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Summary
这种新方法允许同时细胞内记录一个单一的成年小鼠运动神经元和其肌肉纤维所产生的力的测量。合并后的调查是在正常和转基因动物的运动单位的电气和机械性能的神经肌肉系统的研究的一大突破。
Abstract
脊髓运动神经元长期以来一直是良好的模型系统的研究神经功能，因为它是一种中枢神经系统的神经元与独特的性能（1）因此，具有易于识别目标的（肌纤维）和具有非常著名的功能（来控制肌肉收缩），（2）的收敛许多脊髓和下行网络的目标，故名“最后共同通路”;（3）有一个大的胞体，这使得它可以穿透它们用锋利的内电极。此外，当在体内研究，这是能够同时记录的运动神经元的电活动的和由他们的肌肉目标开发的力。因此， 在体内的运动神经元进行细胞内记录将实验者的研究中的独特地位，在同一时间，所有的隔间“机动装置”（名字的运动神经元，其轴突，和它支配的肌纤维1）：撞击的运动神经元的输入，运动神经元的电生理特性，以及这些特性的影响的运动神经元的生理功能， 即其运动单位所产生的力。然而，这种方法是非常具有挑战性的，因为该制剂不能瘫痪，从而减少细胞内记录的机械稳定性。因此，这种实验只被实现在猫和大鼠。然而，这项研究对脊髓运动系统可以使一个强大的飞跃，如果有可能进行类似的实验，在正常和转基因小鼠。
由于技术上的原因，大多是在小鼠的脊髓网络的研究仅限于新生儿在体外的准备工作，是不成熟的运动神经元和脊髓的网络，运动神经元分开，他们的目标，并研究时，莫片toneurons分离大部分来自其输入。直到最近，只有几组2-4体内的运动神经元细胞内记录，包括我们的团队出版了一本新的准备，使我们能够获得非常稳定的运动神经元在成年小鼠体内的录音5,6。然而，这些录音瘫痪的动物， 即没有可以记录这些运动神经元的输出力。在这里，我们提出了一个延伸，这种原始的准备中，我们能够获得的运动神经元的电生理特性和开发他们的运动单位的力量的同时录制。这是一个重要的成就，因为它使我们能够识别不同类型的运动神经元的基础上的力的分布，从而揭示它们的功能。再加上遗传模型干扰脊髓节段电路7-9，或reproducting人disea本身10,11，我们希望这是一个必不可少的工具，为研究脊髓运动系统的技术。
Protocol
1。第一步
麻醉前用药：麻醉诱导前10-15分钟，注射阿托品（0.20毫克/千克）和皮下methylprenidsolone（0.05毫克），以防止唾液分泌和水肿，分别。
2。第二步
诱导麻醉：注入戊巴比妥钠（70毫克/千克）或它们的混合物的氯胺酮/甲苯噻嗪（100毫克/千克和10毫克/公斤，分别）腹膜内。让鼠标可以得到下，直到没有脚趾掐反射。如果麻醉似乎过轻，补充的剂量的1/4。
3。第三步
*注：这个手术是一个终端程序。
当已达到手术的麻醉，转让的鼠标上提出的温暖的被窝里，在俯卧位。
- 提供纯净的O 2在100毫升/分钟绕流口罩盖住口鼻部的鼠标。
- 剃须右后肢。
- 鼠标翻转至仰卧位，但要注意离开氧气面罩。
4。第四步
代替环绕四肢和固定在工作表面的四个角用缝线固定鼠标。
5。第五步
将温度探头监控鼠标的核心温度。调整加热毯/灯功率保持核心温度在36°C和38°C之间
6。气管切开术和人工通气
- 使用钝头剪刀，作一个切口，气管，双方拉扯皮肤。
- 使用钝钳，撕开的唾液腺，使两个薄肌（胸骨舌骨），气管暴露。
- 使用钝钳，分开的两个MUSCLES沿其内侧分离，揭示了气管。
- 使用杜蒙7钳，将两个长度为4.0丝线缝合气管。
- 在气管中的两个软骨环之间做一个横向切割，但小心不要完全节的气管。
- 下来的气管，插入气管导管的插入口的两侧，然后将其固定绑在它的缝合线。气管导管连接到鼠标换气装置（SAR-830/AP，CWE公司）和一个的的二氧化碳波形（μcapstar，CWE公司）。呼吸机相连，通过合规袋，纯O 2的来源。调整的参数呼吸机（呼吸频率100〜150 BPM，呼气末体积170-310微升），使鼠标不反对的人工通气和呼气末二氧化碳分压是稳定的4％和5％之间。
7。静脉注射管的放置
- 使用钝性分离，暴露在颈一侧上的颈静脉。在这个层面上，颈内静脉分裂成两个主干，前部和后部的面部静脉。
- 做两次，一组为这些树干下面的步骤：
- 通过使用，杜蒙4或5镊子，仔细分离静脉及其周围的结膜组织。
- 经静脉使用杜蒙7钳，将两个长度为6.0丝线。尽可能地将它们分开沿长度的静脉。
- 放置一个小的血管夹的基端侧的静脉（最接近心脏侧），和配合的前端侧的静脉。
- 使用非常精细虹膜剪，做一个小横切口静脉，特别注意不要第静脉完全。
- 预灌封1FR的导管（premicath，Vygon）插入在所述开口中，最多船只剪辑。
- 保持静脉导管在杜蒙4镊子，小心地取出血管夹，然后按下的导管几个铁道部Ë毫米到静脉。
- 通过把它与插入两侧的两个缝线固定导管。
- 一个导管的是，连接到注射器或注射器泵注入补充剂量的麻醉剂在必要时（通常每10-30分钟）。 IV剂量为6毫克/公斤的戊巴比妥钠或1250 40微克/公斤/分钟的氯胺酮/甲苯噻嗪12。其他导管连接到注射泵，一个缓慢静脉输注（50微升/小时）含有的NaHCO 3（1％）和plasmion（14％）的4％葡萄糖溶液。
8。颈部皮肤针和缝线关闭，并返回鼠标俯卧位
9。后肢肌肉和神经的解剖
- 用剪刀，做一个切口从顶部的大腿跟腱。分开皮肤下面的肌肉，注意不要损伤血管。烧灼根据需要。
- 仔细解剖股二头肌。烧灼/的结扎的需要，以防止出血。股二头肌可以完全删除，或简单地倾斜，，暴露坐骨神经和小腿三头肌。
- 解剖出腓肠神经。
- 使用8/0丝线，配合腓总神经远端部分，并切结远端。解剖神经的方式，尽量靠近臀部尽可能。
- 确定胫神经，腓总神经和腓肠神经之间。在不同的胫骨神经分支，从树枝上，去更深（以下简称为胫神经）支配的小腿三头肌的分支机构。
- 8/0丝线线，绑在一起，同时保持完整的分支支配的小腿三头肌，胫骨神经的分支。切远端胫骨神经结和解剖神经尽可能。
- 用生理盐水，以防止熏陶使干燥而进行的下一个步骤，用纱布覆盖整个后肢。
10。椎板切除术
- 用剪刀沿骨干，做一个切口。分开皮肤下面的肌肉。
- 车型的椎骨分开皮下肌肉的每一侧上的两个切口。然后切成每个腱的肌肉附着在侧的每一侧上的椎骨。
- 使用钝钳和罚款刮匙，除去剩余的肌肉上的背侧的椎骨周围的棘突，清楚地识别每个单独的椎骨。
- 确定椎骨T13和L1。 T13是最后的脊椎肋骨附加。脊柱瓦特生病被固定使用坎宁安脊髓椎夹（Stoelting公司）。将脊髓夹具T13和L1的每一侧上。要小心，不要压迫脊髓，但在纵向轴线放一点点的紧张。检查脊柱固定好，用钳子轻轻按下。
- 使用细咬骨钳，取出脊髓进程，然后薄层T13和L1，从而暴露脊髓。
- 覆盖暴露的脊髓与少量的熏陶用生理盐水，以防止干燥的棉布或spongel。
- 将一个定制的塑料浴缸的背面上，周围的脊髓。在使用4/0丝线固定浴。确保浴防水密封KWIK-CAST密封胶（WPI）。
- KWIK-主演干燥后，除去覆盖脊髓的棉花，填充矿物油浴。
- 杜蒙5钳子和非常精细虹膜剪，轻轻一拉硬脊膜入ŕ周围的脊髓，并尽可能在两个方向打开。折叠在每边的脊髓硬膜。
- 放下鼠标躺在上，以便保持它暂停椎钳位凸起平台。
- 请使用另一个椎夹具夹紧骶骨部棘突的支持后区的动物。
- 第三个钳位二极管是用来固定右后肢和踝关节，在以90°角在膝盖弯曲。
11。跟腱解剖
- 在90℃在膝盖和脚踝处的弯曲，将肢体，取出纱布覆盖后肢区域，并解剖无周围组织的跟腱。解剖尽可能多尽可能小腿三头肌，以及从周围组织。
- 切靠近跟骨跖肌肌腱，然后剪了一次完全删除肌腱。
- 使用一个螺纹针，通过第6/0丝线连接Ë跟腱和周围的肌腱，使三结。
- 将力传感器结，切断远端的肌腱，将其连接到力传感器使用的丝线。
- 将两根不锈钢线下筋膜的小腿三头肌。这些导线被连接到细胞外的AC放大器肌电记录。
- 两个双极型钩电极，将腓总神经和胫神经。
- 将小腿三头肌神经的钩电极的阴极上，与阳极接触附近的肌肉。
- 将刺激电极隔离病房。
- 放置球的脊髓背表面电极，连接到外的AC放大器记录脊髓背潜力的。放置一个Ag / AgCl参考电极接触的背面的肌肉。
12。第十二步
刺激小腿三头肌神经使用一个50微秒的方波脉冲的强度的增加在低频率（<1赫兹），直至观察到最大抽搐振幅。慢慢地移动的力换能器拉伸的肌肉，同时监测的抽搐反应的，直到抽搐振幅达到最大振幅。
13。运动神经元细胞内记录
从这个角度上，标准的电生理技术用于制备细胞内的电极，穿透脊髓神经元，将其识别为一个运动神经元。
- 一个玻璃微拉来了〜1微米提示，用吸管拆卸器（P-97微管牵引机，萨特仪器）。填充电极的KCl的3M溶液（电阻电极10-20MΩ）。
- 使用微定位器，驱动微吸管，连接到脊髓内的放大器（Axoclamp 2B，Axon Instruments公司）。监控由电子刺激引起的局部场电位ACH神经定位电机池的小腿三头肌。
- 监测的微电极的电阻的同时，小心地接近推定的运动神经元。当推压的膜，电阻增加。可以使用的“嗡嗡”功能的细胞内放大器的某个时候将促进渗透。
14。安乐死过程
在实验结束时，由过量的戊巴比妥钠（210毫克/千克IV）中，然后用断头动物安乐死。
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Representative Results
图1显示了如何识别渗透后小腿三头肌组运动神经元。在低的刺激强度，仅可观察到单突触EPSP（ 图1A）。在较高的强度，在EPSP可能会对大到足以触发“顺”尖峰（ 图1B）。在刺激强度更高，出现一个全或无的逆向秒杀，用更短的等待时间比单突触EPSP（ 图1C）。如果有足够的电流被注入通过微电极触发一个尖峰，EMG活动可以记录对肌肉一个短暂的延迟后，接着由一个肌肉抽搐（ 图1D）。运动神经元鉴定后，其电生理特性的特点。例如， 图2示出如何测量可以使用超极化和去极化脉冲的电流（ 图2A），和绘图输入 电阻对比量的注入电流（ 图2B）的膜电位的变化。
的收缩性能的马达单元，也可以使用不同的协议的刺激研究。例如，在各种频率下的电流注入的短脉冲中的运动神经元（ 图3A），可以通过以下方式获得的力频率关系。稳定状态的力，然后可以绘制对揭示的S形曲线的力-频率曲线（ 图3B）的电流脉冲的频率。
如果麻醉是很好的控制下，它可以从一个单一的马达单元记录超过15分钟。在这时间的推移，它应该可以运行大型的一系列协议来描述它支配的肌纤维的运动神经元和收缩性能。
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图1。示例程序，以确定一个运动神经元。图A，C三个连续的运动神经元的电刺激坐骨神经。垂直虚线表示的时间的刺激。每个面板的细胞内记录膜电位（上部曲线）和传入的后腰线（底部的迹线）表面上记录的凌空抽射。A.在招聘I组传入的强度高于阈值（1.1×T）， EPSP出现在响应的电刺激。 EPSP是突触的时间太短了，因为它的延迟，0.4毫秒（小的垂直虚线），涉及一个以上的突触的途径。B.增加刺激强度（2.0×T）增加的大小，直到它的EPSP当刺激强度足够大，以触发顺秒杀。C.增加更（2.1×T），轴突被吸收，并出现逆向动作电位的刺激时间为1.2毫秒的延迟。的传导长度38mm，轴突的传导速度是32米/秒。D.当注入电流（底部的迹线）成一个三头肌，小腿运动神经元（不同的运动神经元的交流比），可引起在躯体上的动作电位（第二个跟踪从底部）。这个动作电位下来的轴突穿过神经肌肉交界处，并触发肌肉动作电位记录的运动神经元支配的肌纤维。使用的肌电电极，复合动作电位（从顶部）的第二个跟踪记录。收缩的肌纤维的抽搐所示在上部的跟踪。可估计从两个垂直虚线之间的抽搐反应的电动机单元的收缩时间。图改编参考文献5部分。
图2。运动神经元的输入电阻的估计。 A.平均响应于一系列的电流脉冲（底部的痕迹）持续500毫秒，取值范围从-3到2 nA的。注意下垂的运动神经元（充满箭头）上的电压响应的电压迅速达到峰值（黑点），然后稳定到一个较低的高原值（黑方块）。电流脉冲已被终止后，出现反弹（空箭头）。B.剧情偏转（ΔV）的电压-电流脉冲的强度的曲线。点已经测得的响应的峰值，而平方已在脉冲结束时测量，如由图B1的顶部上的符号描绘。直线是最好的线性拟合的峰值响应（虚线）和高原反应（点划线）。这些线路的最大输入电阻和高原我的斜坡输入电阻的运动神经元，分别。图改编自参考文献5。
图3。表征的力的电动机单元的频率关系。顶部的三个面板显示：在底部的迹线，在该频率的脉冲电流的重复显示每个面板的顶部和用于引出中的运动神经元的动作电位，在上述第二跟踪，从底部的运动神经元的膜电位的影响，将示出在脉冲频率的动作电位;上的第二迹线从顶部，肌电活动;最佳跟踪火车的动作电位所产生的力。底部面板显示个别列车期间达成的力的量的摘要图表绘制反对的频率在每个列车的动作电位。该曲线是S形的。
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Discussion
这里所描述的制备是首先，允许，在成年小鼠的腰部的运动神经元和其轴突支配肌肉纤维所产生的力的测量，同时细胞内记录。
由于体积小的动物，这个准备所需的手术技巧可以是具有挑战性的收购。然而，一旦这些技能掌握，整个手术可以在三小时内进行，并能根据动物存活长达7个小时的手术过程结束后录音。这项技术的成功，本质上是对麻醉的管理队伍。这是至关重要的，仔细监测尽可能许多生理参数（核心温度，pCO 2的 ，心脏速率，等），并维持它们是各自的生理范围内。通过增大/减小的电源到h，必须予以纠正的任何偏差，例如立即吃毯子，呼吸器的参数调整，或增加更多的麻醉剂。这是我们的经验，鼠标的生理状态，可以密切关注一个令人惊讶的快速转坏，如果在任何时候都没有支付这些参数。
努力实现细胞内记录时，机械稳定性是最重要的。 在体内 ，其中的运动神经元的血压，呼吸和肌肉收缩的影响下可以移动，这是特别真实。即使它是不可能保证完美的稳定性，我们的程序允许运动神经元为10分钟或更长时间的稳定的录音。这是通过固定的脊柱和腿骨的组合，四个夹具。两个夹子位于尽可能接近固定的椎板网站，脊髓在这方面的。我们发现，减少脊髓的长度的两个夹具之间，以及施加一点点在骨头上的紧张局势提供了很好的稳定，因为我们是几个小时瘫痪动物5，能维持细胞内的录音。但是，在本情况下，动物还没有瘫痪，和肌肉合同是免费的，尤其是当刺激坐骨神经。这就是为什么，为什么我们用两个夹子，在骶骨水平稳定整个腿部骨骼，固定的全髋关节，因此，防止被传输到脊柱的肌肉收缩，并在脚踝的腿固定在90 °角。
使用这种技术，它是可能的，以确定基于其的电动机单元13上的力分布的运动神经元的生理类型。运动神经元可分为作为他们的抽搐收缩时间慢或快的基础上，根据自己的能力，以维持一个给定的力量在重复刺激疲倦或抗疲劳。因此，该制剂普罗维DES一定的优势， 在体外的筹备工作。以在体外条件下，脊髓从动物体中提取，并放置在培养皿中无论是全部或切片。由于髓鞘周围的灰质层，适当的氧合只能在新生儿动物的方式获得的髓鞘形成是不完整的14。在成人片15日至17日，最近的技术发展已使脊髓运动神经元的记录，但是，这种方法并不能缓解的主要缺点在体外录音，这是没有办法来识别记录的运动神经元的生理型（S， FF，FR，甚至是阿尔法和伽玛），强制实验者汇集录音从本质上是不同的运动神经元，在功能方面，电生理特性，蛋白质含量（见曼纽尔Zytnicki，2011年18回顾的不同类型的运动神经元）。
在体内的录音可以在转基因动物研究这个特定的电机系统的功能改变的直接影响：产生力。这为研究人类神经退行性疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），脊髓性肌萎缩症（SMA）的准备也是非常有前途的。遗传模型确实已经产生，这些疾病的症状，10,11复制的标志。这里所描述的新的制备开辟了研究在这些疾病中的神经肌肉接头部通过测试的行为的运动神经元和肌肉纤维（独立和在一起）的病情发展的过程中的作用的可能性。最近，有两个独立的团体能够开发出在小鼠体内的准备，去大脑具有自发的运动或虚构的运动19,20。如果种记录稳定性，我们观察到使用过程去大脑手术后可以实现，这将构成一个强大的工具，不仅是运动神经元的研究，但所有的电机前脊髓电路中产生的自发节律。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作可能要归功于金融支持基金会POUR LA RECHERCHEMédicale（FRM），的米尔顿Safenowitz的博士后研究人员为研究ALS（ALS协会），美国国立卫生研究院的NINDS资助NS05462和NS034382，ANR格兰特HyperMND。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
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Tags
第70期，神经科学，生理学，生物物理学，解剖学，医学，电机系统，脊髓，细胞内记录技术，运动神经元，肌电图，部队，腰椎，神经元，脑，鼠标，动物模型Erratum
Formal Correction: Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo
Posted by JoVE Editors on 01/04/2013.
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Marin Manuel
instead of:
Manuel Marin
