Summary
Bu protokolde, w e atriyal aritmi farelerde tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit.
Abstract
Biz farelerde atriyal aritmi tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin yalıtmak için tasarlanmış olanlar türetilen fare kalpleri onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha geniş olduğunda, yamalı kenetleme ve biyokimyasal çalışmalar için uygun sağlıklı kalp melanosit elde etmek amacıyla, ilk olarak izole edilmesi ve deri melanositleri izole etmek için tasarlanmış olanlar göre kalp melanosit kaplama için zarif bir prosedür geliştirilmiştir. Rafine işlemi bu incelemede gösterdi ve saf bir nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı melanosit benzeri hücrelerin daha fazla sayıda üretir.
Introduction
Biz son zamanlarda melanin sentezi enzimleri ifade ve morfolojik deri melanosit benzer farelerin ve insanların kalbinde yeni bir hücre popülasyonu tespit. Biz bu hücrelerin kalp melanosit 'olarak adlandırılan ve atriyal aritmi genellikle insanlar köken tetikler hangi anatomik yerlerde bulunurlar bulundu. Biz de kalp melanosit DCT germline silinmesi ile farelerde atriyal aritmi katkıda bulundu. Kardiyak melanosit seyrek hepsi atriyal hücrelerin en az% 0.1 içerirler fare atriyum boyunca dağıtılır. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz Cre-uyarılabilir melanosit spesifik işaretlerini kullanarak fare kalp onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Bizim ilk işlemi yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin ve yama kelepçe kayıtları veya PCR analizi için uygun hücrelerin vermiştir çok az sayıda izole etmek için kullanılan geliştirildi. Ancak, iyileşmek geliştirmek içininci ve elektrofizyolojik analiz veya biyokimyasal çalışmalar daha derinlemesine kardiyak melanosit, canlılığı, biz deri melanosit yalıtmak için tasarlanmış olanlar bir rafine prosedür geliştirmiştir. Bu derlemede anlatılan ve gösterilen prosedür saf nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı kalp melanosit üretme avantajına sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gerekli Çözümler ve Ekipmanları hazırlanması
- İlk olarak, 15 dakika boyunca onları otoklav ile cerrahi aletler (düz şekli forseps, kavisli şekli forseps, düz şekli makas ve kavisli şekli makas) sterilize. 121 ° C 'de. Doku kadar kıyma için kullanılacak bir set kalplerini ve diğer set dışarı Anatomi için kullanılan araçların, 2 set hazırlayın.
- Steril, filtrelenmiş su 900 ml MCDB153 kültür ortamı 1 paket çözülür ve toz çözününceye kadar yavaş yavaş karıştırılır. 1.2 gr sodyum bikarbonat ya da 15.7 mL sodyum bikarbonat solüsyonu, orta nihai her bir litre hacim için hazırlanmış ve çözünene kadar karıştırınız olması [ağ / hac% 7.5] ekleyin. Daha sonra, doku kültürü kaputu (biyo-güvenlik kabini) steril koşullar altında bir 0.2 mikron filtre içinden şişe iyi ortamı dökün, 1 N HCI veya 1 N NaOH eklenerek 7.2 'da pH ayarlayın. Sonra medya toplamak ve 4 ° C'de saklayın.
- Takviyeleri hazırlanınkültür ortamı (Malzeme Listesi) ekleyin. Ek ortam hücreleri kaplama için gerekli olan hemen önce ortama ilave edilmelidir.
- % 10 FBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin) ile DPBS hazırlayın.
- DPBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin), 100 ml, sonra, 0.25 g tripsin (USB sığır pankreası, aktivite> 2500 USP birim / mg, son derece saf) eklenmesi ile% 0.25 tripsin solüsyonu hazırlanır.
- Bu yordamı tamamlamak için gerekli diğer gerekli ekipmanı Stereomikroskopta, Petri yemekler (10 cm), 50 ml konik tüpler, 40-mikron hücre süzgeçler, DPBS artı antibiyotik, 60-mm kültür yemekleri ve 35-mm kültür yemekler bulunmaktadır.
2. Yenidoğan Fare Yavrularının dan Hearts Yalıtımlı
- İlk olarak, P2 bebek sıçan yavrularına P0 elde edilir (N = 6-8). EYFP alel veya etiketlemek için Z / EG alel: Bu R26R biri için heterozigot erkeklerde ile Dct-CRE homozigot kadın damızlık tarafından oluşturulan yavrular kullanılması tavsiye edilirmelanosit-benzeri hücreler. Hem R26R: EYFP ve Z / EG farenin Jackson Laboratories (stok numaraları sırasıyla 006.148 ve 003.920) mevcuttur.
- Sonra, yenidoğan fare yavrular euthanize alkollü bir bezle sandıkları silin ve ardından DPBS ile 10 cm Petri kabındaki yavrular yerleştirin.
- Göğüs üzerindeki deriyi kesin ve sterilize forseps ve makas ile sternum ve sonra steromikroskopla dikkatle kutuyu açın. Yenidoğan fare yavrularının kalpleri ekli kulakçıklardan ile tüm kalp kaldırmak için emin olmak için dikkatli olmak bu yüzden çok küçük.
- DPBS'de kalpleri yıkayın ve yeni bir 10-cm Petri aktarabilirsiniz.
3. enzimatik sindirme
- Bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) için kesilip kalpleri ile Petri çanak getirmek ve daha sonra kaputu steril teknikleri kullanarak aşağıdaki adımları izleyin.
- İlk olarak, steril DPBS'de artı antibiyotikler kalpler üç kez yıkayın.
- Bir (n = 6-8) kalpleri yerleştirin60-mm kültür çanak ve çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin.
- Daha sonra, (boyut olarak 1-mm 'den az) küçük parçalar halinde kesilmiş ve kalpleri% 5 CO2 atmosferinde 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe.
- Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra bir steril 50 ml konik tüp içine kardiyak doku ve çanak tripsin edilen dökün.
- Sonra, çabuk ama yavaşça 10 ml steril pipet kullanarak, 50 ml konik tüp 30-50 kere çözümü çiğnemek.
- Süzüntüyü toplamak için bir yeni ve temiz bir 50 ml konik tüp üzerine 40 mikron hücre süzgecinden elde edilen solüsyon filtre.
- Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 240 x g'de 50 ml tüp santrifüj. Sonra, yavaşça süpernatant aspire ve steril DPBS 6-8 ml kalan pelletini. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın. Bu adım atriyal miyositleri ve kardiyak melanosit pelet ama fi aşağı getirmezfibroblastlar yana broblasts daha küçüktür ve süpernatan içinde kalır.
4. Kaplama Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler
- Dikkatli bir şekilde tahliye ya da yıkama çözeltisi (DPBS) aspire ve MCDB kültür ortamı 6 ml pelet tekrar süspansiyon santrifüje edildikten sonra, üçüncü durulama sonrasında hangi katkı ilave edilmiş.
- Şimdi, steril bir transfer pipet içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş çözelti yararlanmak ve bir 35 mm tabak hücreleri yer ya da bir 6-yuvalı plakanın bir kuyuda, ve bir 35 mm tabak 3 neonatal fareden izole edilmiş kalp hücreleri havuzda veya iyi.
- , Bir% 5 CO2 atmosferinde, gece boyunca 37 ° C'de inkübe yemekler birleşmeyen hücreleri ile birlikte kültür ortamı aspire ardından DPBS ile bir kez durulama plakaları. Sonra plakalar taze medya eklemek ve Ortam 2 günde değiştirin. Hücreleri yetişkin duymak izole ise yenidoğan kalpleri veya embriyonik hücreler izole edilmiş, en fazla 3 hafta boyunca kültür içinde muhafaza edilebilirts en fazla 10 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir.
Yetişkin Fare Kalpten 5. Yalıtımlı Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler
- İlk olarak, olgun farelerin kalpleri çıkarın (3-4 hafta yaşında, n = 3) farelerine, 100 U heparin karın içinden tatbik edilmesini ve daha sonra bunların ötenazi sonra, bir orta hat sternotomi ile. Bu işlem için fareler euthanize pentobarbitaldir kullanılması tavsiye edilir, ancak bu ilaç her yerde mevcut değildir.
- Sonraki, bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) antibiyotik içeren steril DPBS'de kesilip kalpleri yıkayın. Onlardan kalan kan kaldırmak ve daha sonra DPBS'de bir kez daha kalpleri durulama kavisli kesme forseps ile hafifçe kalpleri sıkın.
- Kalplerinden Atriumlarm ve atriyoventriküler halkaya çıkarın (bu yapılar melanosit-benzeri hücreler içeren) ve 35-mm çanak kesilmiş doku örneklerinin yerleştirin.
- Kavisli makas ve kuvvet kullanarak küçük parçalar halinde kalpleri kestiPS ve daha sonra çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin. Daha sonra, 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe yemekler.
- Şimdi, adımdan sonrasını 3.6 başlayarak yukarıdaki prosedür adımları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan protokol daha önce sıçangil kalp, kalp melanosit izole etmek için yayınlanmış bir oranla geliştirilmiş bir tekniktir. Bu prosedür, kardiyak melanosit-benzeri hücreleri etiketlemek için melanin sentezi, enzim spesifik Kre-rekombinaz tarafından tahrik floresan belirteçlerin kullanımına başvurmaktadır. Atriyal miyositlerden kalp melanosit ayırt morfolojik farklılıklar henüz (Şekil 1A) geliştirdik değil çünkü, taze izole edilmiş embriyonik veya neonatal hücreler çalışırken kalp melanosit etiketlemek için bir işaretleyici kullanmak önemlidir. Izolasyon basamağı, gittiğinde Şekil 1A'da gösterildiği gibi, atriyal miyositlerde ve kardiyak melanosit oldukça büyük bir sayı, sadece bir kaç yapışkan olmayan hücreleri ile laminin kaplı çanak yapışacaktır. Bu durumda, yapışan hücreler tabak (sarı ok uçları Şekil 1A, ok başı) alt düz görünür. Öte yandan, ne zaman, durudure iyi çalışmaz hücrelerinin en yapışmayan olacak ve genellikle küresel bakmak ve (açık mavi ok uçları, Şekil 1A) yuvarlanır.
İzole edilen hücreler, yeşil floresan görüntüleme kullanılarak görünür hale getirilir, bu kalp melanositler ve hücreler, atriyal miyositler (Şekil 1) hangi hücrelerin açıktır. (3.9 adım), protokol, yukarıda belirtildiği gibi, daha büyük olan fibroblastlar atriyal ve kardiyak miyositleri melanosit peletleri, ama daha küçük, kalp fibroblast aşağı getirmez düşük kuvvetli santrifüj kullanılarak izole edilmiş atriyal hücreleri havuzundan kaldırılır. Taze izole edilmiş hücreler hemen tek bir hücre elektrofizyolojik kayıtları ile (Şekil 2), tek bir hücre RNA analizi ya da biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir.
Biz de kültürlü ve 21 güne kadar bu protokol kullanılarak izole neonatal veya embriyonik atriyal hücreleri yapılmaktadır. Bu tarif edilen kültür koşulları kullanılarakatriyal miyositler çanak ayırmak ve izole sonra 2-3 gün içinde ölürler eğiliminde iken protokol, kalp melanosit-benzeri hücreler daha, farklılaştırmak ve çoğalacak. Bir yenidoğan fare kalp izole edilmiştir 5 gün sonra sağlıklı kalp melanosit Şekil 3A gösterilmiştir. (Şekil 1 'de gösterilen yeni izole edilmiş hücrelere karşıt olarak), bu hücreler etrafında herhangi bir atriyal miyositlerin olmaması dikkat edin. Buna ek olarak, bu kalp melanositler geniş dendritik işlemler geliştirmiştir ve aynı zamanda yakından, aynı gün sayısı (Şekil 3B) boyunca kültür edilmiş deri melanositleri benzer var.
Şekil 1. Temsilcisi (A) DIC ve (B) taze i GFP görüntüleriembriyonik (E19.5) den zoleli atriyal hücreler Dct-Z / EG fare yavru. Beyaz ok Her iki panelde de kardiyak melanosit tanımlar. Flüoresan işaretleyici yardımı olmaksızın, kalp melanosit belirlemek ve çanak bağlı atriyal miyositlerde (sarı ok başları) ayırt edilmesi zor olduğuna dikkat edin. Açık mavi ok uçları iyi çanak bağlı olmayan atriyal hücrelere işaret.
Şekil 2. DCT - / -, kalp, melanositler olarak, uzun süreli hareket potansiyeli süresini göstermektedir. (A) kalp DCT +/- ve (B) kalp DCT Cari kelepçe kayıtları - / - hücreler DCT yokluğunda aksiyon potansiyeli süresini arttı gösterirler. - / - Hücre bir dinlenme potansiyeline sahiptir Dct ederken Dct +/- hücrenin dinlenme potansiyeli, -62 mV-60 MV. Levin ve ark gelen, izni ile, yeniden basılmıştır. , J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Şekil 3. izole edilmiş (A) Örnek görsel kalp melanosit-benzeri hücreler ve (B) deri melanositleri. Melanositler, sırasıyla kalplerinde ve yeni doğan farelerin (P1) derisi, izole edilir ve daha sonra 5 gün süreyle kültüre edildi.
Şekil 4. Dct ifade hücreleri kalp doldurmak. E13.5 fare kalp In situ melezleşme (A), DCT ifadesini gösterirPulmoner ven os (açık ok) etrafında (dolu oklar). Pulmoner venler içindeki Dct-pozitif hücreler (ok başları) (B) Immunofluorescent boyama. Bir fare e16.5 DCT-LacZ, kalp (oklar) arka atriyumda DCT-pozitif hücre (C) X,-gal boyaması. Foramen ovale, koroner sinüs os ve vena kava bölgelerinde RA septum boyunca E17.5 Dct-LacZ fare kalbinde (D) X-gal boyama; İçerlek ölçekli = 500 mikron. Bir DctCre +/- ve R26R fare geçiş kaynaklanan (E) Yetişkin fare (p60) pulmoner venlerin ve sol atrium içinde LacZ pozitif hücreler (oklar) göstermektedir. Ameliyatla çıkarılmış insan pulmoner ven endotel üzerinde imüno-floresansı (oklar) tarafından tespit edilen (F) DCT-pozitif hücreler. Paneller hariç Ölçek tüm panellerde = 500 mikron (B ve D, ölçek = 100 mikron) ve panel (F, ölçek = 50 mikron). Kısaltmalar: PV, pulmoner ven; LA, atrium sol; Ao, aort; PA, pulmokoroner arter; RA, sağ atrium; VKİ, vena kava; FO, foramen ovale; CS, koroner sinüs. Levin ve ark gelen, izni ile, yeniden basılmıştır. , J. Clin. Invest. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyak melanosit sık atriyal aritmi tetikler doğuran kalp içindeki anatomik yerlerde bulunurlar. Bu bölgeler pulmoner venler, atriyoventriküler halkasını, posterior sol atrium ve foramen ovale (Şekil 4) içerir. Bu hücreler aritmogenez oynadıkları rolü anlamak için, onları tecrit ve fizyolojisini incelemek için teknikler geliştirmek. Ancak, biz bu tekniği geliştirerek kalp melanosit sağlıklı ve daha büyük miktarlarda eksojen uyaranlara kardiyak melanosit yanıtını araştırmak için daha fazla çalışmaları imkan verecek verim tanıdı. Ayrıca, geliştirilmiş izolasyon teknikleri de normal fizyoloji ve hastalık sırasında atriyal miyositler ile kalp melanosit etkileşimi araştırmak için çalışmalar izin verebilir.
Bu kağıt biz Isol amacıyla tasarlanmış bir protokol geliştirilmiş fare kalpten canlı melanosit benzeri hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanırcilt melanosit yedik. Bu protokol kritik adım, kalpten melanosit-benzeri hücreler çıkarmaktır. Yenidoğan kalpleri kardiyak melanosit tecrit nedeniyle interstisyel fibrozis artan miktarda olgun kalp kardiyak melanosit ayıklanması, oldukça yalındır çok daha zordur. Bu protokolde olgun kalpten melanosit benzeri hücreleri çıkarmak için tripsin sindirimi kullanılır. Biz tripsin, kolajenaz ve dispase çeşitli konsantrasyonlarda oluşan birçok farklı enzimatik kombinasyonu test edildiğinde, bu protokol geliştirmek.
Bu, tripsin tarafından (bir sonraki 15 dakika boyunca) ve ardından (ilk 30 dakika boyunca) kollagenaz oluşan bir kombinasyon ile tedavi edilmesi, ilk yenidoğan kulakçığının melanosit-benzeri hücrelerin yüksek verimler azalttığını, ancak izole edilen hücreler, canlılığı azalmış daha az sağlıklıydı. Öte yandan, tek başına tripsin ile sindirme m, sağlıklı melanosit-benzeri hücrelerin bir sayıya üretilirature fare kalpleri. Bu nedenle, sadece olgun kemirgen kalpleri melanosit benzeri hücreleri izole etmek için tripsin kullanmanızı öneririz. Buna ek olarak, kuvvetli bir şekilde olgun fare kalpleri ise tripsin hazmından sonra üretilen bulamacın öğütülerek uygun melanosit-benzeri hücrelerin verimini daha iyi olduğu bulundu. Biz tripsin kısmen membran kanalları veya yük taşıyıcıları sindirmek için potansiyele sahiptir bahsetmeliyiz ve yama kelepçe çalışmalar yaparken bu kanal yoğunluğu etkileyebilir. Biz tripsin sindirimi izole, olgun melanosit-benzeri hücrelerin akım yoğunluğu etkiler olmadığını belirlemek için titiz bir analiz yürütülen değil iken biz bu protokolü kullanarak gerçekleştirdik çalışmalarda akımlar veya aksiyon potansiyelleri üzerinde herhangi bir önemli etkileri fark yok.
Kardiyak melanosit benzeri hücreler morfolojik deri melanosit (Şekil 1 ve Şekil 3 <benzer kalbinde çok seyrek hücre popülasyonu (tüm atriyal hücrelerin az% 0.1) vardır/ Strong>). Aslında nedeniyle kalbinde bulunan nispeten daha az kalp melanosit vardır; yakın zamana kadar sadece tek hücre deneylerinin (yani yama sıkma kayıt veya tek hücre PCR) için bunları kullanmak mümkün olmuştur. Bununla birlikte, 20-30 yenidoğan, ya da 5-8 olgun kalpleri araya kardiyak melanosit büyük miktarlarda elde edilir ve bu yaklaşım bir immüno veya biyokimyasal analizler yapmak için doku yeterli miktarda üretir bulduk. Bunlar genellikle 15-20 mm yuvarlak yerleştirir izole edildikten sonra Buna ek olarak, murin kalp melanosit-benzeri hücrelerin sayısı göz önüne alındığında, düşük, teflon steril vakum yağı ile 35 mm tabaklar üzerinde ekler, bu hücrelerin verimini arttırmak için . Hücreler daha sonra, kaplama alanını azaltmak için uçlar arasına yerleştirilen ve bunların yoğunluğu artar edilebilir. Kullanma teflon da ekler bunların ayrılmasından sonra ve aynı zamanda kaplama süresi boyunca melanosit-benzeri hücrelerin canlılığını artırır.
Bazı kalp Melanocyte-benzeri hücreler, bu hücrelerin daha az farklılaşmış durumunu temsil ettiğine inanıyoruz iki kutuplu bir morfoloji aşağıdaki izolasyonu vardır. Ayrıca, izolasyon izleyen 3 gün boyunca, kalp hücreleri, melanositler kültür dentrit oluşturmaz başlar melanosit-benzeri fenotip daha farklılaşmasını uyarmaktadır görünüyor bulundu. Ayrıca, bu protokol, kültürde 10 gün muhafaza edilebilir olgun kalplerinden melanosit-benzeri hücreler sağladığı bulunmuştur. Ancak, çoğalan duracak ve yaşlanmış olabilir olgun kalpleri izole kültür melanosit benzeri hücrelerde 10 gün ötesinde. İzole ve kaplama kalp melanosit dışsal faktörlere fizyolojik tepkilerini değerlendirmek için bu tür RNA profilleme veya çalışmaları gibi, hücresel elektrofizyolojik analizi veya diğer moleküler / hücresel biyolojik analiz için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma VVPMDL için Sağlık ödülü R01 HL105734 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Sağlık Araştırma Kariyer Ödülü K08 HL094748 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, kısmen desteklenmektedir. VVP hibe 11IRG900384 tarafından desteklenen Amerikan Kalp Derneği'nin Yenilikçi Araştırmacı olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
