Summary
Drosophila larver er i stand til at knytte lugt stimuli med gustatoriske belønning. Her beskriver vi en simpel adfærdsmæssige paradigme, der tillader analyse af appetitive associativ olfaktoriske læring.
Abstract
I det følgende beskriver vi de metodemæssige enkeltheder i appetitive associative olfaktoriske læring i Drosophila larver. Opsætningen, i kombination med genetiske forstyrrelser, giver et håndtag til at analysere de neuronale og molekylær grundlæggende elementer specifikt associative læring i en simpel larve hjerne.
Organismer kan bruge tidligere erfaringer til at justere nuværende adfærd. En sådan erhvervelse af adfærdsmæssige potentiale kan defineres som læring, og de fysiske baser af disse potentialer som hukommelses spor 1-4. Neuroforskere forsøger at forstå, hvordan disse processer er organiseret i form af molekylære og neuronale ændringer i hjernen ved hjælp af en række fremgangsmåder i modelorganismer lige fra insekter til vertebrater 5,6. For sådanne bestræbelser er det nyttigt at anvende modelsystemer, der er enkle og eksperimentelt tilgængelige. Drosophila Larven har vist sig at opfylde disse krav er baseret påtilgængeligheden af robuste adfærdsmæssige assays, eksistensen af en bred vifte af transgene teknikker og den elementære organisation af nervesystemet, der kun omfatter omkring 10.000 neuroner (om end med nogle indrømmelser: kognitive begrænsninger, få adfærdsmæssige muligheder, og rigdom af erfaringer tvivlsom) 7-10 .
Drosophila larver kan danne associationer mellem lugte og appetitive gustatoriske forstærkning ligesom sukker 11-14. I et standardassay, der er etableret i laboratoriet af B. Gerber dyrene får en to-lugt gensidig træning: En første gruppe af larver udsættes for en lugt A sammen med en gustatoriske forstærker (sukker belønning) og efterfølgende udsat for en lugt B uden armering 9. Imens en anden gruppe af larver modtager gensidig træning mens du oplever lugt A uden forstærkning og efterfølgende blive udsat for lugt B med forstærkning (sukker belønning). I det følgende begge grupper er tesTed for deres præference mellem de to lugte. Relativt højere præferencer for det belønnet lugt afspejler associative læring - præsenteret som en performance index (PI). Konklusionen vedrørende associative karakter af ydeevne indeks er overbevisende, fordi bortset fra til uforudsete mellem lugte og tastants, andre parametre, såsom lugt og belønning eksponering, passage af tid og håndtering ikke adskiller mellem de to grupper 9.
Protocol
1. Forberedelse
- Drosophila vildtype-larver er rejst på 25 ° C og 60% -80% fugtighed i en 14/10 lys / mørkecyklus. Til styring af nøjagtige alder af larverne altid 20 hunner sættes med 10 hanner i et hætteglas (6 cm højde og 2,5 cm i diameter), der omfatter omkring 6 ml standard flue fødevarer. Fluer får lov til at lægge æg i 12 timer og overføres til et nyt hætteglas på den anden dag. 5-6 dage efter æglægning larver nå fodring 3. instar stadium hvis de tilvejebringes ved 25 ° C og kan nu anvendes til adfærdsmæssige forsøg. Man må dog sikre at kun tage larver, der stadig er i fødevarer og ikke larverne fra siden af hætteglasset. Disse larver har allerede nået "vandrer 3 rd instar scenen" - kort før pupation - og deres anvendelse komplicerer fortolkningen af resultaterne.
- Fremstilling af 2,5% agarose petriskåle (andre laboratorier anvender også agar koncentrationer på 1% under hele eksperimentet, hvorstadig lavere koncentrationer kan tillade fodring 3. stadiums larver til at grave ind i underlaget): Opløs 2,5 g agarose i 100 ml ddH 2 O. Opvarmning af opløsningen i en mikrobølgeovn, indtil det begynder at koge. Forsigtigt agitere løsningen og sætte den tilbage i mikrobølgeovnen, indtil alle agarose er opløst. Hæld den varme agaroseopløsning i petriskåle, således at bunden af petriskålene fuldstændig dækket, og agaroseopløsningen danner en glat overflade. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur og lukke låget. Må ikke straks lukke lågene, fordi det ville give mulighed for kondensering af vand på lågene.
- Fremstilling af 2M fructose petriskåle: Opløs 2,5 g agarose i 100 ml ddH 2 O (igen anvendelse af 1% agar koncentration er mulig, men den kan tillade tilførsel 3. stadiums larver at grave ind i substratet). Opvarmning af opløsningen i en mikrobølgeovn, indtil det begynder at koge. Forsigtigt agitere løsningen og sætte det tilbage i mikrobølge indtil alle agarose er opløst. Derefter tilsættes forsigtigt 35 g fructose til den varme opløsning, langsomt omrøre blandingen, indtil sukkeret opløses at undgå kogning retardering. Hæld den varme fructose-agaroseopløsning i petriskåle så at bunden er helt dækket og fructose-agaroseopløsning danner en glat overflade. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur og lukke låget. Må ikke straks lukke lågene, fordi det ville give mulighed for kondensering af vand på lågene.
- Fremstilling af 1-octanol (OLT), lugt beholdere: Fyld 10 ul ren OLT i en skræddersyet Teflon lugt container og luk den med et låg, der har flere små huller for at muliggøre fordampning af lugt. En detaljeret beskrivelse af beholderne er angivet i Gerber-og Stocker 2007. Forbered tre lugt beholdere til oktober Lugt beholdere tillader fordampning af de indsatte kemikalier, men undgå at larver direkte kan kontakte dem. Således er de her beskrevne eksperimenter specifikttackle olfaktoriske læring i larver uden at forskubbe gustatoriske bivirkninger.
- Fremstilling af amylacetate (AM) lugt beholdere: Fortynd AM 1:50 i paraffinolie. Fyld 10 ul af fortynding i et skræddersyet Teflon lugt beholder og lukkes med et låg, som har flere små huller for at muliggøre afdampning af lugt. Forbered tre lugt containere for AM. Fortyndingen er vigtig af praktiske grunde, nemlig at undgå en stærk præference for en lugt frem for den anden, der kan maskere en learning-afhængig ændring i den relative præference mellem de to lugte. Den lige attraktion for både lugt kan være nødvendigt at blive bekræftet i laboratoriet før forsøget ved at anvende den senere beskrevne test (2.5) med naive dyr. De værdier, her præsenteres, er baseret på en række publikationer fra Gerber lab, der for nylig blev gengivet af vores lab 9,15,16.
- Mærkning af petriskålene: Før de adfærdsmæssige eksperimenter alle petriskåle skal kodes. Det betyder, atfructose indeholdende Petriskåle skal mærkes for eksempel med et "X" eller en "A" og agarose kun petriskåle med en "Y" eller "B". Denne kode skal blive afsløret til eksperimentatoren, når alle data er blevet registreret. Ved at udføre forsøgene "blind" det er således ikke muligt, at forventningerne til eksperimentatoren kan påvirke ydeevnen af larverne. For at lette en forståelse for den brede læserskare i det følgende vil vi kun tale om de lugte som konditionerede stimuli (CS1 eller CS2), der enten belønnes når de præsenteres på en fructose Petriskål (+) eller ikke-belønnet når de præsenteres på en agarose kun petriskålen (-).
2. Sukker Reward Træning og Test
- Saml 30 fodring 3 rd stadiums larver fra en fødevare hætteglas. Overfør dem til en første petriskål, der indeholder nogle dråber vand fra vandhanen og omhyggeligt flytte dem frem og tilbage med en pensel. Overfør dem til en anden petriskål, der indeholder også nogle dråber tap water at kontrollere, at ingen fødevarer pasta forbliver på bodywall af larverne, ellers larver ville være i stand til at opleve mad lugt under eksperimentet. Dette vil sandsynligvis overskygge læringsprocessen og deres præstationer i testen situation.
- Uddannelse: At uddanne larver til associerede lugte med en appetitive sukker cue følgende regime anvendes. Sæt et OLT lugt container på venstre og højre side af et markeret "X" - således, fructose belønning indeholdende (+) petriskål ("blind" eksperiment, for detaljer se 1,6). Sæt gruppe af 30 fodring 3. stadiums larver på midten af petriskålen, lukke låget og vent i 5 minutter, mens dyrene udsættes for oktober Kontroller, at larverne ikke er fanget inde i vanddråben, og kan overvinde overfladespændingen af den. Ved at larver kan bevæge sig frit på petriskålen og opleve olfaktoriske og / eller gustatoriske stimuli.
- Uddannelse: Fjern larverne fra petriskålen med en fugtet pensel og overførem på en anden petriskål, der er mærket med en "Y" - således, agarose kun (-) indeholdende petriskål - og har en AM lugt container placeret på sin venstre og højre side. Luk låget og vent i 5 minutter, mens dyrene udsættes for AM.
- Træning: Gentag 2.2) og 2.3) to gange, således at alle 30 larver experience tre erhvervsuddannelsesforløbene: CS1 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-). I dette eksperiment CS1 repræsenterer OLT og CS2 koder for AM.
- Test: Placer 01:00 og ét OLT lugt container på de modstående sider i en agarose-only petriskål. Overfør trænede dyr til midten af prøven petriskål. Luk låget og vent i 5 min. Derefter tælles antallet af larver på venstre side, den midterste og højre side af prøven petriskål.
- Gentag trin 2.1) til 2,5) med en anden gruppe på 30 fodring 3 rd stadiums larver, men bytte de eksperimentelle roller AM og OLT sådan, at dyrene får følgende uddannelse: CS2/ (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-). I dette eksperiment CS1 repræsenterer OLT og CS2 koder for AM.
- Mulige ordninger for uddannelse. Over vi præsentere en uddannelse, der eksisterer på tre uddannelseskurser forsøg med enten OCT / (+) - AM / (-) eller i den gensidige gruppe af også tre uddannelse forsøg med AM / (+) - OLT / (-). Men for at undgå sekvensafhængige virkninger under træningen er det vigtigt at variere rækkefølgen af stimuli i følgende gentagelser af hele eksperimentet. Ved at variere CS1 eller CS2 rækkefølge og også belønning præsentation i den første eller anden præsenteret plade, er fire forskellige sekvenser for uddannelse forsøg mulige:
| Første gruppe | CS1 / (+) - CS2 / (-) | Gensidig gruppe | CS2 / (+) - CS1 / (-) |
| CS1 / (-) - CS2 / (+) | CS2 / (-) - CS1 / (+) | ||
| CS2 / (+) - CS2 / (-) | CS1 / (+) - CS2 / (-) | ||
| CS2 / (-) - CS1 / (+) | CS1 / (-) - CS2 / (+) |
At forebygge systematiske effekter af stimuli i det omgivende eksperimentelle miljø, bør man udføre testen i halvdelen af tilfældene, således at OLT præsenteres til venstre og AM til højre. I den anden halvdel af tilfældene AM skal præsenteres på venstre og OLT til højre.
3. Tests for Task-relevante Sanse-motoriske Fakulteter
Udformningen af de ovenfor beskrevne forsøg gør det muligt at analysere lugt-sukker læring i vildtype fodring 3. stadiums larver på egen hånd. Men i daglig lab liv forskere plejer at bruge to eller flere forskellige eksperimentelle grupper af larver at sammenligne, hvis olfaktoriske læring afhænger af en fodsærlig gen, et bestemt sæt af neuroner, en mutant bestand, en særlig fødevarer kost, forskellige opdrætsforhold, giftige kemikalier, der tilsættes under udvikling osv. således i alle tilfælde, når to eller flere eksperimentelle grupper af larver testes man har at gøre en sæt af obligatoriske bekæmpelsesforanstaltninger eksperimenter for at teste, hvis de forskellige grupper af larver viser tilfredsstillende sansemotoriske acuities. Dette bliver obligatorisk som potentielle fænotyper ikke nødvendigvis på grund af reduceret eller afskaffet evner til at knytte lugte med sukker. Snarere kan potentielle læring defekter være baseret på fejl på ethvert trin i sansemotoriske kredsløb i behandlingen af lugte og / eller sukker. Eller med andre ord, hvis en mutant larve ikke kan forstand sukker, kan det ikke etablere en sukker hukommelse. Men det gør det ikke muligt at konkludere, at larven ikke kan lære. I detaljer de følgende kontrolforsøg skal gøres for at teste for korrekt OLT, AM og fructose behandling af transgene larver.
1. Test for naive oktober preference
Saml 30 fodring 3 rd stadiums larver fra en fødevare hætteglas. Vask dem grundigt i vand fra hanen som beskrevet i 2,1. Sætte en enkelt OLT lugt container på den ene side af en agarose petriskål, tilsættes larverne på midten af petriskålen, lukke låget og vent i 5 minutter, således at larverne kan kravle på petriskålen og orientere hen imod OLT lugt kilde. Derefter tælles antallet af larver i venstre side, i midten og til højre af testen petriskål.
2. Test for naive AM præference
Saml 30 fodring 3 rd stadiums larver fra en fødevare hætteglas. Vask dem grundigt i vand fra hanen som beskrevet i 2,1. Sætte en enkelt AM lugt container på den ene side af en agarose petriskål, tilsættes larverne på midten af petriskålen, lukke låget og vent i 5 minutter, således at larverne kan kravle på petriskålen og orientere hen imod AM lugt kilde. Derefter tælle antallet af larvae på venstre side, i midten og til højre af testen petriskål.
3. Test for naiv sukker præference
Saml 30 fodring 3 rd stadiums larver fra en fødevare hætteglas. Vask dem grundigt i vand fra hanen som beskrevet i 2,1. Forbered petriskåle, der indeholder 2,5% agarose i den ene halvdel og en 2 M fructose-agarose blandingen i den anden halvdel. Tilsæt larver på petriskålen, lukke låget og vent i 5 minutter, således at larverne kan kravle på petriskålen og orientere mod fructose indeholdende side. Derefter tælles antallet af larver i venstre side, i midten og til højre af testen petriskål.
Fremstilling af halv-halv petriskåle: Forbered normale agaroseplader som beskrevet ovenfor i afsnit 1,2. Når agarosen fyldt petriskåle nedkøles, forsigtigt skåret agarosen langs den lodrette akse med en skalpel. Fjern den ene halvdel af agarose fra petriskålen. Add en varm fructose-agaroseopløsning (for fremstilling se 1.3) til det tomme halvdel af petriskålen. Vær opmærksom på, at begge halvdele matcher og ikke danner en defineret kant - dette påvirker den larvernes valg adfærd og gør en adfærdsanalyse temmelig vanskelig 4..
Sham træning
Trods forsøg, hvis transgene fodring 3 rd stadiums larver er i stand til at skelne på et vildtype niveau mellem OLT og luft (3,1), AM og luft (3,2) og sukker og ren agarose (3,3), et ekstra sæt testeksperimenter er for nylig blevet indført (for diskussion se Gerber og Stocker, 2007). Rationalet for disse eksperimenter er som følger. Under uddannelsen larver gennemgå massiv håndtering og efterfølgende lugt og sukker stimulation. Det er således også muligt, at den observerede learning fænotype er vildledende (selvom naive lugt og sukker opfattelse tests er på et vildtype niveau!). Faktisk er det muligt, at de transgene dyr differ fra vildtype larver med hensyn til stress modstand, motivation, træthed, sensorisk tilpasning, kontekstuelle læring og ændringer i mæthed. Således Michels et al. (2005) indført kontrol at teste, om en given mutant er i stand til at (1) opdage AM versus en tom lugt container, hvis du behandler larverne præcis som under træning, bortset fra at du udelader belønning og blot udsættes for både lugte, (2) opdage oktober efter den samme ordning, (3) opdage AM versus en tom lugt container, hvis du behandler larverne i en uddannelse-lignende måde, bortset fra at du udelader lugte og blot udsættes for den belønning, og (4 ) påvise oktober efter samme regime. For en omfattende diskussion og yderligere detaljer om de metoder se Michels et al (2005) og Gerber og Stocker (2007).
4. Dataanalyse for Sukker belønne læring
- At evaluere dataene for sukker belønning learning protokol beregne et oktober præference index (PREF OLT) for hver af de to reciprotisk uddannet grupper:
For den første gruppe, der modtog OCT / (+) - AM / (-) uddannelse:
PREF oktober (OCT + / AM-) = (# af larver på OCT side - # af larver på AM side) / # af alle larver i venstre, højre og midterste zoner
For den anden gruppe, der modtog AM / (+) - OLT / (-) uddannelse:
PREF AM (AM + / OLT-) = (# af larver på AM side - # af larver på OCT side) / # af alle larver i venstre, højre og midterste zoner
- Beregn en performance index (PI) for de to Pref værdier fra 4,1). PI repræsenterer associative læring ved at annullere ud forstyrrende virkning fra lugt og straf eksponering, passage af tid og håndtering:
PI = (PREF oktober (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / OLT)) / 2
Således PI'er kan ligge i området fra -1 til 1. Markant negative værdier repræsenterer afskrækningsmiddel læring, hvorimod markant positive værdier beskriver appetitive læring. En komplet eksperiment sædvanligvis består af 10 eller flere proteasehæmmere. Data er visualiseret som box plots including alle værdier af en given forsøgsgruppe. 50% af de værdier, der er anbragt inden i kassen, median ydeevneindeks er angivet som en fed linie i kassegraf.
5. Dataanalyse for Task-relevante Sanse-motoriske Fakulteter
- For at evaluere de data, når der testes for korrekt oktober lugt behandling beregne et OLT lugt præference indeks som følger:
Lugt PREF oktober = (# af larver på OCT side - # af larver på den anden side) / # af alle larver i venstre, højre og midterste zoner - For at evaluere de data, når der testes for korrekt AM lugt opfattelse beregne en AM lugt præference indeks som følger:
Lugt PREF AM = (# af larver på AM side - # af larver på den anden side) / # af alle larver i venstre, højre og midterste zoner - For at evaluere de data, når der testes for korrekt fructose opfattelse beregne et fructose præference indeks som følger:
PREF fructose = (# af larver på fruktose side - # af larver på den anden side) / # Af alle larver i venstre, højre og midterste zoner - Detaljer for den fingeret uddannelse er givet i Michels et al. 2005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en oversigt over de eksperimentelle procedurer for larvestadiet lugtesansen associativ læring. Ved at parre en af de to præsenterede lugte med en sukker belønning larver erhverve adfærd potentialet til at udtrykke et attraktivt respons mod belønnet lugt i forhold til den ubelønnet lugt. To grupper af larver er altid trænet af enten parre forstærker med lugt OLT eller AM. Udførelsen (PI) måler associative funktion som forskellen frem mellem de gensidigt uddannede grupper.
I tilfælde associativ funktion analyseres i transgene larver, er tests for grundlæggende sansemotoriske evne, der kræves. Dette gøres ved at tilbyde dem valget mellem en fyldt lugt container og luft eller mellem ren agarose og agarose plus en sukker. (Sham træning er ikke vist her). Den endelige fordeling af larverne er noteret i en specifik datablad (figur 2) og visualized som en box plot (fig. 3). Positive resultater indikerer et attraktivt valg adfærd for præference indekser og appetitive læring i forbindelse med de ydeevneværdierne. Negative værdier indikerer en aversiv valg adfærd for de beregnede præferenceaktier indekser og aversiv læring i forbindelse med de ydeevneværdierne.
Figur 1. Scheme af de adfærdsmæssige eksperimenter til at måle larvernes associativ olfaktoriske læring, naive olfaktoriske præferencer og naive gustatoriske præferencer.
- 30 Drosophila fodring 3 rd stadiums larver er placeret i fem minutter på en agarose petriskål, der indeholder en sukker belønning af 2M fruktose. Samtidig en første lugt er tilvejebragt i Teflon beholders (OLT). Således larver kan knytte en lugt stimulus med en positiv forstærker i den første træning fase. Next, larver overført til en anden agarose petriskål uden forstærker, men med den anden lugt (AM) for igen 5 min. Uddannelsen gentages tre gange. Endelig, i test situationen lugten præference af larverne måles for belønnet lugt mod den ikke-belønnes lugt på en agarose petriskål. Dette giver mulighed for beregning af en første præference index (PREF). En anden gruppe af larver er uddannet på samme måde i en i hinanden måde. Her kan en yderligere præference index (PREF) beregnes. Endelig en Performance Index (PI) beregnes ved at tage gennemsnittet begge præference indeks. For yderligere oplysninger om rækkefølgen af forsøgene se også 2,7.
- Til analyse af naive lugt Fortrinsvis er en enkelt lugt beholder fyldt med enten OLT eller AM, som er udtaget af en ren agarose petriskål. 30 fodring 3. stadiums larver er placed i midten af petriskålen, og efter 5 minutter fordelingen af larverne på petriskålen tælles. Ud fra de opnåede data en olfaktorisk præference indeks (PREF) beregnes derefter.
- Til analyse af naive gustatory præference 2M fructose fyldes i den ene halvdel af en petriskål, der indeholder ren agarose på sin anden side. 30 fodring 3. stadiums larver anbringes i midten af petriskålen, og efter 5 minutter fordelingen af larverne på petriskålen tælles. Ud fra de opnåede data en gustatoriske Preference Index (PREF) beregnes derefter.
Figur 2. Eksempel på en rå datablad for registrering og behandling af data opnået for A) sukker belønning læring, B) naivlugt præferencer og C) naive gustatoriske præferencer. For alle eksperimenter antallet af larver i venstre side, i midten og til højre af petriskålene noteres. Ud af disse oplysninger præference indeks (PREF) beregnes. Larvernes læring er afbildet som ydeevneværdierne (PI) følger regner på de Prefs af to gensidigt uddannede grupper. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Eksempel datavisualisering opnået for A) sukker belønning læring, B) naive lugt præferencer og C) naive gustatoriske præferencer. Boxplots repræsentere data som følger: median (fed linie indenfor boksen), boksen angiver 50% af alle datapunkter mens den øvre og nedre knurhår repræsenterer de resterende 25% hver. Derfor uden outliers de minimale og maksimale værdier er angivet med knurhår grænser. Outliers er afbildet som små cirkler, de er defineret som ethvert punkt mere end 1,5 gange den interquartilt område fra 1. og 3. kvartil. Statistisk analyse af enkelte datapunkter udføres med Wilcoxon signed-rank test, mens Wilcoxon rank sum test anvendes til sammenligning af to datagrupper. Signifikansniveauer er angivet som ns for p> 0,05, * for p <0,05, ** for p <0,01 eller *** for p <0,001. Stikprøvestørrelse på hvert forsøg: N = 15.
For det kognitive eksperimenter i A) altid to præference indekser (PREF) af gensidige eksperimenter er truffet for at beregne den endelige ydeevne indeks (PI). Ydeevneværdierne (PI) er afbildet som kassegrafer overensstemmelse hermed.
Figur 4. Eksempler på GAL4 linjer hver især etiketter et bestemt sæt af celler i larvestadiet hjernen. Altid fuld z-fremskrivninger af frontale visninger af larvestadiet hjerne er vist. Specifikke sæt af neuroner er mærket med anti-grønt fluorescerende protein (grøn) i hele larvestadium CNS, som er visualiseret ved anti-FasII/anti-ChAT doublestaining (magenta). A) NP225 etiketter et sæt af anden orden olfaktoriske neuroner, kaldet fremspring neuroner (pil) og udvikling af voksne visuelle system (pilespids). B) NP2426 varemærker et sæt olfaktoriske interneuroner (pil) ved den første olfaktoriske relæstation, kaldet antennal lap. C) GR66a mærker udelukkende et sæt gustatoriske sensoriske neuroner, at projekt fra perifere gustatoriske sanseorganer til subeosophageal ganglion (pil). D) NP3128 etiketter flere sæt af forskellige typer neuroner. Pilen markerer olfaktoriske interneuroner af antennal lap svarende til B. pilespids fremhæver en række af dopaminerge neuroner, som projekt på en neuropil region kaldet champignon krop. E) H24 mærker et sæt champignon kroppens Kenyon celler (pil), neuroner, at hvor der er vist at være nødvendige for larver olfaktoriske indlæring. F) NP7493 er et eksempel på et relativt uspecifik ekspressionsmønster, der omfatter flere sæt af udviklende neuroner (pile), som yderligere adskiller under metamorfose til dannelse hjernen af flyve. Scale bar = 50 | jm.
Figur 5. Overblik sammenfatter vellykkede forsøg på at studere associative læring i Drosophila larver. Olfaktoriske stimuli samt lys kan anvendes som en betinget stimulus for at være forbundet med enten belønning eller straf (ubetinget stimulus). Belønning stimuli omfatter sukker og lave koncentrationer af salt, straffe stimuli omfatter høje koncentrationer af salt, kinin, elektrisk stød, varme, mekanisk stimulering gennem vibration (buzz) og lys 11,12,17-24. Klik her for at se større figur .
| GAL4 / UAS-konstruktionerne anvendes ofte i vores laboratorium | |||
| Forkortelse | Protein | Funktion | Litteratur |
| Visualisering | |||
| UAS-mCD8 :: GFP | grønt fluorescerende protein | membRANE markør | Lee et al. 1.999 |
| UAS-n-syb :: GFP | grønt fluorescerende protein | præsynaptisk markør | Ito et al. 1.998 |
| UAS-Dscam17.1 :: GFP | grønt fluorescerende protein | postsynaptiske markør | Wang et al., 2004 |
| UAS-NLS :: GFP | grønt fluorescerende protein | cellelegemet markør | Robertson et al. 2.003 |
| Interferens med neuronal signalering | |||
| UAS-hid | hoved involution defekt | inducerer apoptose | Zhou et al. 1997 |
| UAS-RPR | reaper | inducerer apoptose | Zhou et al. 1997 |
| UAS-shi ts | dominant negativ dynamin | blokke vesicle genbrug | Kitamoto, 2001 |
| UAS-Kir.2.1 :: EGFP | indad berigtigelse K + kanal | ingen membrandepolarisering | Baines et al. 2.001 |
| UAS-TRPA1 | kation kanal | temperaturafhængig aktivering | Rosenzweig et al. 2.005 |
| UAS-CHR2 | Channelrhodopsin | lys afhængig aktivering | Schroll et al. 2.006 |
Tabel 1. UAS effektor konstruktioner ofte bruges i laboratoriet til at visualisere den neuronale anatomi og manipulere synaptisk transmission 25-33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne setup i Drosophila larver giver mulighed for undersøgelse af associative olfaktoriske læring inden et sammenligneligt elementær hjerne. Fremgangsmåden er simpel, billig, let at etablere sig i et laboratorium og ikke kræver højteknologisk udstyr 9. Vi præsenterer en version af eksperimentet for at undersøge appetitive associativ indlæring forstærket af fructose belønning 11. Den beskrevne setup er baseret på en række parametriske undersøgelser, omfattende undersøgte variationer i antallet af uddannelsespladser forsøg, enkelt assay versus masse assay, retentionstid, brugte lugte og lugtkoncentrationer og køn 9,15,34,35. Således det afbildede adfærdsmæssige opsætningen integrerer disse oplysninger i en usædvanlig reproducerbar metode til at studere højere hjernefunktioner i Drosophila. I sidste ende, er baseret på den simple setup den belønne eller straffe effekten af eventuelle opløseligt stof kan nemt testes med denne analyse.
ve_content "> Desuden blev adskillige varianter af paradigme for nylig offentliggjort, at tillader undersøgelse af associative visuel læring i larverne 23,36 (etableret i Gerber et al (2004).) og elektrisk stød, lys, varme, kinin eller vibrationer blev også gennemført med held som afskrækningsmidler forstærkere til associativ olfaktoriske læring 9,17,19-21,37-40. Således et omfattende sæt af forsøgsopstillinger eksisterer for at analysere den adfærdsmæssige, neuronal og molekylære grundlag for indlæring og hukommelse i Drosophila larver ( Figur 5) 13,14,41,42. Her har vi udelukkende fokuseret på lugt-fructose lære på grund af robustheden af analysen og de relativt høje ydeevneværdierne, der kan opnås. Især nogle af de afskrækningsmidler varianter fører til kun små adfærdsmæssige ændringer. Dette begrænser i nogen grad anvendelsen af metoden, foruden udviklingsmæssige spørgsmål om de dyr, der gør studier på larvestadiet langsigtethukommelse som umuligt.Larve hjerne består af kun omkring 10.000 neuroner i sin helhed. Således på grund af sin relativt simple (med hensyn til antal) organisation er det godt tilgængelig for genetisk indblanding, hvilket igen giver mulighed for avancerede studier på det molekylære og neuronal grundlag for læring og hukommelse. Især de GAL4/UAS systemer og dets nylige ændringer muliggør den genetiske manipulation af fastlagte sæt af neuroner og op til endog enkelte celler i en spatio-temporal måde (figur 4) 7,10. Herved et omfattende sæt af effektor linier giver mulighed for at visualisere disse definerede sæt af neuroner (fig. 4) 25,43 eller alternativt at manipulere deres neuronal udgang (tabel 1). Oftest effektor gener anvendes som kan celle-autonomt inducere celledød eller inhibere neuronal transmission 29,30,33. For nylig teknologier blev udviklet, at allav for en kontrolleret kunstig aktivering af neuroner drevet af lys eller temperatur (tabel 1) 31,32,44.
Sammenfattende tillader kombinationen af sofistikerede metoder til genetisk interferens og de her beskrevne adfærdseksperimenter afdække den neuronale, molekylære og adfærdsmæssige grundlag for indlæring og hukommelse i den elementære hjernen hos Drosophila-larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil især gerne takke medlemmerne af Gerber lab for tekniske instruktioner om deres eksperimentelle opsætning og kommentarer til manuskriptet. Vi takker også Lyubov Pankevych for flue pleje og vedligeholdelse af vildtype kantoner lager. Dette arbejde støttes af DFG tilskud TH1584/1-1, SNF tilskuddet 31003A_132812 / 1 og Zukunftskolleg fra University of Konstanz (alle til AST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fructose | Sigma | 47740 | 57-48-7 |
| NaCl | Fluka | 71350 | 7647-14-5 |
| Agarose | Sigma | A5093 | 9012-36-6 |
| 1-octanol | Sigma | 12012 | 111-87-5 |
| Amylacetate | Sigma | 46022 | 628-63-7 |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | 8012-95-1 |
References
- Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
- Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
- Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
- Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
- Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
- Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
- Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
- Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
- Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
- Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
- Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
- Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
- Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
- Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. , (2012).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
- Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
- Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
- Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
- Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. , (2011).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
- Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
- Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
- Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
- Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
- Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
- Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
