Summary
Zebrafisk representerar en kraftfull ryggradsdjur modell som har använts i sin helhet för metaboliska studier. Här beskriver vi ett snabbt sätt att mäta
Abstract
En växande mål inom ämnesomsättningen är att bestämma hur genetiken på olika aspekter av mitokondriell funktion. Förstå dessa relationer kommer att bidra till att förstå den bakomliggande etiologin för en rad sjukdomar kopplade till mitokondriell dysfunktion, såsom diabetes och fetma. Senaste framstegen inom instrumentering, har möjliggjort kontroll av distinkta parametrar för mitokondriell funktion i cellinjer eller explantat vävnad. Här presenterar vi en metod för en snabb och känslig analys av mitokondrie funktionsparametrar in vivo under zebrafisk embryonal utveckling med Sjöhäst biovetenskap XF 24 extracellulära flöde analysatorn. Detta protokoll använder Islet Capture mikroplattor där en enda embryo placeras i varje brunn, så mätning av bioenergetik, inklusive: (i) basal respiration, (ii) basal mitokondrie andning (iii) mitokondriell andning på grund av ATP-omsättning, (iv) mitokondriell okopplade andning eller prOton läcka och (iv) maximal andning. Använda denna metod embryonala parametrar zebrafisk andning kan jämföras mellan vildtyp och genetiskt förändrade embryon (mutant, gen överuttryck eller genen ÖVERVÄLDIGANDE) eller de manipulerade farmakologiskt. Det förväntas att spridningen av detta protokoll kommer att ge forskarna nya verktyg för att analysera den genetiska grunden för metabola sjukdomar in vivo i denna relevanta ryggradsdjur modell.
Protocol
Del 1: kemisk behandling av zebrafisk embryon
- Samla zebrafisk embryon efter befruktningen. Inkubera vid 28,5 ° C i E3-medium i 100 x 15 mm petriskålar Anm:. För in situ-hybridisering eller olja-Röd-O-färgning, är 1-fenyl-2-tiourea (PTU) vid en slutlig koncentration av 0,2 mM till inhiberar pigmentbildning, 1 men är inte nödvändigt för Seahorse analys.
- För farmakologiska studier, lägger den nödvändiga kemikalie i en lämplig slutlig koncentration att utveckla zebrafisk embryon runt 26 timmar efter befruktning (HPF) med en lämplig vehikel enbart kontroll Anmärkning:. För ljuskänsliga farmakologiska hämmare, kan embryon tillåtas att utvecklas i den mörka före analysen.
Del 2: Live metabola profilen Använda Seahorse XF 24 Analyser
- Före varje körning, Sjöhäst XF 24 Analyser patron som rymmer O 2 och H
- Beredning av 24-brunnars XF 24 holme plattan. Följande experimentella sekvens användes:
- Eftersom syreförbrukning är känslig för temperatursvängningar, är fyra brunnar används för att kontrollera för eventuella temperaturfluktuationer över plattan. Dessa brunnar innehåller inte embryon, men fylls med 700 | il av E3-medium (Figur 2A).
- De återstående 20 brunnarna (se del 2,2) fylls med 700 | il av E3-medium och ett embryo vardera (figur 2B).
- För varje experiment är 10 embryon behandlade med vehikel enbart (kontroll) och 10 behandlades med kemisk inhibitor (behandlad). Kontroll och behandlade embryon varvas (t.ex. väl A2: kontroll embryo, väl A3: behandlad embryo: väl A4: kontroll embryo, väl A5 behandlad embryo, etc).
- En ö fånga skärmen läggs ovanpå. varje brunn för att säkerställa att provet finns kvar i mätkammaren hela analysen (Figur 2B) Obs! kemiskt behandlade embryon kvar hos sin ursprungliga kemisk lösning under hela förfarandet, utan att behöva tvätta bort den kemiska före kör Sjöhäst analysatorn programmet.
- När färdig, är plattan laddas i Sjöhäst Analyzer och analysen startas.
- Analys av prover. Två olika analyser rutinmässigt.
- Basal andning / Max andning programmet (längd ca. 90 minuter). Förändringar i basala andning stödja metabolisk dysfunktion, medan maximal andning är ett mått på den totala energiproduktionen kapacitet och förändringar i denna parameter associerad med ett antal både patologiska och fysiologiska tillstånd. Den outnyttjade respiratoriska kapacitet eller förmåga för att ytterligare öka ATP-produktion, beräknas ocksåfrån detta test genom subtraktion av basal från maximal andning. Tre upprepningar av varje blandning (2 min) / vänta (1 min) / mätning (2 min) cykel utförs för att först etablera basala andning. Vid slutet av den tredje cykeln en slutlig koncentration av 2,5 pM FCCP (mitokondriell protonophore / uncoupler) till varje brunn tillåta mätning av maximal andning. Mätcykeln upprepas därefter 5 till 8 gånger (figur 3).
- ATP omsättning / Proton läcka programmet (längd ca. 60 minuter). Andning grund ATP omsättningen utgör den huvudsakliga funktionen av mitokondrier i form av ATP-produktion, medan andning på grund av proton läcka, eller okopplade andning, är oupplösligt förbunden med andra parametrar i mitokondriell funktion, inklusive basala andning och reaktiva syreradikaler bildas. Andning grund ATP omsättning representeras av skillnaden i andningen efter tillsats av 25 | iM oligomycin (en hämmare av ATP-syntas) jämfört med basala andning. Okopplade andning eller andning på grund av proton läcka, bestäms genom att beräkna skillnaden mellan oligomycin-medierad andning och respiration efter tillsats av 25 M rotenon (en komplex I-hämmare). Mätcyklerna upprepas 8 gånger efter tillsats av varje mitokondriell hämmare.
- Beredning av 24-brunnars XF 24 holme plattan. Följande experimentella sekvens användes:
Vid slutet av försöken, medelvärden för 10 kontroll och 10 kemiskt behandlade embryon beräknas.
Del 3: Olje-Red-O färgning
- Embryon vid 50 HPF är dechorionated med fin pincett och fixeras i 4% PFA över natten vid 4 ° C.
- Olja-Röd-O-färgning utförs såsom tidigare beskrivits 2 (se figur 4).
Representative Results
Vi är intresserade av att förstå den roll gener på metabolism, särskilt andningsfrekvens och lipidmetabolism. Därför, behandlade vi vild typ embryon zebrafisk från 26 HPF framåt med en specifik farmakologisk inhibitor av enzym som kodas av en av dessa gener. Vid 50 HPF var hälften av fordonet och inhibitorn-behandlade embryon analyserades med användning av Sjöhäst för mitokondriefunktion, medan den återstående hälften fixerades i 4% PFA natten vid 4 ° C och därefter färgades för lipid avsättning med olja-röd-O. Behandling med den specifika enzymhämmare ledde en ~ 2-faldig ökning i basal andning (figur 4A), som var förknippad med en ökning i lipid avsättning särskilt i telencefalon och under öron vesikel (figur 4B, C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Schematisk representation av kemisk behandling av zebrafisk embryon. Vildtyp, genetiskt manipulerade eller farmakologiskt behandlad zebrafisk embryon bakgrund.
Figur 2. XF24 holme platta inrättas. (A) Fyra brunnar innehåller embryonal medel endast som temperaturreglering (markerad med ett X) och de andra innehåller ett embryo / brunn. (B) Närbild på en väl (C6) visar en 50 HPF vildtyp embryo som behandlats med vehikel (DMSO) som omfattas av en ö fånga skärmen (pilspets).
Figur 3. Respiratjon parametrar för vildtyp 50 HPF zebrafisk embryon. (A) för varje mätning, är medelvärdet av de 20 individuella embryon presenteras. Basal andning (medel: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), maximal andning (medelvärde: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), Extra respiratorisk kapacitet (Mean: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) För varje mätning är medelvärdet av de 20 individuella resultat presenteras. Basal mitokondriell respiration, mitokondriell andning på grund av ATP-omsättning, mitokondrie okopplad andning och icke-mitokondriell andning. MT: mitokondriell, SRC: Extra lungkapaciteten, SD: Standardavvikelse, SEM: standardfel Mean. Resultaten presenteras i pmol O 2 konsumeras / min / embryo. Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Representativa resultat av kemisk exponering på basal andning och lipid deposition. (A, B) 50 HPF embryo färgas med olja-röd O i sidovy. Embryot inkuberades med den selektiva inhibitorn (B) visar mer Olja-Röd-O-färgning i telencefalon (pilspets) och under den öron vesikel (pil) jämfört med en vehikelbehandlad kontroll embryo. (C) Basal andning visar en ~ 2-faldig ökning av kemiskt behandlade embryon (n = 10 embryon per grupp). Resultat presenteras i pmol O 2 / minut / embryo.
Discussion
Zebrafisk är en väletablerad genetisk modell för både framåt (ENU mutagenes) och bakåt (Tilling, zink finger nukleas riktade knock-out, morfolino ÖVERVÄLDIGANDE) genetiska metoder 3,4, medan genfunktion i zebrafisk embryon kan också lätt blockeras eller aktiveras användning av selektiva farmakologiska föreningar specifika för de kodade produkterna. På grund av deras externa utveckling och liten storlek, zebrafisk embryon är särskilt lämpliga för metabolisk analys. Emellertid har robust mätning av metabola profil och mitokondriefunktion in vivo i zebrafisk embryon inte uppnåtts, med endast en preliminär beskrivning rapporterade 5. Seahorse analys utformades ursprungligen för cellbaserade metaboliska studier och har visat sig ge exakta och tillförlitliga resultat 6. Tillämpningen av denna nya metod för att zebrafisk embryon är betydande och sannolikt öka den bredare användningen av denna modell för metaboliska studier.
I denna studie visar vi mätningar av en rad andning parametrar i zebrafisk embryon med hjälp av Seahorse Analyzer, inklusive basala andning, maximal andning, extra respiratorisk kapacitet, ATP omsättning och proton läckage. Vi tillhandahåller också ett exempel på hur sådana mätningar kan korreleras med andra fysiologiska parametrar, i detta fall lipidackumulering, och av användningen av farmakologiska inhibitorer i detta analyssystem. Kombinerat med användningen av genetiskt förändrade embryon, ger detta en kraftfull experimentell plattform för att förstå faktorer som påverkar ämnesomsättningen.
Det finns en mängd olika tillämpningar för denna nya metod, med mitokondriell dysfunktion är inblandad i många humana sjukdomar, såsom diabetes mellitus 7, fetma 8, multipel skleros 9, Parkinsons sjukdom 10, Alzheimers sjukdom 11 och någon typ av cancer 12. Viktigt our arbetet utförs in vivo, där alla miljöpåverkan - såsom cytokiner, utvecklingsrelaterade tillväxt osv - är aktiva, vilket ger en fysiologiskt relevant utsikt in vivo andning och metabolisk profil. Som kemiska skärmar är också rutinmässigt utförs i vildtyp och muterade bakgrund embryon zebrafisk (figur 1), läkemedel roman som påverkar andning, mitokondrier funktion eller ämnesomsättning lätt kunde identifieras med hjälp av Seahorse analysatorn. De resultat som erhållits med hjälp av Seahorse analysatorn kan användas tillsammans med andra analyser för att ge ytterligare information. Detta kan inkludera fysiologisk analys, såsom olja-Röd färgning eller molekylär analys, såsom in situ hybridisering för specifika fettceller markörer såsom cebpα, PPARa, PPARy, FAS etc.
Det finns fortfarande vissa begränsningar för denna metod. Även om vi och andra skulle kunna använda oligomycin till MEAure ATP-produktion och proton läcka på unga embryon 5 (se figur 3), i embryon äldre än 60 HPF oligomycin behandling är ineffektiv. Vi tror att i äldre embryon oligomycin inte kan diffundera lika lätt än hos yngre embryon gör resultaten omöjliga att tolka. Eftersom Oligomycin resultaten är obligatoriska för bestämning av andning på grund av ATP omsättning och okopplade andning, undersöker vi för närvarande högre koncentrationer av oligomycin för äldre embryon. Men antimycin A behandlingar förblir effektiva längre, med andra mätningar, såsom basal andning, maximal andning och reservdelar respiratorisk kapacitet kan utföras i äldre zebrafisk embryon, upp till 68 HPF (visas ej).
En annan begränsning i att använda aktuella inställningar Sjöhäst Analyzer är det fysiska utrymmet inom varje ö fånga platta väl, så att de lämpar sig bara för zebrafisk embryon och unga larver. Därför, utför Metabolic studier om kost-inducerad fetma i vuxen fisk, till exempel, är ännu inte tekniskt möjligt. Dock kan denna studie också skynda på utvecklingen av plattor som är särskilt utformade för ung eller vuxen fisk, vilket utvidga analyserna möjligt.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de anställda i Deakin University Zebrafish resurs för att ge utmärkt pågående djurhållning vård. YG stöds av en Alfred Deakin postdoktoral forskning Fellowship och en central forskningsbidrag från Deakin University. SLM stöds av en NHMRC karriärutveckling Fellowship. ACW stöds av en NHMRC Aktivera Grant. Alla författare stöds av Molecular & medicinsk forskning Strategisk forskning Centre vid Deakin University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
