粒细胞依赖性自身抗体诱导的皮肤水疱形成

摘要

在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白一段200个氨基酸（aa 757-967）区域的纯化IgG抗体反复注射到小鼠体内，可复制出水疱表型以及组织学和免疫病理学特征，这些特征与人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）的特征相似¹。

摘要

自身免疫现象可发生于健康个体，但当自身耐受失效时，自身免疫反应可能导致特定病理改变。根据Witebsky准则，将疾病诊断为自身免疫性疾病的依据之一，是通过被动转移自身抗体在实验动物中复制出该疾病。对于获得性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa acquisita, EBA）——一种典型的累及皮肤和黏膜的器官特异性自身免疫病——近年来已建立多种实验模型。在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白第757至967位氨基酸（200个氨基酸片段）的纯化IgG抗体反复注射入小鼠体内，可复制出与人类EBA相似的大疱表型以及组织病理学和免疫病理学特征。 ¹全面发作的广泛性病变通常在首次注射后5-6天出现，疾病严重程度与给予的VII型胶原特异性IgG剂量相关。实验性获得性大疱性表皮松解症（EBA）中的组织损伤（水疱形成）依赖于组织结合的自身抗体对粒细胞的募集和激活 ^2,-4因此，该模型可用于解析粒细胞依赖性炎症通路在自身免疫性组织损伤中的作用，因为该模型仅重现了效应性自身免疫反应中T细胞非依赖的阶段。此外，多项研究证实了自身抗体具有诱导水疱形成的能力，进一步凸显了该模型的价值。 体内 并研究EBA中水疱形成的机制 ^1,3,-6最后，该模型将极大地促进针对自身抗体介导疾病的新抗炎疗法的开发。总体而言，大疱性类天疱疮（EBA）的被动转移动物模型是一种易于建立且具有教学意义的疾病模型，不仅有助于研究人员分析EBA的发病机制，还将帮助回答生物学和临床免疫学中一系列基础而关键的自身免疫问题。

方案

1. 致病性抗体的制备

注意：抗体的纯化和浓缩应在同一天内完成，因为抗体不能在0.1 M甘氨酸pH 2.5-3（洗脱缓冲液）中过夜（ON）保存。

IgG 的亲和纯化：使用 25 ml 免疫兔血清：

1. 在4 °C条件下过夜解冻兔血清，按1:1比例加入1×PBS（运行缓冲液），在20 °C下以1260 × g离心10分钟。若血清含脂肪较多，离心后可选择使用滤纸进行过滤。
2. 同时，用10倍柱床体积（柱床体积 = 填料体积）的1×PBS（运行缓冲液）清洗蛋白G填料柱。
3. 将稀释并过滤后的血清上样至柱中，在室温（RT）下于摇床上孵育1小时。
4. 用50 ml Falcon管收集穿流液（FT）。在确定纯化后的IgG浓度和效价之前，请勿丢弃该穿流液。
5. 用5倍柱床体积的1×PBS洗涤填料，同时准备50 ml Falcon管用于收集洗脱的IgG组分。每管中加入1 ml pH中和缓冲液：1 M TRIS，pH 10（或按洗脱液体积的1:20比例加入TRIS缓冲液）。
6. 向柱中加入100–150 ml洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.5–3，收集50 ml洗脱组分。将收集管翻转混匀2–3次，测定pH值，并加入中和缓冲液调节至pH 7.2–7.4。
7. 取少量IgG洗脱液，以洗脱缓冲液作为空白对照，....

结果

抗原特异性抗体的被动转移可在小鼠中引发完全型疾病，在临床表现、组织学及免疫病理学水平上均类似于人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）。小鼠的耳朵、鼻吻部、足部、腿部、背部及眼周会出现水疱、结痂、糜烂和脱发。疾病的首发临床症状最常出现在耳朵和/或头部区域。通过直接免疫荧光法在病变周围皮肤冷冻切片的真皮-表皮交界处可检测到特异性兔IgG和小鼠补体C3的沉积。组织学检查可见病变皮肤存在表皮下水疱及炎性细胞浸润。

然而，如果停止注射致病性的VII型胶原特异性抗体，疾病活动会逐渐减弱，并在数周内病变愈合。尽管如此，一定程度的炎症后瘢痕性脱发可能会无限期持续存在。

重组自身抗原（及致病性 IgG）的表征

小鼠胶原特异性 IgG 结合于真皮-表皮连接处（图 2B）。通过免疫印迹评估其特异性（图 2C，泳道 3、4 和 7）。

评估疾病活动度

讨论

将自身抗体被动转移至实验动物是证明其致病性的主要方法^{7, -12}。通过该方法获得的动物模型，除了可作为自身免疫的间接证据¹³外，还可用于研究致病机制的效应阶段。抗体诱导中性粒细胞依赖性皮肤水疱形成的获得性大疱性表皮松解症（EBA）被动转移模型，已被用于解析自身免疫性皮肤病中的组织损伤机制。该模型还成为一种极具教学意义的疾病模型，可用于研究抗体介导的器官特异性自身免疫病中若干基础性、生物学及临床关键问题，其意义远超针对Ⅶ型胶原自身免疫的范畴。最后，该模型也可用于研究包括基底膜生物学、免疫复合物对粒细胞的激活以及补体激活在内的基本生物学与病理生理学过程。

尽管已有多种实验条件可用于研究自身免疫性皮肤疾病EBA，包括ex vivo模型和动物模型¹⁴，但迄今为止最适合研究粒细胞依赖性炎症通路的方法是将自身抗体被动转移至动物体内。与ex vivo模型相比，在后者中需将粒细胞添加至预先与自身抗体孵育的皮肤切片中¹⁵，而在此动物模型中，小鼠可自发重现白细胞的浸润过程。此外，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组抗原			编码小鼠VII型胶原重组形式的质粒可向通讯作者索取。
免疫兔血清	www.eurogentec.com		我们使用200 μg抗原对新西兰白兔进行免疫，每两周一次，共三次。此项工作由比利时Eurogentec S.A.公司提供服务完成。
Protein G 琼脂糖	Roche Applied Science	11243233001
Balb/c 小鼠	Charles River Laboratories
OCT包埋剂，Tissue-Tek	Sakura Finetek	4583	OCT，最佳切削温度
标准冷冻模具	Sakura Finetek	4557	25 mm × 20 mm × 5 mm
中号冷冻模具	Sakura Finetek	4566	15 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link组织包埋盒	R. Langenbrinck	09-0503	组织学处理与包埋用包埋盒
专用纹身墨水黑色	H. Hauptner und Richard Herberholz GmbH & Co. KG	71492000	纹身糊
纹身钳 TZ1	EBECO E. Becker & Co GmbH		纹身装置
肝素	Carl Roth GmbH & Co.	7692.1
甲醛 37%	Carl Roth GmbH & Co.	7386
盐酸氯胺酮	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	K2753-1G
盐酸赛拉嗪	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	X1251-1G
无菌PBS	Biochrom	L182-50
数码相机	Nikon	Coolpix 5400
注射器驱动式滤器单元 0.45 μm	Millipore
卡尺	Mitutoyo 7309	1667338	Farnell（经销商）
疾病评分表			附示例