Summary
Un metodo di visualizzare e quantificare il 3-dimensionale struttura vena porta mouse o dotto biliare intraepatica è descritto. Questa tecnica resina può anche essere applicata ad altri sistemi duttali o vascolare e permette
Abstract
Di organi, l'architettura corretta delle strutture vascolari e duttale è indispensabile per una corretta funzione fisiologica, e la formazione e il mantenimento di queste strutture è un processo altamente regolato. L'analisi di questi complessi, tre strutture tridimensionali è notevolmente dipendeva sia 2-dimensionale esame in sezione o su studi iniezione tintura. Queste tecniche, tuttavia, non sono in grado di fornire una rappresentazione completa e quantificabile delle strutture duttali o vascolari sono destinati a chiarire. In alternativa, la natura del 3-dimensionale calchi in resina plastica genera un'istantanea permanente del sistema ed è un romanzo e tecnica ampiamente utile per la visualizzazione e la quantificazione tre strutture tridimensionali e reti.
Un vantaggio fondamentale del sistema di colata di resina è la capacità di determinare la intatte e collegate, o comunicare, struttura di un vaso sanguigno o condotto. La struttura vascolare e di ducreti mentali sono essenziali per la funzione degli organi, e questa tecnica ha il potenziale per aiutare studio delle reti vascolari e duttale in diversi modi. Colata di resina può essere utilizzata per analizzare la morfologia normale e l'architettura funzionale di una struttura luminale, identificare cambiamenti morfogenetici sviluppo, e scoprire differenze morfologiche dell'architettura tessuti normali tra stati e malattie. Lavoro precedente ha utilizzato resina colata a studiare, per esempio, difetti architettoniche e funzionali nel sistema biliare intraepatica topo condotto che non si sono riflesse in 2-dimensionale analisi della struttura 1,2, alterazioni vascolare cerebrale di un modello di malattia di Alzheimer mouse 3 , anomalie della vena porta nel portale topi ipertesi e cirrotici 4, passi di sviluppo in maturazione ratto linfatico tra polmoni immaturi e adulti 5, immediati cambiamenti microvascolari nel fegato di ratto, del pancreas e del rene in risposta a al danno chimico6.
Presentiamo qui un metodo di generazione di un 3-dimensionale di resina di una rete vascolare del mouse o duttale specificamente dedicato alla vena porta e dotto biliare intraepatica. Questi calchi possono essere visualizzati tramite compensazione o macerazione del tessuto e possono quindi essere analizzati. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi sistema vascolare o duttale e sarebbe direttamente applicabile a qualsiasi studio indagare lo sviluppo, la funzione, la manutenzione, o lesioni di un 3-dimensionale struttura duttale o vascolare.
Protocol
1. Preparare Cannula
- Scaldare un 1-pollice lungo tratto di PE10 tubi con la punta delle dita e allungare in modo che il tubo diventa sottile.
Nota: la dimensione del recipiente o condotto da incannulata determinerà il grado di stiramento richiesto. La cannula deve essere ben teso per via biliare getta, ma può essere richiesto solo per essere moderatamente allungato per adattarsi all'interno della vena porta più grande. - Tagliare il tubo allungato in diagonale per generare una punta smussata.
- Tagliare il bordo opposto del tubo per creare un segmento 5-6 pollici.
- Inserire un contatore 32, ago ipodermico ½ pollice nel non smussato bordo del tubo.
2. Preparare Siringa con PBS
- Riempire una siringa da 3 ml con PBS.
- Avvitare la siringa l'ago ipodermico con annessa tirata PE10 tubi precedentemente preparato.
- Siringa Flick e spingere lo stantuffo della siringa per assicurare che PBS ha riempito l'ago e il tubo enon vi siano bolle d'aria nella siringa.
- Posizionare la siringa con PBS in una siringa porta-a forma di plastilina. Questo supporto manterrà la siringa ferma mentre il tubo viene inserito nel condotto.
3. Altro Set-up
- Pesare 0,1 g di catalizzatore in un piccolo contenitore, ad esempio, un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
- Tirare 1 resina ml in una siringa da 3 ml.
Nota: quantità relative di resina e catalizzatore può essere regolato per alterare il tempo di indurimento. Diminuendo quantità di catalizzatore può, tuttavia, aumentare gettato ritiro e portare ad un cast meno desiderabile.
Nota: quando si maneggia resina, prendere le dovute precauzioni per evitare il contatto con la resina o l'inalazione dei fumi di resina. Indossare sempre guanti ed eseguire le operazioni che comportano resina in una zona ben ventilata, come una cappa di laboratorio - Tagliare un pezzo di 5,0 sutura di seta di circa 5 centimetri per essere utilizzati come una legatura.
4. Preparare mouse
Nota: questo passaggio può anche essere performed con 4% paraformaldeide invece di PBS. Uso di paraformaldeide al 4% può aumentare l'integrità vascolare e risultato in un cast più precisa, in particolare di piccole strutture vascolari.
5. Incannulare vena portale extraepatica o dotto biliare comune
- Utilizzare pinze curve per passare la legatura chirurgica sutura sotto la vena porta o dotto biliare, circa ¼ di pollice dal fegato.
- Legare la sutura in un nodo sciolto comune. NON stringere il nodo.
- Se si utilizza un sistema aperto, può essere utile per legare e stringere una legatura all'altra estremità del sistema. Se avete aperto la vena comune cardinale per drenare il sangue dalla vena porta, legare una legatura intorno ad esso per aumentare la pressione all'interno della vena porta e impedire la fuoriuscita di resina nella vena epatica centrale.
- Con le forbici a molla per fare un piccolo taglio nella vena porta o dotto biliare, circa ¼ di pollice sotto il nodo di sutura. Questo cut deve penetrare non più di metà del diametro della vena porta o dotto biliare.
- Utilizzando # 5 forcipe, tenere la vena porta o dotto biliare nel sito del taglio e inserire estremità smussata del tubo nel dotto biliare.
- Spingere punta del tubo oltre il pre-legato legatura e verso il fegato.
- Test per la precisione incannulazione iniettando PBS attraverso la cannula e guardare per vedere se entra nella vena porta o dotto biliare.
- Serrare la legatura di tenere la cannula in posizione.
6. Resina della vena porta o dotto biliare intraepatico
- Aggiungi pre-misurata 1 resina ml di pre-misurato 0,1 g di catalizzatore e mescolare accuratamente. Evitare la formazione di bolle d'aria.
- Disegnare resina-catalizzatore miscela nella siringa 3 ml. Rimuovere le bolle d'aria delicatamente sfogliando la siringa ed espellere le bolle.
Nota: per la colata di strutture di piccole dimensioni, può essere utile usare una camera a vuoto per rimuovere le bolle d'aria molto piccole da the resina e migliorare la qualità del cast. Concedere tempo per eseguire questa operazione, è necessario diminuire il catalizzatore / resina rapporto da quella suggerita per rallentare resina polimerizzabile. - Accuratamente sostituire PBS contenente siringa con resina contenente siringa, lasciando l'ago 32 attaccato ad cannula.
- Lentamente e spingere delicatamente resina nella vena porta o dotto biliare finché la resistenza aumenta e il fegato è pieno.
- Utilizzare tampone di cotone bagnato di massaggiare delicatamente fegato e favorire ancor di riempimento.
- Rimuovere cannula dalla struttura e rapidamente serrare la legatura per evitare perdite di resina.
- Lasciare il mouse per disteso a temperatura ambiente per 20 minuti, mentre le cure in resina, quindi rimuovere fegato.
- Procedere sia con compensazione o macerazione del fegato.
7. Fegato trasparente per la visualizzazione in situ
- Fissare il fegato in 4% paraformaldeide notte a 4 ° C, a dondolo.
- Lavare il fegatoin PBS per almeno quattro ore, a dondolo. A questo punto, è possibile separare i lobi del fegato se lo si desidera.
- Disidratare in 50% metanolo e quindi in metanolo 100% per almeno quattro ore ciascuna, dondolo a temperatura ambiente.
- Deselezionare il fegato in una soluzione di alcool benzilico 01:02 e benzil benzoato (BABB) per almeno 24 ore, dondolo. Tempi più lunghi di lavaggio può essere necessaria. Se il fegato non si risolve completamente dopo 2-3 giorni, tornare al 100% di metanolo per 24 ore e ripetere BABB compensazione.
- Fegato Immergere in BABB in un piatto di vetro Petri per l'imaging in situ.
8. Macerare tessuto epatico
- Rimuovere fegato di topo e messo in una provetta da 50 ml con acqua. Attendere 1 ora per la polimerizzazione resina completo. Lobi del fegato separati se lo si desidera.
- Versare l'acqua e passare fegato di una bottiglia di vetro. Immergere nel 15% KOH. Lasciare per una notte a temperatura ambiente. Non rock.
- Versare con cautela fuori KOH e lavare fuso in acqua distillata. Nota: il cast è very fragile e deve essere maneggiato con estrema cura. Evitare di interrompere il cast durante l'aggiunta o la rimozione di liquido dal tubo.
- Quando in resina è pulito, appoggiare delicatamente su un Kimwipe ad asciugare, poi trasferirla in un contenitore da memorizzare.
9. Risultati rappresentativi
Un cast successo della vena porta o dotto biliare mostrerà una rete continua di rami progressivamente minori estendono dal ilo alla periferia fegato.
La figura 1 mostra una vena portale espressi come visualizzato in situ dopo BABB compensazione. Figura 1A mostra il cast del intero lobo epatico sinistro e la forma e le dimensioni del getto. Figura 1B mostra una vista ravvicinata del getto stesso, dimostrando l' penetrazione della resina nelle più piccole rami della vena porta alla periferia fegato.
La figura 2 mostra un cast vena che ha subito KOH mAceration. Figura 2A mostra l'intero lobo sinistro del fegato e figura 2B è un primo piano di piccoli rami periferici.
Questa tecnica è stata applicata con successo al dotto biliare intraepatica e pubblicato utilizzando sia il BABB compensazione e tecniche di macerazione KOH 1,2,7.
Problemi comuni includono incomplete riempie, bolle nella resina, e troppopieno in sistemi o tessuti circostanti. Figura 3 mostra come riconoscere un riempimento incompleto (Figura 3A), bolle (Figura 3A), e un overflow di resina dalla vena porta alla vena centrale (Figura 3B).
Tutte le immagini sono scattate con una Leica MZ 16 stereoscopio FA e QImaging RETIGA fotocamera 4000R.
Figura 1. BABB nulla osta di resina di sinistra della vena porta epatica lobo. Resina A. presenta una struttura gerarchica ramificata che si estende dal ilo alla periferia del fegato. Resina appare di colore giallo all'interno azzurrato lobo epatico. B. Un primo piano mostra che il riempimento resina si estende alle filiali di piccole dimensioni nella periferia fegato. Resina è biancastra con fegato cancellato. Barra di scala = 1 mm.
Figura 2. Tissue-macerata in resina di sinistra della vena porta epatica lobo. Resina A. cast di tutto lobo epatico mostra molti rami di varie dimensioni. B. Close-up mostra piccoli rami in periferia di fegato. Sfumatura comparsa di piccoli rami rappresenta resina di riempimento di spazi sinusoidali e possono o non possono essere visibili su calchi in resina e aumenterà la densità apparente ramo se presente. Resina è di colore bianco. Barra di scala = 1 mm.
Figura 3. Problemi comuni con calchi in resina. A. Un riempimento incompleto della vena portale lobo sinistro è evidente da alcuni o tutti i rami del cast non riescono a estendere alla periferia del fegato. Questo cast visualizza anche le bolle, visibile come rotture nella colata continua (freccia). A causa della vicinanza della vena porta e rami venosi centrali in alcuni luoghi B., la resina vena porta spesso entrare e riempire la vena centrale. Questo può essere riconosciuta quando vi sono due distinti rami ilari (frecce) e due strutture ramificate che hanno modelli diversi e sovrapposizioni. Discriminante tra errori tecnici e veri alterazioni morfologiche può essere fatto in due modi. Primo, la struttura colata deve essere confrontata con la struttura prevista sulla base di 2-dimensionale o di altri metodi. In secondo luogo, è importante effettuare diverse repliche, e quando possibile, quantificare il structure ed eseguire analisi statistica per determinare la riproducibilità e se vi è una alterazione morfologica statisticamente significativa tra e all'interno sperimentali diversi e bracci di controllo.
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Discussion
Abbiamo descritto esempi specifici di come la vena porta e intraepatiche sistemi dotti biliari del fegato può essere fusa, ma questa tecnica può essere applicata a qualsiasi altro sistema duttale o vascolare con lievi modifiche. Il lavoro precedente ha dimostrato la fattibilità di questa tecnica in più specie, tra cui mouse, 1,2,7-9 anatroccolo 10,11, 12,13 coniglio, cane 14, e maiale 15, e in molti organi, tra cui ghiandola nasale 14, cuore 16, 12,13 della vescica, del fegato e 1,2,7,8. Questi calchi possono essere utilizzati per confrontare più sistemi (per esempio, la vena porta e dotto biliare) all'interno del tessuto stesso, la stessa struttura attraverso diversi stadi di sviluppo 5, o l'effetto su una struttura di alterazioni genetiche o ambientali o influenze 1-4 , 6,7. L'ampia diffusione di questa tecnica tra le specie e degli organi rende resina colata uno strumento di grande valore per studying la morfologia delle strutture vascolari e duttale ed ha il potenziale di aumentare notevolmente la nostra conoscenza della normale funzione di queste strutture e come sono condizionate, o come influenzano un organo, in modelli animali di malattia.
L'uso di resina per creare 3-dimensionale calchi fornisce un'istantanea permanente di un sistema duttale o vascolare e ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche simili. In primo luogo, il cast può essere analizzato come uno stand-alone struttura dopo macerazione, che offre un vantaggio rispetto inchiostro di china o iniezioni di inchiostro simili. In secondo luogo, la permanenza della struttura aumenta la facilità di analisi. Ultimo, la capacità della resina Mercox II per sopportare la procedura di compensazione BABB consente una capacità unica di visualizzare una struttura in situ anche all'interno tessuti grandi o dense.
Ci sono diversi tipi di resina disponibile con caratteristiche diverse. Mercox II è stato scelto per questa tecnica per i suoi molti advantages; Mercox II ha una bassa viscosità, permettendo di penetrare piccola vena periferica portale e rami dotto biliare, ha indurimento rapido e completo a temperatura ambiente, essenziale per analizzare il cast stand-alone macerata, ha restringimento minimo quando indurito, e resiste compensazione tessuto BABB. Un altro tipo di resina, Microfil (Flowtech, Carver, MA), è stato utilizzato in diversi studi pubblicati 8,9,15. Comparativamente, Microfil non guarisce completamente a temperatura ambiente ed è raffigurato in maniera ottimale attraverso la compensazione dei tessuti. Microfil getta della vena porta sono stati precedentemente analizzati a 10% fissazione in formalina e di compensazione successiva con salicilato ethanolmethyl 8.
Additivi di resina può fornire ulteriori metodi di visualizzazione colato; aggiunta di coloranti colorati, molecole fluorescenti, o microsfere possono migliorare l'analisi. È necessario tenere conto, tuttavia, per garantire che le molecole di colorante scelti sono sufficientemente piccole da penetrare l'intended struttura vascolare o duttale, che non altera significativamente le proprietà della resina, che sono in grado di resistere sia compensazione tessuto o macerazione, e che siano compatibili con il metodo di analisi desiderata. Scegliendo additivi resina dipende molto dalla specifica applicazione: per esempio, microsfere (Molecular Probes) sono troppo grandi per passare attraverso i sinusoidi epatici, che li rende inadatti per lo studio della normale architettura sinusoidale ma un perfetto strumento per indagare lo sviluppo di shunt porto , che sono abbastanza grandi per accogliere microsfere, in un modello di topo geneticamente modificati 8.
Infine, espressi analisi resina può essere eseguita in calchi sia cancellato o macerato. BABB-azzerato calchi sono utili per misurare la struttura di un sistema in cui riguarda l'organo in cui risiede. KOH-macerate calchi possono essere analizzati in diversi modi. Studi precedenti hanno utilizzato microscopia elettronica a scansione (SEM) per visualizzare le reti del microcircolo e la struttura nave 12,13,17. Lancia può essere quantificato per il numero ramo, diametro, e il volume con l'uso di microcomputed tomografia (microCT) 1,15,18, 19,20.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (NIH) a SSH (R01-DK078640), del Howard Hughes Medical Institute (HHMI) attraverso il HHMI / Vanderbilt Certificate Program University di Medicina Molecolare per TJW (GRDOT56006779), la Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) e la Digestive Disease Research Center Vanderbilt (P30-DK058404) fornendo servizi di base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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