Summary
在动物模型中描述在我们目前的工作中，纯化的IgG抗体对拉伸的200个氨基酸（氨基酸757-967）的胶原纤维VII反复被注入到小鼠体内，再现起泡表型以及直方和免疫病理学特征对人体acquisita大疱性表皮松解症（EBA）
Abstract
自身免疫性现象发生在健康人，但，自我宽容失败时，可能会导致自体免疫反应在具体的病理。据Witebsky的假设，诊断为自身免疫性疾病中的标准之一是在实验动物中的疾病的再现由被动转移的自身抗体。大疱性表皮松解症acquisita（EBA），原型器官特异性自身免疫性疾病，皮肤和粘膜，一些实验模型，最近成立的。在动物模型中描述在我们目前的工作中，纯化的IgG抗体对拉伸的200个氨基酸（氨基酸757-967）的胶原纤维VII反复被注入到小鼠体内，再现起泡表型以及直方和免疫病理学特征对人体EBA 1。全面爆发普遍的疾病，通常第一次注射后5-6天，疾病的程度与剂量的管理Çollagen的VII-特异性IgG。在实验EBA组织损伤（水疱形成）根据粒细胞的募集和活化组织结合自身抗体-2，-4。因此，该模型允许粒细胞依赖的炎性途径参与自身免疫性组织损伤的解剖，作为模型只再现传出神经的自体免疫反应的T细胞独立的相位。此外，它的值被强调的一些研究表明自身抗体在体内的泡罩诱发电位和调查-6 EBA 1,3，水疱形成的机制。最后，这种模式将极大地促进新的自身抗体引起的疾病的消炎疗法的发展。总体而言，EBA被动转移动物模型的可访问性和指导性的疾病模型，将有助于研究人员不仅分析的的EBA发病，但回答基本的生物学和临床重要的自身免疫问题。
Protocol
1。致病抗体的制备
注意：该抗体的纯化和浓度应在同一天进行，作为抗体是不是要被存储在0.1M甘氨酸pH为2.5-3（洗脱缓冲液）过夜（ON）。
亲和纯化的IgG：使用免疫兔血清25毫升：
- 解冻后的兔血清对在4°C，混合，以1:1 1xPBS（运行缓冲液），并在1260 XG离心10分钟，在20°C。 ，用滤纸过滤步骤可能包括离心后的情况下，血清脂肪。
- 同时，洗G矩阵填充柱，10层的体积（床体积=矩阵体积）的1XPBS（缓冲区）的蛋白质。
- 应用稀释并过滤血清列，并在室温（RT）的摆动平台上孵育1小时。
- 收集流过（FT），在50毫升的小瓶管。不要丢弃它，直到浓度和纯化的IgG滴度的是已知的。
- 洗净，用5柱床体积的1XPBS矩阵，并在此期间收集洗脱的IgG级分的制备50毫升Falcon管中。移液器1毫升pH值中和缓冲液：1 M TRIS每个管（否则1:20 TRIS缓冲液的比例，相对于要收集的洗脱液的量）中的pH值为10。
- 100-150毫升洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸pH值2.5-3列，并收集50毫升组分（S）。翻转管2到3倍，测量pH值和添加中和缓冲区，直到你已经达到了pH值7.2-7.4。
- 收藏报错几滴的IgG的洗脱液，使用洗脱缓冲液作为标准具测量在280nm处的OD值。如果OD <0.1停止收集。
- 重新生成的蛋白质G矩阵，并按照制造商的说明将其存储。
通过超滤用Amicon管浓度：
- 通过离心15-20分钟，洗净的Amicon Ultra（15毫升/ 30KDa）超滤管1XPBS在3220 XG在4°C。丢弃从AMICON FT。
- 填充Amicons为25-30分钟，在3,220 xg离心和4℃下用15毫升的洗脱IgG级分和离心机，离心时间总是取决于洗脱液中的蛋白质含量。
- 丢弃FT和重复的超滤，直到你有没有洗脱馏分离开。
- 清洗浓缩抗体广泛的两倍，：1XPBS 25-30分钟离心。
- 收集的“粘性”，淡黄抗体溶液在最终体积为1,500-2,000微升1XPBS从的Amicon过滤器。
- 测量浓度的IgG制剂，使用分光光度计或的NanoDrop：
浓度。 （毫克/毫升）= A（280纳米）×稀释倍数/ 1,4 - 洗净，按照制造商的说明存储Amicons。
2。注射到小鼠体内的胶原纤维VII的特异性IgG
在实际的实验过程开始之前，确保实验的亲，tocol的书面和所有材料都准备好了实验。
- 准备的数据表疾病的得分，ELISA试剂盒，免疫荧光分析（IF）和髓过氧化物酶（MPO）检测。
- 标记管的血液和器官，的cryomolds以及组织学处理和嵌入磁带。
- 抗体溶液应准备新鲜或解冻的股票和特点，考虑到他们的反应（滴度IF显微镜和/或ELISA）。无菌过滤抗体溶液应是稀释在PBS中，在一个方式，所需的注射剂量为250-1000微升之间变化。请确保您有足够的抗体来完成整个实验。
- 准备新鲜抗凝血剂肝素20 U / ml和8.7毫克/毫升氯胺酮/ 1.3毫克/毫升甲苯噻嗪麻醉混合物。当牺牲的老鼠标记的试管中，用3.7％甲醛准备。
- 消毒手术器械（手术刀，剪刀，细一点，CURV编辑forcipes），并准备注射器（胰岛素注射器，1和2毫升注射器），针，数码相机和额外的记忆卡。
注：执行所有的程序，氯胺酮/甲苯噻嗪或异氟烷narcotized的小鼠。 异氟醚选项的日常皮肤检查是首选的麻醉老鼠一样，迅速 恢复。然而，在拍照时，87 mg / kg氯胺酮和13毫克/公斤甲苯噻嗪通常是皮下注射。对于安乐死，氯胺酮/甲苯噻嗪剂量增加至130 mg / kg氯胺酮和20毫克/公斤甲苯噻嗪。
- 为自己的整体健康状况，皮肤和毛皮的外观检查已标记的动物，称重，并测量他们的耳朵厚度（始终坚持同侧耳）。
- 注册在临床评价表的观测值和变化。
- 含有相同体积的抗凝血剂中的注射器从尾静脉收集20-30微升（2-3滴）血液。
- 消毒皮毛和皮肤用80％的乙醇。
- 抗体溶液注入背部皮下使用胰岛素注射器。（对于某些网站（如耳），只有少量（10〜50微升）是可行的注入。）
注射剂，应每隔一天重复的4倍。 BALB / c和C57BL6小鼠的体重约20克开始患上这种疾病后3-4天的第一届政府的400到750微克/克体重/注射自体抗体。
当完成实验：
- 将小鼠注射130 mg / kg和20 mg / kg的氯胺酮/甲苯噻嗪的皮下深麻醉下，从后腔静脉抽血他们和切心。
- 收集如皮肤：尾巴，耳朵，血液和食道的器官/组织样本，并把它们标记和PBS或3.7％甲醛填充管。
当返回到实验室检查：
- 离心1200×g离心10分钟，在室温下分离血浆的血液，转让等离子的正确标记的试管中，并将其储存。
- 嵌入皮肤活检的最佳切割温度介质使用cryomolds，适当的标签，并将其储存在-80°C。
- 将意味着在组织学标记嵌入模具和他们保持在3.7％的甲醛，直到石蜡包埋组织样本。
3。临床评价疾病的严重程度
小鼠应每天检查皮肤和粘膜的病变，应使用适当的形式记录调查结果。早安乐死的标准是皮肤的病变影响，20％的体表和连续三天的身体总重量的5％至10％的重量损失，计数的疾病5分（ 表1）。
- 把鼠标放在它的肚子。开始的头部区域，即用正确的耳朵和检查水疱，糜烂，以及地壳内的外侧。继续以同样的方式与左耳。
- 左眼和右眼被控制的迹象，红斑，脱发，糜烂和/或地壳。
- 刷到明年，额头和吻部地区持续的鼻子，嘴唇和口粘膜的腹侧部分。
- 检查右前腿的爪子开始，向上移动，切换到左前腿。的右和左后腿的相同的程序。
- 刷机通过弯曲的细点镊子颈部和背部面积的皮毛上。
- 转动鼠标在它的后面，并检查的腹侧部分以及腹侧四肢如前面相同的方式。
- 检查的尾巴。
- 拍照的有关身体部位的小鼠疾病。必须注意的图片的质量和数量。
- 计算疾病的临床得分。
4。皮肤和血浆样品的分析
- 准备，存储和/或处理所有收集到的组织，根据该计划。
- 切冷冻组织切片检测兔抗体和小鼠补体系统的组成部分。
- 分析不同的冰冻组织提取物和/或器官的蛋白质和酶的含量（MPO测定）。
- 第石蜡包埋组织，并与H＆E染色的可视化组织损伤的程度。
- ELISA，免疫印迹分析血浆。
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Representative Results
的被动转移抗原特异性抗体，结果在一个完全成熟的病鼠在临床，病理和免疫病理的水平，类似的人EBA。水疱，痂皮，糜烂和脱发发展的耳朵，猪嘴，爪，腿，背部和眼睛周围的老鼠。第一临床疾病的征兆，很可能会出现在耳朵上和/或头部区域。如果在中冰冻切片的病灶周围皮肤的真皮表皮交界处，检测到特异性的兔IgG和鼠补体C3沉积直接。在皮损部位表皮下疱和炎症浸润的组织学。
然而，如果停止注射致病性胶原蛋白的VII-特异性抗体，疾病活动逐渐变低，并且在几个星期内病灶愈合。然而，有一定程度的炎症后瘢痕性秃发可能会持续下去。
刻画通报BULLETIN重组自身抗原（及致病性IgG抗体）
小鼠胶原蛋白特异性IgG结合在真皮表皮交界处（ 图2B）。的特异性评估的免疫印迹（ 图2C，泳道3，4和7）。
疾病活动评分
的疾病的临床评价是根据我们开发一个评分系统（ 表1）：0，无病变; 1，小于1％的皮肤表面; 2，1-5％的皮肤表面，3，5 - 10％的皮肤表面; 4，10％至20％的皮肤表面的影响。抗体对小鼠胶原纤维VII引起皮肤损伤，如脱发，红斑，水疱，糜烂，结壳的耳朵，眼睛，口鼻部，四肢和躯干的BALB / c小鼠（ 图3）。
分析组织结合胶原蛋白特异性抗体和循环
沉积兔IgG和补体C3鼠标DETEC中，冷冻，病灶周围的组织切片（ 图4D和E）。的表皮下疱和炎性浸润被看作在组织样本（ 图4F）。循环兔抗体的酶联免疫吸附分析（ 图5）。冷冻的组织和/或器官提取物，分析它们的蛋白质和酶的含量（MPO测定）由不同的检测。
图1。 在体内的总体方案起泡引起的胶原的VII-特异性抗体的被动传输。兔子免疫小鼠胶原VII和兔IgG纯化从免疫血清。随后，特异性自身抗体皮下注射到小鼠体内后注射/出血时刻表。被检查的一般健康状况和疾病的迹象，每天的小鼠。
图2。表征致病胶原纤维VII-特异性IgG间接 IF盐分裂正常小鼠皮肤切片培养与免疫前兔血清和小鼠胶原的VII-特定免疫兔血清的查询结果在无沉积（A）和在自身抗体沉积分析真皮表皮交界处（B）所示，分别的特定的抗体识别的抗原（），他们提出了对与一组重叠的重组小鼠胶原纤维VII片段进行免疫印迹时（C，泳道3，4和7）。
图3。临床评价小鼠 IgG抗体的小鼠胶原纤维VII引起皮肤的病变，如脱发，水疱，糜烂，痂皮的耳朵，眼睛，口鼻部，李MBS和躯干的BALB / c小鼠（AD）。小鼠注射特异性抗体达到4分，而对一个冷漠的蛋白注入的与NRIgG或ABS的得分为0（E）。的临床得分的计算方法如下：0，没有病灶; 1，小于1％的皮肤表面; 2，在皮肤表面的1-5％; 3，在皮肤表面的5％至10％; 4，10 - 皮肤表面的20％的影响。身体总重量的5％至10％的重量损失在连续三天作为一个额外的计数在最后的得分点。
图4。直方和与胶原蛋白的VII-特异性IgG沉积的兔IgG（D），和小鼠补体C3（E） 注入小鼠的免疫病理发现 IF在冰冻切片的病灶周围皮肤真皮表皮交界处， 在体内通过直接检测。在皮损部位表皮下疱和炎症INFiltrate看出者组织学（F）。无沉积的兔IgG（A）中，小鼠，补体C3（B）的，也不是表皮下水疱形成的对照组（C）中看到。
图5。免疫的小鼠血浆中注射胶原蛋白VII-特异性IgG。用ELISA法测定血浆中循环兔抗体。
表1。皮肤水泡病评分表。 点击这里查看大表 。
评分系统：
- 0，无病变;
- 图1中，小于1％的皮肤表面;
- 2，1-5％的皮肤表面;
- 如图3所示，5％至10％的皮肤的su制品表面;
- 4，10％至20％的皮肤表面的影响。
额外提示得分：
- 减肥的身体总重量的5-10％，在连续三天计数作为一个额外的最终得分17点。
- 红斑的耳朵，眼睛周围贴在前爪上的第一个迹象是一个持续的免疫反应，如果不配对，他们不能确定，只是考虑下观察用水泡或脱发。
- 尾巴上的标志是咬或打标记，这样，如果他们从一开始就日益恶化的可能并不一定是由于疾病。仔细考虑天气指望他们！
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Discussion
被动转移到实验动物的自身抗体是一个重要的方法展示他们的致病性，-12。通过这种方法获得的动物模型，除了是自身免疫13的间接证据，允许传出的调查阶段的致病机理。抗体诱导的粒细胞依赖的皮肤起泡性大疱性表皮松解症acquisita（EBA）的被动转移模型被用于解剖组织损伤的机制，在自身免疫性皮肤病。它的出现，作为一个精美的启发性疾病模型研究的根本，远远超出对胶原纤维VII的限制，自身免疫抗体介导的器官特异性自身免疫性疾病，生物学和临床的重要方面。最后，该模型可用于研究基础生物学和病理生理过程，包括基底膜生物学，粒细胞活化的免疫复合物D补体的活化。
虽然有几个实验的设置，包括体外和动物模型，可用于自身免疫性皮肤病EBA 14，是迄今为止最适合学习的粒细胞依赖的炎症途径是被动转移到动物体内自身抗体。在相反的体外模型，其中的粒细胞被添加到先前的皮肤切片培养与自身抗体15，白细胞浸润，在这里是自发由小鼠再现。此外，如果我们选择工作提出对其他生物，如兔和山羊中的抗原特异性抗体，避免有限的病人血清中的可用性问题，我们也有一个更好的机会重现补体活化和粒招聘16。
对于成功的在被动传输模式再现粒细胞依赖的起泡EBA l的，重要的是要能够充分得分疾病的迹象，通过与结壳和脱发的水疱，糜烂开始的红斑和水肿。小鼠的评估是一个过程，需要将以前学过的。本病的得分要执行的是同一个人，整个实验过程中，始终借调的合作者或援助的人。每个实验性疾病的开发和使用一个标准的评分系统是最为重要的。封闭的评分表，让读者了解如何在小鼠皮肤皮肤病的评估。
执行时显示在视频中，自身抗体引起的表皮起泡的模式将极大地促进的进一步解剖粒细胞依赖的炎症所引发的自身抗体，导致组织损伤的途径。它的价值在医学研究的支持，有前途的角度开发和测试新的抗原-Specific T和B细胞的目标抗炎疗法。最后，这将有助于回答基本的生物学和临床必需的自身免疫问题。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者承认，从德意志研究联合会SI-1281/4-1的和BIOSS从弗赖堡大学医学系（CS）的补助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
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