生化学的に定義された大型単層小胞（LUVs）は、BCL-2ファミリーの相互作用を解析するための便利なモデルシステムであり、アポトーシスのミトコンドリア経路の理解を深める上で直接的な有用性を持ちます。本稿では、LUVsの作製方法に加え、LUVの透過性を調べるための標準的なBCL-2ファミリータンパク質の組み合わせおよびコントロールについて提示します。
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この記事について
サマリー
要約
BCL-2（B細胞CLL/リンパ腫）ファミリーは約20種類のタンパク質で構成されており、これらが協調して細胞の生存維持またはアポトーシスの誘導を行います1。細胞ストレス（e.g., DNA損傷）が生じると、プロアポトーシスBCL-2ファミリーエフェクターであるBAK（BCL-2 antagonistic killer 1）および/またはBAX（BCL-2 associated X protein）が活性化し、ミトコンドリア外膜透過性亢進（MOMP）と呼ばれるプロセスを通じてミトコンドリア外膜（OMM）の完全性を損なわせます1。MOMPが起こると、プロアポトーシスタンパク質（e.g., シトクロムc）が細胞質へ放出され、カスパーゼの活性化を促進し、速やかにアポトーシスが進行します2。
BAK/BAXがMOMPを誘導するためには、BID（BH3-interacting domain agonist）などの、BCL-2ファミリーの別のプロアポトーシスサブセットであるBCL-2ホモロジードメイン3（BH3）オンリータンパク質との一過的な相互作用が必要です3-6。抗アポトーシスBCL-2ファミリータンパク質（例：BCL-2 related gene, long isoformであるBCL-xL、myeloid cell leukemia 1であるMCL-1）は、BAK/BAXと、BAK/BAXを直接活性化できるBH3オンリータンパク質との相互作用を厳密に制御することで、細胞の生存を調節しています7,8。さらに、抗アポトーシスBCL-2タンパク質の利用可能性は、BAD（BCL-2 antagonist of cell death）やPUMA（p53 upregulated modulator of apoptosis）などのセンシタイザー/脱抑制BH3オンリータンパク質によっても決定され、これらは抗アポトーシスメンバーに結合してその機能を抑制します7,9。抗アポトーシスBCL-2レパートリーの大部分はOMMに局在しているため、生存を維持するかMOMPを誘導するかという細胞の決定は、この膜における複数のBCL-2ファミリー間の相互作用によって決定されます。
大型単層小胞（LUVs）は、BCL-2ファミリーの相互作用と膜透過性の関係を探索するための生化学的モデルである10。LUVsは、溶媒抽出したXenopusミトコンドリアの脂質組成研究で特定された比率（46.5% phosphatidylcholine、28.5% phosphatidylethanoloamine、9% phosphatidylinositol、9% phosphatidylserine、および7% cardiolipin）で構成される定義済みの脂質で形成されている10。タンパク質および脂質成分が完全に定義されており制御可能であるため、これはBCL-2ファミリーの機能を直接探索するのに便利なモデルシステムであり、これは初代ミトコンドリアでは必ずしも達成できない。OMM全体でcardiolipinが通常これほど高くはないものの、このモデルはBCL-2ファミリーの機能を促進するようにOMMを忠実に模倣している。さらに、上記プロトコルの最近の改変により、ポリアニオン性色素（ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid）とカチオン性消光剤（DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide）を含むLUVsに基づいた、タンパク質相互作用の速度論的解析および膜透過性のリアルタイム測定が可能になった11。LUVsが透過すると、ANTSとDPXが拡散して離れ、蛍光の増加が検出される。ここでは、ANTS/DPXを含むLUVsを用いた、一般的に使用される組換えBCL-2ファミリータンパク質の組み合わせおよびコントロールについて説明する。
プロトコル
1. 脂質の混合と脂質膜の形成
- 照明を最小限に抑えたドラフトチャンバー内で、クロロホルムで洗浄したHamiltonガス密閉ガラスシリンジを用いて、クロロホルム溶解脂質を1.5 mlの褐色ガラスバイアルにまとめます。これにより、約4 mgの脂質が得られます（図 1A）。
- Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- クロロホルムを除去するため、バイアル内に不活性ガス（例：窒素またはアルゴン）の緩やかな気流を当てます。通常2〜3時間で乾燥し、バイアルの底面と側面に脂質膜が確認できるようになります（図 1A）。
2. リポソーム溶液の調製
- 1.7 mlマイクロ遠心チューブに、LUVバッファー（0.2 mM....
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ディスカッション
記述されたLUVの作製法は、OMMに類似した生化学的に定義された膜環境において、さまざまなBCL-2ファミリータンパク質、ペプチド、および関連試薬の機能を迅速かつ効率的に試験することを可能にします。LUVの透過性を決定するためにエンドポイント値を用いる場合、複数のプレートを準備することで、1日で数百もの条件を分析することができます。これらのアッセイにおける制限要因は、リコンビナントタンパク質の品質と量になる傾向があるため、タンパク質の精製に十分な時間とリソースを割くことが、再現性のあるLUVアッセイ結果を得る鍵となります。
我々の経験では、LUVを4 °Cの暗所で保存した場合、通常は最大2週間までBAXおよびBIDに反応します。しかし、組換えBCL-2タンパク質はより不安定であり、凍結融解を繰り返すと活性が著しく変化しやすくなります。タンパク質ストックは可能な限り高濃度で、小分注して-80°Cで保存し、使用直前に希釈することを推奨します。そうすることで、タンパク質の効率が大幅に向上し、結果のばらつきを抑えることができます。気泡があるとプレートの読み取り値に誤差が生じるため、アッセ.......
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開示事項
利益相反はありません。
謝辞
Chipuk研究室のすべてのメンバーに、同僚としての協力と支援に対する感謝の意を表します。また、本研究の実験的基盤を構築したTomomi Kuwana氏とDonald Newmeyer氏に感謝いたします。本研究は、NIH CA157740（J.E.C.への助成）およびNIH P20AA017067（J.E.C.への助成）のパイロットプロジェクトによる支援を受けました。また、本研究の一部は、March of Dimes財団の研究助成金 5-FY11-74（J.E.C.への助成）によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-ホスファチジルコリン（鶏卵） "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-ホスファチジルイノシトール（ウシ肝臓） "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-ホスファチジルセリン（ブタ脳） "PS" | Avanti | 8400320 | |
| カルジオリピン（ウシ心臓 - ナトリウム塩） "CL" | Avanti | 840012C | |
| ミニエクストルーダーセット | Avanti | 610023 | |
| PCメンブレン 0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar ブラック 96ウェルプレート | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| Caspase-8切断済みヒトBID | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| ヒト BCL-xL（C末端除去） | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3ドメインペプチド | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー | BioTek | None |
参考文献
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E.
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