In situ di patch clamp registrazioni sono utilizzate per la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni nel circuito intatto. Nel modello Drosophila genetico cerotto bloccaggio è difficile perché il CNS è piccolo e circondato da una guaina robusta. Questo articolo descrive la procedura per rimuovere i neuroni guaina e pulite per le registrazioni successive patch clamp.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Tempi di generazione brevi e facili tecniche genetiche rendono il moscerino della frutta Drosophila melanogaster un ottimo modello genetico fondamentale nella ricerca neuroscientifica. I canali ionici sono la base di tutti i comportamenti in quanto mediare l'eccitabilità neuronale. Il primo canale ionico tensione gated clonato è stata la tensione di Drosophila gated canale del potassio Shaker 1,2. Verso la comprensione del ruolo dei canali ionici e di eccitabilità della membrana per il funzionamento del sistema nervoso, è utile combinare potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila con registrazioni in situ patch clamp. Per molti anni tali registrazioni sono stati ostacolati dalla piccola dimensione del SNC Drosophila. Inoltre, una guaina robusta fatta di glia e collagene costituivano ostacoli per l'accesso delle patch pipetta neuroni centrali. La rimozione di questa guaina è un presupposto necessario per le registrazioni di patch clamp da ogni neurone del sistema nervoso centrale adulto Drosophila. In anni recentiscienziati sono stati in grado di effettuare in situ registrazioni patch clamp da neuroni nel cervello adulto e 3,4 cordone nervoso ventrale del 5,6 embrionale, larvale 7,8,9,10, e adulti Drosophila 11,12,13,14. Una stabile giga-sigillo è il presupposto indispensabile per una buona patch e dipende contatto pulito della pipetta patch con la membrana cellulare per evitare correnti di perdita. Pertanto, per la cellula intera nelle registrazioni in situ patch clamp da neuroni adulti di Drosophila devono essere puliti a fondo. Nella prima fase, la guaina gangliare deve essere trattata enzimaticamente e rimosso meccanicamente per rendere accessibili le cellule bersaglio. Nella seconda fase, la membrana cellulare deve essere lucidato in modo che nessun strato di materiale glia, collagene o altro possono disturbare giga-sigillo formazione. In questo articolo viene descritto come preparare un neurone identificato centrale nel cordone nervoso ventrale Drosophila, il motoneurone volo 5 (MN5 15), per tutto il c somaticaell di patch clamp. L'identificazione e la visibilità del neurone si ottiene l'espressione mirata di GFP in MN5. Noi non proponiamo di spiegare la tecnica del patch clamp stesso.
Protocollo
La seguente descrizione non è specifico per un motoneurone. Esso può essere utilizzato con qualsiasi neurone. In questo esempio, usiamo il volo motoneuroni 5 (MN5) che innerva i due fibre dorsalmost del dorsolongitudinal muscolare ala depressore (DLM). Per identificare e visualizzare MN5 usiamo il UAS/GAL4 sistema per esprimere GFP nei motoneuroni di volo (e pochi altri neuroni).
1. Dissezione di adulti Drosophila per accedere alla parte dorsale del cordone nervoso ventrale (VNC)
- Sezionare un lato adulto Drosophila dorsale lungo la sua linea mediana dorsale in una capsula rivestita Sylgard Petri (35 mm di diam....
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Discussione
Quando visualizzare le cellule con proteine fluorescenti come la GFP, è importante non sovraesporre la preparazione di troppa luce. Ciò può causare danni foto. Usiamo 100W HBO brevi lampade al mercurio ad arco per l'illuminazione, e si usa anche densità neutra (ND) di 0,8 (filtri ND Chroma 0.3 e 0.5). Per poter valutare la qualità della pulizia buona visibilità è cruciale. Pertanto, filtri ND può essere rimosso per brevi periodi di circa 20 s per più volte.
Quando si applica un po '.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agente / item | Azienda | Numero di catalogo | |
| Proteasi tipo XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil ago per iniezione flessibile | Mondo Strumenti di precisione USA | MF28G-5 | |
| Vetro borosilicato capillari, od 1,5 mm, ID 1,0 mm, nessun filamento | Mondo Strumenti di precisione USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard elastomero Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| Filtro ND set (non montata) | Chroma | 22000b serie | |
| Elettrodi supporto 1-HL-U | MomentoDispositivi lecular | 1-HL-U |
Riferimenti
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y.
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Ristampe e permessi
