Summary
Omuriliğe (gen ve hücre) tedavilerin teslimat için kullanılan cerrahi teknik ve cihaz Kısa görsel açıklama. Bu teknik, hayvan içinde gösterdi ama tamamen çevrilebilir ve şu anda insan uygulaması için kullanılmaktadır olmasıdır.
Abstract
Bu, omurilik içine (gen ve hücre) tedavilerin teslim için cerrahi tekniği ve aygıt bir arada kompakt bir görsel bir açıklamasıdır. Tekniği hayvan gösterilmiştir iken, prosedür FDA onaylı ve şu anda ALS hastalarının omurilik içine kök hücre nakli için kullanılan olduğunu. FDA son derece karakterize edilen kemirgen modellerinde terapötik etkinlik üzerinde kanıtı prensip veri kabul ederken, büyük hayvanların kullanımı bir cerrahi prosedürün bir kombinasyon, bir cihaz, ve insan kullanımı için bir son tedavinin güvenli doğrulanması için kritik olarak kabul edilir . Boyutu, anatomi ve domuz omurga ve omurilik genel güvenlik açığı daha iyi bir model insan hesaplanmaktadır. Ayrıca, açığa ve manipüle omurilik hem de domuz da yara kapatma cerrahi işlem insan neredeyse ayırt edilemez. Biz sağlıklı domuz modeli hükümetlerinin faaliyetleri konusun temsil inanıyorumprosedürel emniyet çalışmada cal ilk adımı.
Protocol
1. Hayvan Kullanımı
Burada gösterilen Prosedürleri Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Yaklaşık olarak 15-20 kg ağırlığındaki dişi Göttingen minipigs kullanılır.
2. Anestezi
Hayvanlar ameliyat öncesinde yaklaşık 12 saat oruç vardır. Hayvan sedasyon ve indüksiyon intramusküler ketamin (35 mg / kg), Acepromazine (1.1 mg / kg), ve atropin (0.04 mg / kg) oluşan bir karışımla oluşur. Hayvanlar daha sonra entübe oksijen ve% 1-3 izofluran genel anestezi tutulur. Bu noktada geri ve her biri bir baş hayvan traş edilir. Anestezi derinliği veteriner personeli tarafından izlenir. , Interdijital kornea ve palpebral refleksleri, yanı sıra kalp ve solunum hızı, nabız oksimetre, dolaylı / doğrudan kan basıncı, end-tidal karbon dioksit ölçümleri ve kas tonusunu / zararlı uyarıcıya tepki olmaması derinliği izlemek için kullanılır Anestezi.
3. Konumlandırma
Hayvanlar ameliyathaneye alınır ve bir Jackson spinal cerrahi masaya hasta konumlandırma taklit etmek için tasarlanmış bir çerçeve özel bir yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir. Çerçeve karın ve göğüs ve buna epidural venöz kanama (Şekil 1) üzerindeki baskıyı minimize, bu nedenle karın ücretsiz asmak için izin verilmesi ve, hayvanın göğüs ve pelvis altına yerleştirilir ayarlanabilir askılar kullanır. Çerçeve de prosedürü 1 için omurganın dış immobilizasyon sağlar.
Buna ek olarak, hayvan vücut sıcaklığı ve sıvı idare ve ameliyat sırasında gerekli ilaç dağıtımı için kateterize bir marjinal kulak damar korumak için ısıtılmış bir yeniden sirküle eden ped üzerine yerleştirilir. Son olarak, cerrahi alan alkol ve Chlorhexadine veya Betadine solüsyonu ile prepped ve cerrahi örtüler cerrahi alanında yerleştirilir.
le "> 4. LaminektomiAn yaklaşık 10-15 cm cilt insizyonu yapılır ve paraspinal kaslar bilateral omurga kapalı disseke edilir. Daha sonra, bir sırt çok seviyeli laminektomi gerçekleştirilir. Üç omur örten C3-C5 veya L2-L4 segmentleri lamina ve spinöz süreçleri rongeurs ve cerrahi matkap kullanarak kaldırılır.
5. Spinal Derrick Yerleştirme
Biz Spinal Derrick omurilik 2-5 içine (gen ve hücre) tedavilerin teslimat için tasarlanmış cihaz arayın. Bu cihazın tasarım ve evrim ile ilgili ayrıntılı tartışma Riley ve ark., 2011 bulunabilir. 4
Hasta için aygıt sabitlemek için, perkütan mesaj birincil kesik üstünde ve altında 1 cm deri kesiklerle yerleştirilen ve birinci kesik üstünde ve altında lamina monte edilir.
Daha sonra, iki entegre retraktörlerin fo bağlıdırkesi yeri yukarıda ve aşağıda ur perkütan mesajları laminektomi uğramıştır omurga alana maruz.
6. Dural Açılış
Bir Woodson diş aracı yardımı ve 11 bıçak ile, 2.5 cm'lik kesi omurilik açığa dura aracılığıyla yapılır. Dura 4-0 Nurolon sütür kullanarak pial katmanı uzak yansır ve derin paraspinal kas sabitlenir.
Cerrahi köftesi açılış rostral ve kaudal uç yerleştirilir. Bunlar beyin omurilik sıvısı akışı için kısmi bir bariyer sağlamak ve aynı zamanda kabloya zarar vermeden enayiler yerleştirmek için cerrahlar için güvenli bir hedef sağlayabilir. İnsanlarda, cerrahi mikroskop büyütme altında, pial yüzeyi bu noktada disseke edilir. Teknik kısıtlamalar nedeniyle, bu prosedür gerekli ya da hayvanlarda mümkün değildir.
7. Omurilik Enjeksiyonlar ve Ek Enjeksiyon için Spinal Derrick Yanal Deplasmans
Enjeksiyon hemen önce, metil (125 mg, IV) 'ün bir bolus şişme omurilik önlemek için verilmiştir.
Bu noktada, bir platform ray sisteminin bağlı olduğu ve yan raylar uygun uzunlukta uygun şekilde ayarlanır. Gondol olduğunu 2 bar üst üzerine yüklenmiş ve Z sürücü üniversal mafsal üzerine monte edilir. Daha sonra, yüklenen kanül Microdrive üzerine yerleştirilir. Mikroenjeksiyon platform üzerinde üniversal eklem kullanarak, koronal ve sajital açıları spinal Enjeksiyonlar kanül takip yerleştirme yüzeyine dik bir yörünge sağlamak için ayarlanır. İğne dorsal kök giriş bölgesi (DREZ) buna göre medial konumlandırılmış. DREZ 3.5x cerrahi büyüteç büyütme altında tanımlanır ve bir noktada kord yüzeye bir dik yörünge <mediale 1 mm penetre olur.
İnsanlarda, bir pre-operatif MR izlenmesi ve değerlendirilmesi o sağlaroperatif planlama için f omurilik boyutları. Ayrıca, omurilik kalınlığı ventral boynuzu hedef derinliği belirlemek için ölçülür.
Süspansiyon pial temas 4 mm arasında bir derinliğe kaynaştırılmıştır. Ultem plastikten yapılmış bir flanş istenenden daha derin ilerleyen ikinci iğne önlemek için pia yüzeyi üzerinde bir durdurucu olarak hizmet vermektedir. İğne ucu hedef konumlandırılmış sonra, katı metal dış kol esnek tüp maruz bırakarak, yukarı çekilir. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğne kanülü enjeksiyon yolu kadar hücre reflü önlemek için ek bir 1 dakika süreyle yerinde bırakılır.
Bakımı biraz Microdrive reflünün veya rostro-kaudal ya ayarlayarak yüzey damar önlemek için alınır. Penetrasyon sitelerden bazıları kanama oluşabilir. Bu tür kanama karşılaşıldığında, mikro köftesi kanama ponksiyon üzerine yerleştirilir ve emme kanül penetr kanını emiyor onları uygulanıration site ve kordda birikmesini önlemek. Bu güvenilir koagüle kan sağlar. Doğrudan basınç olarak Koter önlenir.
Iğne çıkarılmasının ardından, stereotaksik aparat omuriliğin dorsal yüzeyinde görünür kan damarları önlemek için gerekli 2 veya 4 mm veya ayrılmış rostro-kaudal ekseni boyunca bir sonraki hedef siteye taşındı. Belirli bir yöntem önerilmiştir gibi bu işlem birçok defa tekrarlanır.
8. Yüzer Kanül
Dar çaplı özel bir infüzyon kanülü enjeksiyonlar için kullanılır. Kanül değişken uzunlukta, 30-gauge esnek borular silastik bağlanmış sabit uzunlukta bir 30-gauge iğne eğimli oluşur. Distal uç mikroenjektör bir pompaya bağlı olan bir Hamilton luer kilit ile donatılmıştır. Proksimal silastik hortumu 24-gauge sert dış kanülün içinde ensheathed olduğu enjeksiyon iğnesi flanş proksimal ucunda koltuklar. Bu flanş hem koltukdış kanül ve enjektör iğnesi için bir derinlik durağı olarak hizmet vermektedir. Her enjeksiyon için, tedavi edici bir süspansiyon, uygun hacim ile kaynaştırılmıştır bir dakika başına 5 ul bir oranda bir önceden kalibre edilmiş Minj-PD mikroenjektör pompa (TriTech Research, Inc, Los Angeles, CA) kullanılarak.
9. Kapatma
Tüm enjeksiyonlar yapıldıktan sonra, spinal Derrick hafifçe kaldırılır ve kesiler dört kat olarak kapalıdır. Dura su geçirmez bir moda, bir 4.0 Nurolon dikiş kullanılarak kapatıldı. 0 vicryl derin kas tabakası için kullanılır. Alınlık sonra su geçirmez bir şekilde de 0 Vicryl dikiş ile kapatılır. Dermal tabaka sonunda çalışan bir dikiş ile, 2.0 Vicryl ile kapatılır. Cilt kapatılması 3-0 naylon sütür kullanılarak tamamlanmıştır.
10. Kurtarma ve Ağrı Yönetimi
Hayvanlar 2 saat aşağıdaki anestezi kurtarma ekstübe ve izlenmektedir. Daha sonra, bireysel hayvanların c aktarılıryaş ve gıda tüketimi, dışkılama ve işeme için en az günde bir kez izlenir.
Ağrı yönetimi için, bir transdermal fentanil yaması (75 mcg) post-operatif analjezi üç gün boyunca hayvanların sırtında zımbalanır. Ayrıca, Buprenorfin (0.05 mg / kg, BID, IM) da yukarı operasyon sonrası üç gün için verilebilir.
11. Sonuçlar ve Örnek Çıktıları
Klinik ve davranış gözlemleri çalışma tasarımına göre nokta kadar ameliyat öncesi yapıldı ve daha sonra gün 1 ile 7 kaydedilir ve haftalık edilir. Davranışsal veriler önceden 6 açıklandığı gibi nörolojik morbidite değerlendirmek için toplanır. Duyu ön ve arka bacak ayak mekanik uyaran bir çekilme yanıt varlığı ya da yokluğu ile tespit edilir. -, 1 - arka bacaklarda Algılanabilir tonusu, hafif m Felç, hiçbir hareket 0: Motor fonksiyon Tarlov skoru (Tablo 1) aşağıdakiovement; 2 - arka bacak hareketleri, ama oturmak veya ayakta duramayan, 3 - stand ve fakat ataksik ve kısa süreler için yürümek becerisi; 4 - Komple kurtarma, normal motor fonksiyonu.
Işlem güvenliği operasyon öncesi baz dönmek için bir hayvan yeteneği belirlenir. Geçici nörolojik defisit çoğunlukla hayvanların ırk ve prosedür bağlı olarak bazı farklılıklar (enjeksiyon sayısı, diğer parametreler arasında) ile, post-operatif gün 1 ve 7 arasında çözmelidir. Kalıcı morbidite hayvanlar IACUC varsayılan bitiş noktası (Şekil 2) ulaşmak zaman çözmez kalıcı nörolojik defisitler ile tanımlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov Puan | |
| 0 | Felç, hiçbir hareket |
| 1 | Arka bacaklarda Algılanabilir tonusu, hafif bir hareket |
| 2 | Arka bacak hareketleri, ama oturmak veya ayakta duramayan |
| 3 | Fakat ataksik ve kısa süreler için ayağa kalkmak ve yürümek yeteneği |
| 4 | Tam iyileşme, normal motor fonksiyon |
Tablo 1. Tarlov Puanını. Nörolojik morbidite ve kurtarma hayvanın motor fonksiyon puanlama değerlendirilir.
Procedur Şekil 1. Tablo Konumlandırmae. Hayvanlar Bir Jackson spinal cerrahi masaya hasta konumlandırma taklit etmek için tasarlanmış bir çerçeve özel bir yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir. Çerçeve karın karın ve göğüs ve buna epidural venöz kanama üzerindeki baskıyı minimize nedenle, ücretsiz asmak ve izin, hayvanın göğüs ve pelvis altına yerleştirilir ayarlanabilir askılar kullanır. Çerçeve de prosedürü için omurganın dış immobilizasyon sağlar.
Şekil 2. Motor Fonksiyon Değerlendirilmesi ve Örnek Çıktıları. Hayvanlar ameliyat öncesi ve prosedür tam iyileşme sonrası düzenli olarak genel bir nörolojik muayene. Yürüme ve motor fonksiyon Tarlov skoruna göre değerlendirilir. Bu ölçek bir surro olarak yürümelerine hayvanların yeteneğini değerlendirmede objektif kriterler sağlarmotor fonksiyon kapı ölçüsü. Işlem güvenliği operasyon öncesi baz dönmek için bir hayvan yeteneği belirlenir. Geçici nörolojik defisit çoğunlukla hayvanların ırk ve prosedür bağlı olarak bazı farklılıklar (enjeksiyon sayısı, diğer parametreler arasında) ile, post-operatif gün 1 ve 7 arasında çözmelidir. Kalıcı morbidite hayvanlar IACUC varsayılan bitiş ulaşmak zaman çözmez kalıcı nörolojik defisitler ile tanımlanır.
Tamamlayıcı
Hücre tedavileri, önce laminektomi ve anestezi altında, bir şahdamarı 10F kronik kateter (Erişim Teknolojileri, CCPS072106A) durumunda çalışma süresi için immunsupresanların intravenöz için yerleştirilir. Hayvanın boyun hazırlanması ve dökümlü edilir. Internal juguler ven cerrahi maruz kalan ve 3-0 ipek kravat ile güvence altına alınır kateter ile kanüle edilir. İç juguler proksimal sonun 3-0 ipek kravat ile bağlandı. Ardından, kateter dorsal boyun derisi üzerinden tünel ve 3-0 naylon dikiş ile güvence altına alınır. Son olarak, yara çalışan bir 3-0 naylon dikiş ile sulanan ve kapatılır. Böyle bir prosedür, insanlarda gerekli değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsanlarda 7-9 açıklanan tekniği ile devam etmek onayına rağmen, kritik sorulara başarılı spinal kord tedaviler için sırayla cevap beklemektedir. Intraparankimal enjeksiyon omurilik hoşgörü titiz bir anlayış, dejeneratif demiyelinizan ve travmatik omurilik hastalığı için tedaviler geliştirilmesi çalışmalarının planlama ve yürütme etkinleştirmek için gereklidir. Şu anda, büyük memeli omurilik geçici ve kalıcı morbidite tahammül enjeksiyonların sayısını belirgin bir anlayış mevcuttur. Benzer şekilde, enjeksiyon aralığı morbidite etkilemesi muhtemeldir. Ayrıca, makroskopik (örneğin, havalandırma ile ilgili veya kasıtsız hasta hareketi) ve mikroskopik (yani, havalandırma ve kardiyak nabız hem de salınım) spinal kord hareketleri enjeksiyon sırasında omuriliğe riskler oluşturabilir. Büyük bir hayvan modelinde morbidite için eşik anlaşılması yardımcı olacaktırTüm spinal kord terapi programları için hesaplamalar dozaj. Bizim translasyonel omurilik nakli laboratuar anda omurilik uygulaması için çalışmalar tasarlarken tüm takımların preklinik geliştirme programları yardım etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Boulis insan omurilik güvenli ve doğru bir enjeksiyon sağlamak için cihazların mucidi. Neuralstem, Inc bu teknoloji için özel bir lisans satın aldı. Dr Boulis Bu ücretin invento payı aldı, ve bu teknolojinin dağıtımı için telif ödemeleri haklara sahiptir. Diğer yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Biz veteriner bakımı için Hayvan Kaynakları personel Emory Üniversitesi Bölümü ederim. Finansman kaynakları şunlardır: ALS Derneği, Savunma Bakanlığı ve Neuralstem, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
