Summary
רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.
Abstract
מחל herpetic עין, קרנית סטרומה herpetic כינה (HSK), היא זיהום שעלול להיות מסנוור של הקרנית שגורמת ליותר מ -300,000 ביקורים קליניים בכל שנה לטיפול. בין 1 ל 2 אחוזים מחולים עם מחלה קלינית חווים אובדן הראייה של הקרנית הנגועה. הרוב המכריע של מקרים אלה הם התוצאה של הפעלה מחדש של זיהום סמוי על ידי הרפס סימפלקס סוג אני וירוס ולא כתוצאה ממחלה חריפה. מעניין, הזיהום החריף הוא המודל המשמש לרוב ללימודי מחלה זו. עם זאת, התחושה הייתה שמודל חוזר של HSK יהיה יותר משקף את מה שמתרחש במהלך מחלה קלינית. את המודלים של בעלי החיים חוזרים לHSK העסיקו שני ארנבות ועכברים. היתרון של ארנבים הוא שהם חווים מחדש מהשהית העדר כל גירוי ידוע. עם זאת, קשה לחקור את התפקיד שהרבה גורמים אימונולוגיים לשחק בHSK החוזר, משום שמודל הארנב אין immunמשאבי ological והגנטיים שיש עכבר. אנחנו בחרנו להשתמש במודל העכבר לHSK חוזר כי יש לו את היתרון של להיות שם משאבים רבים זמינים וגם אנחנו יודעים מתי נתרחש מחדש בגלל מחדש נגרמים עקב חשיפה לקרינת UV-B. עד כה, מודל זה אפשר מעבדות אלה משתמשים בו כדי לקבוע מספר גורמים חיסוניים שחשובים למחלה זו. זה גם אפשר לנו לבחון גם ריפוי ויעילותו.
Protocol
הערת טיפול בבעלי חיים: משככי כאבים אינם משמשים במודל זה כמו שהם אנטי דלקתיים ולכן הייתי פוסלים את המודל.
1. הכנת הווירוס
- לגדול HSV-1 בתאי Vero (80% confluent) באמצעות דילול התחלתי של 0.01 ריבוי של זיהום (בבקבוק T-150, כ 5 x 10 יחידות יוצרות פלאק 5) עבור 3-4 ימים עד שכל תאים מעוגלים למעלה והם משתחררים ממקומם בקלות על ידי להכות את הבקבוק.
- הסר את המדיה לצינורות סטריליים צנטריפוגות וצנטריפוגות ב Sorvall המקרא RT ב 4 ° C ו3500 סל"ד במשך 15 דקות. לאחר הסרת supernatant (ראה 1.3), resuspend גלולה גדולה מכל צינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל בסך הכל תקשורת. Sonicate לדקות 1 בשתי התפרצויות 30 שניות.
- הסרת supernatant והכניס לתוך צינורות 50 מ"ל סטריליים Oak Ridge וצנטריפוגות ב9000 סל"ד, לשעה 1 ב 4 ° C בקמן צנטריפוגה J2-21. זה הוא לייצר גלולה נגיפית קטנה. השלך את supernatant.
- שלב sonicate מ -1.2 שנינותח גלולה מ -1.3 וsonicate שוב למשך 45 שניות. צנטריפוגה בSorvall המקרא RT ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. זה מהווה את מניית וירוס הaliquoted ואוחסן ב -70 ° C.
- וירוס כייל נוגדנים על תאי Vero. אני בדרך כלל צלחת 10 0 ל10 -8 דילול (כל אחת להיות דילול 10-קיפול) 2x מ2 סטי דילול נפרדים. טיטרציה של וירוס מבוצעת על צלחות סטריליות 12-כן.
2. זיהום מאוס
- להזריק כל עכבר עם 0.1 מ"ל של חומר הרדמת משקל cocktail/20 גרם עכבר גוף (קטמין, 60 מ"ג / ק"ג + Xylazine 5 מ"ג / ק"ג שדילול בHBSS). קוקטייל זה משמש כי זה אחד האמצעים הכי הבטוחים להרדמה, כאשר המינונים מתאימים משמשים ואת ההשפעות של תרופה זו הן מאוד קצר.
- כאשר עכברים מורדמים לשרוט את הקרנית של עין ימין עם מחט מד 30 באמצעות מיקרוסקופ לנתח על מנת להבטיח שהקרנית אינה מחוררת.
- כל rece עכברived הזרקת intraperitoneal של 1 מ"ל של נסיוב אדם נקווה (Sigma, Temecula, קליפורניה; תגובתיות אנטי HSV עם מינון אפקטיבי לנטרול נגיף 50% מ1:800) כדי להגן על קרניות מניזק במהלך הזיהום העיקרי.
- מספר העכברים עם או אטבי אוזניים או באוזן אגרוף.
- אחרי כל העכברים מוספרו; באמצעות pipettor μl 20, אנחנו מדביקים כל עין עם 10 6 pfu (5 μl). אנחנו מדביקים רק עין אחת, ובדרך כלל עין הימנית. גם אנחנו שמים 5 μl של HBSS לעין השנייה כדי לשמור אותו הלח בזמן שהם מורדמים. 5 ul הוא מספיק כדי לשמור על לחות של העיניים מאז ההליכים מתבצעים בפחות מ 10 דקות, ואת בעלי החיים במינון עם הרדמה בהתאם. זיהום הוא אשר על ידי ניגוב עכברים 3 ימים לאחר פגיעה עם מוליך כותנת סטרילי שהיה hydrated ב1 מ"ל של תקשורת Vero. אז 100 μl מתווסף לתאי Vero גודלו בצלחות 48-כן. צלחות אלה ניטור יומיומי להשפעות cytopathic (CPE).
3. אקטיבציה של עכברים מהחביון
- עכברים מורדמים לפחות 5 שבועות לאחר הדבקה ראשונית. יש לציין שיש לנו מחדש עכברים עד הזיהום עיקרי הבא שנה אחת ולא נצפו הבדלים משמעותיים בתגובה.
- ברגע שהרדים הם ממוקמים TM20 transilluminator Chromato-Vu, אשר פולט קרינה UV-B באורך גל של 302 ננומטר שיא כאלה שרק עין אחת חשופה לאור UV-B. כל עכבר חשוף לmJ של אור UV-B סנטימטר 250 2.
- אקטיבציה נקבעה על ידי ניגוב עיניים עם מוליך הכותנה סטרילי הממוקם ראשון ב1 מ"ל של תקשורת ביום Vero 0 (לפני החשיפה לקרינת UV-B לשליטה לשופכים ספונטניים) ולאחר מכן בימים 1-7 לאחר קרינת UV-B. החומר הספוגי מוערך כמתואר ב2.5). למטליות שיש להם וירוס מדבק כמות הנגיף גחך על ידי assay פלאק הסטנדרטי באמצעות 12 גם צלחות.
- עכברים מוערכים למחלת עיניים קלינית על ידי משקיף רעול פנים באמצעות מיקרוסקופ לנתח משקף.
- אטימות קרניות הוא דורג בסולם של 0 עד 4, שבו 0 מציין stroma ברור, 1 מציין עננות סטרומה קלות, 2 עולים אטימות מתונות עם תכונות איריס מובחנות, 3 מציינים אטימות צפופות עם אובדן פרטי קשתית מוגדרת פרט שולי תלמידים, ו 4 מציין אטימות מוחלטות ללא נוף אחורי.
- Neovascularization הוא דורג בסולם של 1 עד 8 על ידי חלוקת הקרנית ל 4 רבעים שווים וקביעת היקף כלי דם בכל אחד מהרבעים הללו.
- Blepharitis נמדד באופן הבא: 0, ללא נגעים; 1, עפעף מינימאלי נפיחות, 2, פריקים מתון נפיחות ופריכות עיניים; 3, נפיחות חמורה, נשירת השיער periocular מתון, ונגעים בעור, ו 4, נפיחות חמורות בעיניים עצומות מוקרם, אובדן חמור periocular שיער, ונגעים בעור.
- עדות לדלקת קרום המוח incluטוליפ גב כפוף, שיער פרוע, וליקויים נוירולוגיים ברורים. עכברים מורדמים כשהם מגלים סימנים מובהקים של דלקת קרום המוח.
5. נציג תוצאות
הדגם החוזר אשר תואר לעיל פורסם לראשונה על ידי Shimeld, et al. 1-3. הם בדקו והמעבדה שלנו כבר משתמשת בגרסה שונה של מודל זה לפרסם כתבי יד רבים במהלך שנתי 4-15. המודל המשמש להגדרת התפקיד שציטוקינים מחזות אינטרפרון-γ במחלה החוזרת HSV-1 10. כפי שמוצג באיור 3, עכברים שחסרו IFNγ מחלה גרועה קרנית מוצגת מאשר עכברים פראיים מסוג 14. הוא גם שמש בהצלחה להגדיר את הערך הטיפולי של כמה חיסון שונה בונה 6,10,11. שים לב כי במקרה אחד החיסון נבדק עבד היטב מונע אבל לא להוכיח להיות טיפולי יעיל 6. עם זאת,כאשר חיסון נגיפי שכפול פסול נבדק, זה לא היה יעיל רק מונע, אבל היה גם מאוד יעיל טיפולי 10,11, ראה איור 5 בהתייחסות 10. לאחרונה יש לנו להשתמש במודל זה כדי לקבוע אם הבדלים בין מינים היו להבחין בעכברים שעברו HSK החוזר. כאיור 1 מדגים, C57BL / 6 עכברי זכרים להציג אטימות באופן משמעותי פחות מאשר לעשות קרנית C57BL נקבה / 6 עכברים. כמו כן, כאשר neovascularization קרנית הוערך, עכברי זכרים הפגינו צמיחת כולים משמעותיים פחות חדשה בקרנית מאשר נקבות עכברים (איור 2). אנו בודקים כעת אם זה פנוטיפ הוא זן ספציפי על ידי ביצוע ניתוח דומה בזנים אחרים של עכברים. אנו גם לקבוע אם ההבדל הוא עקב המחסור בטסטוסטרון או הנוכחות של אסטרוגן.
איור 1. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב לאטימות קרניות במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n = 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-35 (P = 0.001-0.01).
איור 2. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב במשך neovascularization קרנית במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n= 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-28 (P = 0.001-0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדגם החוזר של קרנית סטרומה herpetic (HSK) המתואר כאן מאפשר לחוקר ללמוד HSK האנושי במודל שהוא מתאים יותר למה שהוא ציין במהלך מחלה האנושית. לכן, העוצמות של המודל הן כי מחלה מתרחשת בהקשר של מערכת חיסון שיש כבר על ידי גירוי במחלה ראשונית. מאז העכברים האלה כבר יש תגובה חיסונית לHSV-1, את הגורמים שהפעלה מחדש של תגובה חיסונית שעשויים שונים מאלה שיצרו אותה במקור. לכן, התערבות טיפולית כדי למנוע HSK הראשוני לא תמיד מובילה לשיפור של HSK החוזר, אשר יש לנו שמוצגות בפרסומים שונים בעת הערכה הראשונית הבדלים בין HSK והחוזר 6,8,10-13,15. כפי שצוין בעבר, זה במיוחד כך כאשר פיתוח חיסונים למניעת HSK האנושי. רוב החיסונים יהיו למנוע ההתפתחות של HSK הראשוני, אבל מעטים מאוד הוכחו כיעילים בהפחתת recurrent HSK 6,10,11.
את החולשות של מודל זה הן שזה לוקח הרבה יותר זמן לביצוע ניסוי. יש כמעט 6 שבועות תקופה שלאחר הדבקה ראשונית שבמהלכו העכברים נדבקים סמויים והסרום האנושי מנוהל עובר מטבוליזם. יתר על כן, לא כל העכברים שנגועים סמוי יזילו וירוס לזיהוי לשכבת דמעות של העין הנגועה. זה לא אומר שהם לא הפעילו מחדש, רק שאנחנו לא יכולים לזהותם מחדש על ידי וירוס culturing. יש סיכוי גבוה מאוד שרוב, אם לא כל העכברים יאכלו להפעיל מחדש אלא שהם אינם מייצרים כמות מספקת של נגיף כדי להתגלות על ידי assay פלאק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'יי Pepose עזר ללמד את המודל אלינו. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות EY11885 מענקים (PMS), EY21247 (PMS) ומענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון למחלקת עיניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
