين القيام بها) | |||
| قارورة ديوار | |||
| النيتروجين السائل | |||
| الكهربائي للخلية | |||
| فلوري هلام الماسح الضوئي | |||
| استعداد جل تريس، حمض الهيدروكلوريك جل | الحيوي راد | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| جينا العلوم البيولوجية | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (ميلان 4 GalNAz) | إينفيتروجن | C33365 | |
| الحرارية العلمية | 88905 | ||
| سيغما الدريخ | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic حامض (BDA) ملح الصوديوم | النائب Biomedicals | 0215011201 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | |||
| الميثانول | |||
| تريس قاعدة (تريس (hydroxymethyl) aminomethane) | |||
| فوسفات الصوديوم (نا2 هبو 4) | |||
| الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) | |||
| 1M حمض الهيدروكلوريك | |||
| الغليسيرول | |||
| ألبومين المصل البقري | |||
| L-السيستين | |||
| L-ميثيونين | |||
| SDS (سلفات الصوديوم دوديسيل) | |||
| 2-المركابتويثانول | |||
| جليكاين | |||
| زرقة البروموفينول | |||
| السيزيوم كلوريد (CSCL) | & Nباهوجان ساماج؛ | ||
| النحاس (I) بروميد (CuBr) | |||
| كلوريد الكالسيوم (CaCl 2) | |||
| كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | |||
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) | |||
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | |||
| آلكاين مسبار ل* CuAAC | |||
| طمرة آلكاين | إينفيتروجن | T10183 | |
| توتر آلكاين مسبار ل* SPAAC | |||
| طمرة ديبو آلكاين | إينفيتروجن | C10410 |
* شركات بارزة من الكواشف الكيمياء نقرة ومجموعات تشمل إينفيتروجن، العلوم البيولوجية جينا، شركاء بري، سيغما الدريخ، بحث غلين، انقر فوق أدوات الكيمياء، وBaseclick. ويمكن الاطلاع على مجموعة متنوعة من الأصباغ وآلكاين يغاندس تستهدف في كتالوجات هؤلاء البائعين ".
المراجع
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
