Summary
Ortotop levertransplantation hos råttor är en oumbärlig experimentell modell för biomedicinsk forskning. Här presenterar vi våra kirurgiska ingrepp för ortotopisk råtta levertransplantation med nedsatt arteriell rekonstruktion med hjälp av en 50% partiell transplantat.
Abstract
Ortotop levertransplantation (OLT) hos råttor med en helt eller delvis transplantat är ett oumbärligt experimentell modell för transplantation forskning, såsom studier av transplantat bevarande och ischemi-reperfusionsskada 1,2, immunologiska reaktioner 3,4, hemodynamiken 5,6 och liten för storlek syndrom 7. Råttan OLT är bland de svåraste djurmodeller in experimentell kirurgi och kräver avancerade mikrokirurgiska färdigheter som tar lång tid att lära sig. Följaktligen har användningen av denna modell begränsad. Eftersom tillförlitlighet och reproducerbarhet av resultat är viktiga komponenter i de experiment där sådana komplexa djurmodeller används, är det viktigt för kirurger som deltar i råtta OLT att utbildas i väl standardiserade och sofistikerade rutiner för denna modell.
Medan olika tekniker och modifieringar av OLT hos råttor har rapporterats 8 sedan den första modellen var som beskrivered av Lee et al. 9 1973, avskaffandet av den hepatiska arteriell rekonstruktion 10 och införandet av manschetten anastomos tekniken av Kamada et al. 11 var ett stort framsteg i denna modell, eftersom de förenklade återuppbyggnaden förfaranden i hög grad . I modellen av Kamada et al. Var hepatiska rearterialization också elimineras. Eftersom råttor kunde överleva utan lever arteriell flöde efter levertransplantation, det fanns betydande kontroverser över värdet av nedsatt arterialization. Däremot har den fysiologiska överlägsenhet arterialized modell blivit allt erkänns, särskilt när det gäller att bevara gallgången systemet 8,12 och levern integritet 8,13,14.
I den här artikeln presenterar vi detaljerade kirurgiska ingrepp för en råtta modell av OLT med nedsatt arteriell rekonstruktion med hjälp av en 50% partiell transplantat efter ex vivo lever resecning. Återuppbyggnaden förfaranden för varje fartyg och gallgången utförs av följande metoder: en 7-0 polypropylen kontinuerlig sutur för supra-och infrahepatic hålvenen, en manschett teknik för portvenen, och en stent teknik för nedsatt artär och gallgången.
Protocol
1. Grundläggande tekniker och gemensamma förfaranden
- Alla förfaranden utförs under rena men osterila förhållanden.
- När buken hos råtta öppnas, alla procedurer utförs under en kirurgisk mikroskop vid en förstoring av 16x. Undantag är ex vivo leverresektion, som utförs vid 10x och följande procedurer, som utförs vid 25x: införande av en stent i gallgången och levern artär, och återuppbyggnaden av den hepatiska artären, den infrahepatic hålvenen (IHVC), och gallgången.
- Bomullstoppar används för varsam manipulering av organ, trubbig dissektion av vävnader, och komprimering hemostas. Gauze bomullstoppar (5 x 5 cm) indränkta med lakterad Ringers lösning används för att dra tillbaka levern eller tarmarna, och att hålla organ fuktig. Den Satinsky Klämman kan användas för indragning av gasväv täckta tarmar åt vänster eller svansen hos råttan att vidga det kirurgiska området runt IHVC.
- Samtliga ligeringar utförs med en 6-0 silkestråd undantag för pediklar av lever lober under ex vivo leverresektion, där 4-0 silke trådar används. Den ligatur kan dras av en DeBakey Bulldog klämma eller andra instrument för att ge tillräcklig spänning till den ligerade punkt så att den andra ligaturen kan göras på ett avstånd till den första, och fördelningen mellan de två ligerade punkter kan göras på rätt sätt.
- Samtliga intravenösa injektioner utförs genom penis ven.
- Under återuppbyggnaden förfaranden för suprahepatic vena cava (SHVC), portalen ven, i levern artär, och gallgången, en liten klump av oljebaserad lera används för att hålla ett finger ring av en perifer vaskulär klämma eller en mygga pincett att hålla dem fast i läge.
2. Presurgical Förberedelser
- Lewis-hanråttor vägande mellan 230 och 250 g används som donator och mottagare för levertransplantation. Råttorna är allaskyldig fri tillgång till vatten och mat till induktion av anestesi.
- Manschett för portvenen (Figur 1): Förbered manschetten för portvenen genom att skära en 14-gauge kateter med en nr 11 skalpellblad under mikroskop. Manschetten består av en kropp och en förlängning, vardera med en längd av 2 mm. Gör omkretsspår på manschetten genom att klämma väggen hos manschetten stegvis periferiellt med en mygga pincett så att en tråd kan fästas tätt på manschetten utan att glida av.
- Stent för gallgången och hepatisk artär (figur 1): Cut 24-gauge katetrar med en skalpell under mikroskop för att producera avfasningar vid båda ändarna av katetrar med en längd av 4 mm för den hepatiska artären och 5 mm för gallgången .
3. Donator Drift
Schemat för avlägsnande av levern från givaren råtta visas i figur 2. Denna procedur kräver cafär 30-35 min.
- Söva råttan med inhalation av 4 vol-% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 4 liter / min för induktion av anestesi, och 1,5 vol% vid 2 L / min för underhåll. Injicera buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som ett analgetikum. Placera råttan på en värmedyna och fixa överarmarna med det magnetiska fixator indragning (figur 3a). Raka päls från hela buken hos råtta, och sterilisera motsvarande huden med en povidon-jodlösning.
- Öppna buken med en mittlinjesnitt med bilaterala förlängningar. Placera en 5-ml spruta under baksidan av råttan, så att SHVC höjs ventralt. Med hjälp av en mygga pincett, klämma och dra xiphoid processen mot huvudet, och tillämpa subcostal upprullningsdon att öppna kirurgiska området (figur 3a).
- Dissekera falciform ligament och vänster triangulär ligament. Därefter ligera och dela den vänstra phrenic venen.
- Retragera median och vänster laterala lober uppåt med en våt gasväv tops. Med hjälp av bipolära pincetter, koagulerar och dela para-esofageal fartyg mellan den vänstra laterala och främre caudatus lob.
- Flytta tarmarna utanför buken på den vänstra sidan av råttan, och täck dem med en våt gasväv tops. Dra tillbaka den högra laterala loben uppåt med en våt gasväv tops. Isolera IHVC från den retroperitoneala vävnaden, och ligera den högra adrenal venen, som delas senare precis innan transplantatet avlägsnas.
- Om du vill infoga en stent i gallgången (figur 3b):
- Ligera gallgången vid nivån för den förgrening av den gastroduodenala artären. De mjuka vävnaderna som omger gallgången bör bevaras så mycket som möjligt, och separationen av gallgången från den hepatiska artären bör undvikas för att säkerställa tillräcklig arteriella blodtillförseln till gallgången.
- Med raka mikro sax, gör ett litet snitt i anterieller vägg av gallgången proximalt till den ligerade punkten. Håll den främre väggen av snittet med en rak micro tång i vänster handen in en stent i kanalen med hjälp av en krökt mikro pincett i höger hand och fäst den med en 6-0 silkestråd. En av de skurna ändarna av tråden på gallgången hålls vid en längd av 4 mm, så att tråden kan hållas under senare anastomos.
- Befria portvenen från pyloriska och mjälten vener genom ligering och dela dem.
- Ligera och dela gastroduodenala artären och sedan isolera den gemensamma nedsatt artär (CHA) från bukspottkörteln huvudet till dess rot. Vrid levern till höger med bomullstoppar, och dissekera ligamentet runt baksidan av levern och matstrupen.
- Vid slutförandet av förberedelserna för lever excision, ta bort upprullningsdon, mygga pincett för xiphoid processen och den 5-ml spruta under baksidan av råtta. Återgå tarmarna till abdominaL hålighet.
- Injicera 500 lU av Heparin-Natrium i 2 ml normal saltlösning genom penis ven. Ca 3 min senare återställa 5-ml spruta, mygga pincett och upprullningsdon. Ligera CHA proximala till dess rot. Håll en av de skurna ändarna av tråden ligerades under CHA länge.
- Efter fastspänning av IHVC nära den högra njurvenen med en mygga tång, klämma portvenen med en disponibel mikro fartyg klämma under stubben av mjälten ven. Incise den främre väggen av portalen ven, och sätt en 18-gauge kateter in i portvenen.
- Perfundera levern in situ med 60 ml kall histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) lösning vid ett hydrostatiskt tryck av 20 cm H 2 O Omedelbart därefter skära membranet och transekt den intratorakala vena cava och skär den främre väggen av IHVC öppen så att perfusion lösningen sköljas ur levern (Figur 3c).
- Kläm fast IHVC med en disposable mikro kärl klämma strax nedanför levern. Excise levern genom att dissekera den IHVC något under mittpunkten mellan levern och rätt njurvenen, portalen ven under stubben av mjälten ven, membranet, de övriga ligament på baksidan av levern, den högra binjure ven, och CHA vid dess rot. Placera utskurna lever i kallt HTK lösning i en metall kopp monterad i en plast låda full av krossad is.
4. Ex vivo Graft Beredning
Alla förfaranden för levern transplantat utförs i metall kopp fylld med iskall HTK-lösning. Ex vivo transplantat förberedelse kräver ca 30 min.
- För fastsättning av en manschett till portvenen (Figur 4):
Kläm portalen venösa stammen med en DeBakey Bulldog klämma. Placera klämman i en överbryggande läge över koppen (figur 4a, b). Sätt portvenen genom manschetten, och klämmaportvenen igen tillsammans med förlängningen av manschetten vid klockan 12 (figur 4c). Evert väggen i portalen ven under manschetten för att placera stubben av mjälten ven utanför manschetten vid 7 klockan (figur 4d) och säkra portvenen med 6-0 silkestråd (figur 4e) . - Om du vill infoga en stent i den hepatiska artären (figur 5):
Fäst levern genom att klämma båda kanterna av membranet med pincett och dra CHA rakt genom att hålla ligerade tråden med DeBakey Bulldog klämman (figur 5a). Med raka mikro sax, gör ett litet snitt i den främre väggen av CHA. Med vänster hand, håll den främre väggen av snittet med en rak mikro tång, och med höger hand, sätter en stent in i CHA med en krökt mikro pincett. Stenten är tidigare tvättas med heparin-Natrium-lösning (100 lU / ml) (figur 5b-d). Secure stenten med en 6-0 silkestråd, och hålla en av de skurna ändarna av tråden vid en längd av 4 mm. Spola levern genom den arteriella katetern med 5 ml kall HTK lösning. - För 50% leverresektion (Figur 6):
- Kläm den bakre caudatus loben med en mygga pincett för att fixa det på plats. Resekera loben efter ligering av sin pedikeln med en 4-0 silkestråd (figur 7a). På samma sätt, avlägsna den främre loben caudatus.
- Rotera plastlåda 90 grader. Kläm den högra kanten av membranet och den vänstra delen av medianinkomsten lob. Gör ett litet snitt vid den övre kanten av gränsen för de bilaterala delarna av medianen lob, och ta sedan bort den vänstra delen efter ligering (figur 7b). Ta bort den vänstra laterala loben efter ligering av BLOMSTJÄLK med en 4-0 silkestråd. Kauterisera den resekerade levern ytan noggrant med bipolära pincetter. Som ett resultat, är levern massan minskas med enpproximately 50% 15 (figur 7c, d).
- För plastik av SHVC (Figur 8):
Fixera positionen av levern genom fastklämning båda kanterna av membranet med en mygga tång (figur 8a). Trimma främre vägg SHVC genom att ta bort motsvarande membranet. Fäst två 7-0 polypropen suturer från utsidan till insidan på båda hörnen som stannar suturer för senare anastomos (figur 8b). Sedan trimma den bakre väggen hos SHVC. - Förvara levern transplantatet vid 4 ° C i HTK lösning i ett kallt vattenbad.
5. Mottagare Drift
Schemat av transplantatet implantation i mottagaren råtta visas i figur 9. Mottagaren operationen kräver 60-70 minuter, vilket inkluderar 10-11 minuters anhepatic tid och cirka 23-24 min av IHVC fastspänning tid.
- Utför samma förfaranden som i DOeller drift (3,1-3,4) med undantag för öppnande av buken med en mittlinjen snitt, utan bilaterala förlängningar (Figur 10a).
- Placera en våt gasväv pinnen över den högra sidan av duodenum och hela tarmar för att erhålla ett kirurgiskt område runt IHVC. Sätt vänster laterala och medianen lober i den vänstra subrenala kaviteten, och dra den högra laterala loben uppåt med en våt gasväv tops. Isolera IHVC från retroperitoneal vävnad. Ligera och dela den högra adrenal ven (figur 10b). Med en våt gasväv och bomull kompresser, vrid levern till vänster, och dissekera ligament runt baksidan av levern.
- Avkastning rätt laterala loben till det anatomiska läget. Placera en våt gasväv bomullstopp för att täcka och dra median och vänster laterala loberna uppåt. Transekt gallgången strax under grenen från caudatus lob. De mjuka vävnaderna som omger gallgången bör bevaras så mycket som möjligt. Håll en av de skurna ändarna av THLäs ligeras för gallgången vid 4-mm lång.
- Ligera och dela gastroduodenala artären och rätt nedsatt artär i en 3-mm avstånd till förgrening från CHA. Därefter gör en Y-struktur av artären vid slutet av CHA. Håll en av de skurna ändarna av tråden ligerades för korrekt arteria hepatica vid 4-mm lång. Vrid levern till höger med bomullstoppar, och dissekera ligamentet runt baksidan av levern från den vänstra sidan.
- Efter intravenös injektion av 2 ml av lakterad Ringers lösning, klämma IHVC med en metall mikro kärl klämma precis ovanför den högra njurvenen. Kläm portvenen i nivå med sin bifurkation i leverhilus av en mygga tång från den vänstra sidan av råttan. Kläm fast SHVC tillsammans med membranet från den högra sidan av en perifer vaskulär klämma, och fixera finger ring av klämman i en klump av oljebaserad lera.
- Minska anestesi med isofluran till 0,4 vol% under anhepatic tid (hur längeav gränsöverskridande fastspänning av portalen ven). Excise mottagaren infödda levern genom att dissekera den SHVC, portalen ven och IHVC på följande nivåer: SHVC, vid gränsen mellan SHVC och levern, och portalen ven, strax ovanför käken av mygga pincett, och den IHVC, något under mittpunkten mellan levern och den högra njurvenen (Figur 10c). Placera levern transplantat ortotopiskt.
- För anastomos av SHVC genom en kontinuerlig sutur (Figur 11):
- Använd en krökt mikro tång i vänster hand under suturering förfarandet för att ta tag i kärlväggen eller håller suturering nålen. Placera först vistelsen suturen på mottagarens SHVC från insidan till utsidan med hjälp av bifogade 7-0 polypropylen i högra hörnet av transplantatet följt av att knyta en knut (eller så kan du knyta den efter alla sy förfaranden är komplett). Placera sedan andra vistelsen sutur på samma sätt på vänster majser, som kommer att vara utgångspunkten stygn av en löpande sutur. Att bredda anastomos, gripa och hålla suturer med DeBakey bulldog klämmor i båda hörnen med mild dragkraft superiolaterally (Figur 11a, b).
- Pierce suturen vid det vänstra hörnet genom väggen på transplantat sida från utsidan till insidan nära knuten utanför, och sy den bakre raden i SHVC intraluminalt med 7 till 8 stygn till höger (Figur 11c). Gör de första stygnen försiktigt så att insidan lumen står inför varandra. På höger, hål i 7-0 polypropylen genom kärlet på transplantat sidan till utsidan.
- Därefter sutur den främre raden från utsidan, från höger till vänster, med ca 10 stygn (Figur 11d). Innan slutförandet av den främre raden, spola insidan med Ringerlaktatlösning för att avlägsna luftbubblor. Gör det sista stygnet vid den främre raden så nära sommöjligt att vistelsen sutur vid det vänstra hörnet, och knyt ihop dem.
- För återuppbyggnaden av portalen ven av en manschett teknik (figur 12):
- Fäll in median och vänster laterala lober uppåt med en våt gasväv tops. Kläm venen mottagande portalen vid sammanflödet med pyloric venen med hjälp av en engångs mikro fartyg klämma från höger. Fäst mygga pincett som klämmer portvenen i leran, och dra spetsen av tången mot leverhilus (Figur 12a, b).
- Incise den främre väggen av portvenen strax nedanför käken av mygga pincett. Tvätta insidan av mottagarens portvenen och manschetten med lakterad Ringers lösning. Håll den främre väggen av snittet med en rak micro tång i vänster hand och en förlängning av manschetten med en svängd mikro pincett i höger hand. Sätt manschetten i den mottagande portådern djupt, och säkra den med enruntomgående 6-0 silkestråd (Figur 12c-f).
- Lossa klämmorna på portalen ven och SHVC och sedan reperfuse levern. Avlägsna 5-ml spruta från baksidan av råtta, och öka koncentrationen av isofluran till 0,8 volym-%.
- För återuppbyggnaden av den hepatiska artären med en stent teknik 16 (figur 13):
- Först, håll tråden hos mottagaren rätt arteria hepatica av en mygga tång från den vänstra sidan och dra den mot leverhilus och sedan klämma de mottagande CHA från höger nära bukspottkörteln (figur 13a).
- Med en rak mikro pincett, göra ett litet snitt i bifurkationen av Y-strukturen vid slutet av den mottagande CHA att göra en trattformad öppning. Håll stenten placeras i transplantat CHA med en böjd mikro pincett. Efter tvättning varje lumen med Heparin-Natrium-lösning (100 IE / ml), skjut stenten i reAdressaten CHA och fäst den med en 6-0 silkestråd. Bind ena änden av denna tråd på mottagaren CHA och 4-mm gänga på graftet CHA ihop så att båda Chas kommer närmare varandra med reducerad spänning anastomistället (figur 13b). Efter det släpper klämman.
- För anastomos av IHVC genom en kontinuerlig sutur (figur 14):
Anastomose på samma sätt som för SHVC, men använda fler maskor med finare bita (Figur 14a-d). Kopplingsförbehåll av suturerna vid det sista stygnet kan elimineras, eller kopplande kan åstadkommas med en tillväxtfaktor för att undvika den anastomotiska förträngningen orsakas genom att binda alltför hårt. Efter declamping, öka koncentrationen av anestesi till 1,0 volym-%. Om anastomos ser stenotiska, vidga anastomistället genom att dra de bilaterala vistelse suturer eller bredda den främre raden försiktigt för att expandera anastomos. - Administrera 0,5 ml 8,4% natriumbikarbonat solution med 1,0 ml lakterad Ringers lösning intravenöst.
- Applicera små fragment av TachoSil att försegla resekerade lever yta för att förhindra blödning och gallan läckage.
- För återuppbyggnaden av gallgången med en stent teknik:
- Håll tråden hos mottagaren gallgången av en mygga tång från den vänstra sidan. Fäst mygga pincett i leran, och dra spetsen av tången mot leverhilus.
- Gör ett litet snitt i gallgången på lämplig nivå så att den rekonstruerade gallgången inte skulle vara för lång. Sätt stenten placerats i transplantatet gallgången i mottagarens kanal med noggrann uppmärksamhet för att undvika en twist, och säkra den med en 6-0 silkestråd. Knyt denna tråd på mottagarens kanal och 4-mm gänga på transplantat kanalen tillsammans så att båda kanalerna kommer närmare varandra med reducerad spänning anastomistället.
- Vid slutet av återuppbyggnaden förfaranden injicera 1 ml 5% glukoslösning intravenöst (Figur 15).
- Bekräfta adekvat hemostas, och stäng sedan buksnitt genom kontinuerliga 4-0 Vicryl suturer i två lager.
6. Postoperativ behandling och uppföljning
Omedelbart efter operationen, behandla mottagaren råtta med en subkutan injektion av cefuroxim natrium (16 mg / kg) och buprenorfin (0,1 mg / kg) i totalt 1,5 ml normal saltlösning. Låt råttan att återhämta sig under 60 min i en särskild intensivvårdsavdelning bur med uppvärmd luft (30-35 ° C) och en syretillförsel. Injicera buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som ett analgetikum var 12: e timme under 3 dagar. Efteråt flytta råttan till en normal bur, och ge tillgång ad libitum till vatten och mat.
Representative Results
Alla mottagare råttor (n = 20) överlevde utan uppenbara komplikationer tills planerad dödshjälp för blodprovstagning vid 1, 3, 24, och 168 timmar (7 dagar) efter portal reperfusion (n = 5 vid varje tidpunkt). Blodproverna uppsamlades från IHVC genom en direkt punktion med en 27-gauge nål. Efter centrifugering vid 5.340 xg under 10 minuter, togs serumproverna erhålls och analyseras för alaninaminotransferas (ALT)-nivåer, som återspeglar graden av hepatocellulär skada efter transplantation. Tidsförloppet av förändringar i serum ALT-nivåer visas i figur 16. De ALAT-nivåer nådde en topp på 24 timmar (medelvärde ± standardavvikelse: 212,6 ± 67,9 IE / L) och minskade sedan till inom normala gränser vid 168 timmar (33,6 ± 6,8 IE / L).
Figur 1. En manschett för portalen ven (PV) från en 14-gauge kateter, och stentar för den hepatiska artären (HA) och gallgången (BD) från 24-gauge katetrar.
Figur 2. Schema för avlägsnande av levern från donatorn råtta BD, gallgång,. HA, lever artär, IHVC, infrahepatic hålvenen, PV, portvenen, SHVC, suprahepatic hålvenen.
Figur 3. Donator drift. en. Råttan placeras på en värmedyna med en magnetisk fixering indragning systemet. Buken öppnas genom en mittlinjesnitt med bilaterala förlängningar.. B. Insättning av stenten i gallgången. C.. Perfusion av levern genom portvenen. Förkortningar är förklaraed i figur 2.
Figur 4. Fastsättning av en manschett till portvenen. a, b. den DeBakey Bulldog klämma som griper portalen venösa stammen placeras över metall koppen. Koppen är monterad i plasten låda fylld med krossad is. C.. Portvenen sätts genom manschetten. D.. Väggen av portvenen vrängs över manschetten med stubben av mjälten ven utanför manschetten vid 7 klockan och en förlängning av manschetten vid klockan 12. e. Portalen ven är säkrad med en perifer 6-0 silkestråd på manschetten. De svarta pilarna anger stubben av mjälten venen.
Figur 5. Ex vivoinsättning av en stent i den hepatiska artären. en. Levern fixeras genom fastspänning båda kanterna av membranet, och hepatiska artären dras rakt genom att hålla tråden ligeras för artären.. b. Den främre väggen av litet snitt på hepatiska artären hålls med en rak micro tång . c, d.. Stenten införes i den hepatiska artären och fästes med en 6-0 silkestråd.
Figur 6. Schemat för ex vivo 50% leverresektion. Lobes i grå färg tas bort. ACL, främre caudatus lob, PCL, bakre caudatus lob, livslångt lärande, vänster lateral lob, LML, vänstra delen av medianinkomsten lob, RML, högra delen av medianinkomsten lob, SRL, överlägsen högra laterala loben, IRL, sämre högra laterala loben.
Figur 7. Ex vivo 50% leverresektion. en. Ligering av pedikeln den bakre caudatus lob. b.. Ligering av pedikeln av den vänstra delen av medianen lob. c.. Levern före 50% resektion. d.. Levern efter 50% resektion.
Figur 8. Ex vivo plastik av suprahepatic hålvenen. en. Levern fixeras genom fastspänning båda kanterna av membranet med mygga pincett. är fästa vid båda hörnen b. Stay suturer med 7-0 polypropen.
Figur 9. Schema för transplantatet implanteras i den mottagande råttan. Återuppbyggnaden förfaranden utförs för supra-och infrahepatic vena cava (SHVC och IHVC) med en 7-0 kontinuerlig sutur, portalen ven (PV) av en manschett teknik och lever artär (HA) och gallgången (BD) av en stent teknik.
Figur 10. Mottagare drift till avlägsnandet av det ursprungliga levern. en. Buken öppnas genom en mittlinje snitt. b.. Rätt adrenal venen ligeras.. c. Personen lever skärs. Förkortningar förklaras i figur 2.
Figur 11. Anastomos av suprahepatic hålvenen. a, b. Är den perifer vaskulär klämma för suprahepatic hålvenen fast i en klump av oljebaserad lera. Vistelsen suturer på båda hörnen upprätthålls med mild dragkraft superiolaterally att vidga anastomos.. C. Kontinuerlig intraluminal sutur av den bakre raden pågår. D.. Kontinuerlig sutur av den främre raden pågår.
Figur 12. Rekonstruktion av portvenen. a, b. mygga tång fastspänning portvenen fixeras i oljebaserade lera och drog mot leverhilus.. CF Införande av manschetten i portalen ven.
Figur 13. Rekonstruktion av den hepatiska artären. a, b. g> Infogning av en stent i mottagaren gemensamma arteria hepatica (CHA) vid bifurkationen av rätt arteria hepatica (PHA) och gastroduodenala artären (GDA).
Figur 14. Anastomos av infrahepatic hålvenen. en. vistelsen suturer på båda hörnen. b.. Kontinuerlig sutur av den bakre raden. c.. Kontinuerlig sutur av den främre raden. d.. Reperfusion av infrahepatic hålvenen. Förkortningar förklaras i figur 2.
Figur 15. Samtliga återuppbyggnaden förfaranden är klar. Förkortningar förklaras i figur 2.
"Figur 16" src = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" />
Figur 16 Postoperativ tidsförloppet för förändringar i serum (S-ALAT)-nivåer (n = 20, n = 5 vid varje tidpunkt).. Data uttrycks som medel med felstaplar som anger standardavvikelser. De ALAT-nivåer nådde en topp på 24 timmar (212,6 ± 67,9 IE / L) och minskade sedan till inom normala gränser vid 168 timmar (33,6 ± 6,8 IE / L).
Discussion
Den första modellen av rått OLT har rapporterats av Lee et al. 1973 9, där alla fartyg, inklusive den hepatiska artären rekonstruerades genom en handsydd metoden och den extrakorporeala portosystemic shunten användes. Denna modell var tekniskt komplicerat och svårt att utföra. Nästa modell var en utan lever arteriell rekonstruktion och extrakorporeala shunt, som utvecklats av samma författare 10 år 1975. Därefter i 1979, introducerade Kamada et al. Tekniken manschetten anastomos för modellen utan nedsatt rearterialization 11. Med dessa ändringar har OLT hos råttor förenklas med en förkortad anhepatic tid i mottagarländerna verksamhet och har i stor utsträckning använts som en accepterad experimentell modell.
Däremot har det skett en betydande kontroverser sedan över betydelsen av nedsatt arterialization i råtta OLT 8 eftersom arterialization var en krävande uppgift, men did inte påverka överlevnaden efter transplantation. Talrika studier på hepatisk arterialization använder olika återuppbyggnad tekniker har rapporterats 8, såsom en aortasegmentet till aorta anastomos 3,9,17, en manschett anastomos teknik 18,19,20, en teleskopisk teknik 5, en stent teknik 13, 16, och en hylsa anastomos teknik 12,21-23. Medan tekniken för råtta OLT fortfarande inte standardiserad i dag har arterialized modell har allt mer börjat i termer av dess fysiologiska överlägsenhet 8,12,13,14. Bland de ovan nämnda teknikerna har en stent teknik som var enkel och snabb att utföra rapporteras av Lehmann et al. 16 2005. Studien visade utmärkta resultat: ingen ocklusion kurs observerades i den rekonstruerade arteria hepatica vid 8 h, 24 h och 6 månader efter reperfusion. Vi antog därför denna teknik för nedsatt arterialization.
Vi prestandama handsydda anastomos för återuppbyggnaden av SHVC och IHVC. Denna metod ger anastomistället med en optimal fysiologiskt tillstånd, vilket leder till minskad förekomst av trombos 8, och är den bästa mikrokirurgi simulering och träning för kirurger. Dessutom kan anastomos vara möjlig även med korta fartyg stubbar. Beträffande anastomos av IHVC, kräver denna metod inte en lång IHVC på graftet sidan jämfört med manschetten anastomos tekniken. Därför, när givaren njurvenen dissekeras att transplantatet IHVC långa, är denna metod tillämpas på transplantation av en liten transplantat som kräver en lång IHVC, såsom en 30% transplantat som består av höger laterala och caudatus lober med en kort intrahepatisk hålvenen utan SHVC 2.
Beträffande metoder för leverresektionskirurgi hos råttor, hittills flera metoder har rapporterats, de två stora tekniker är den klassiska massan ligaturen teknikoch fartyget orienterad teknik 24. Vi utför den klassiska ligaturen teknik för 50% leverresektionskirurgi 15, men under ett kirurgiskt mikroskop för att göra förfarandet finare, och för att undvika skador på de återstående lober och strukturer.
Vi beskrev de representativa resultat från de mottagande råttor i vår modell, råttorna överlevde under 7-dagars observationsperioden utan uppenbara komplikationer. Modellen kan modifieras för olika ändamål av experiment genom att välja olika inställningar, till exempel långvarig kylförvaring, långvarig varm ischemi som inkluderar donation efter hjärtdöd, och användningen av mindre lever transplantat eller transplantat från experimentella modeller av leverskada eller sjukdomar.
Enligt vår erfarenhet finns det tre viktiga faktorer under de förfaranden som kan påverka överlevnaden efter transplantation, den mest tillförlitliga parametern för resultaten av råtta OLT: mängden blodförlust, drift tid, especiellt fastspänning tid av portalen ven och IHVC, och lämpligheten av återuppbyggnaden av varje fartyg, som skulle kunna leda till stenos, trombos eller blödning. Under en praktikperiod på denna modell skulle de flesta av misslyckanden troligen vara relaterad till dessa faktorer. I den här videon artikeln presenterar vi steg för steg-instruktioner för de kirurgiska ingrepp för vår råttmodell av partiell OLT med nedsatt arteriell rekonstruktion. Medan en råtta modell av OLT är komplicerad och kräver avancerade mikrokirurgiska färdigheter, ger den här artikeln mycket praktisk information, som bör fungera som en bra guide för utbildning och lärande av denna modell. Lära denna modell effektivt är särskilt viktigt för att förkorta den lärande tid, minska antalet djur och kostnader som behövs för praktik, och senare reproducera tillförlitliga resultat i experiment. Detta är i linje med 3R konceptet (ersättning, begränsning och förbättring) av djurförsök, som postulerade av Russell och Burch i1959 25.
Disclosures
Vi har inga motstridiga intressen att lämna ut. Råttorna blir förvarade under specifik patogenfria villkor enligt riktlinjerna för federationen för försöksdjursvetenskap Associations (FELASA). Alla experiment utfördes i enlighet med den tyska federala lagen om skydd av djur och "Guide för vård och användning av försöksdjur" (National Institutes of Health publikation nr 86-23, reviderad 1985).
Acknowledgments
Författarna tacka Pascal Paschenda och Mareike Schulz för deras hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Light source | Schott | KL1500LCD | |
| Cotton swabs | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| Gauze swabs (5x5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| povidone-iodine solution | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| Oil-based clay | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | Applied to resected liver surface |
| Scalpel blade No. 11 | Pfm medical | 200130011 | Preparation of cuff and stents |
| 14-gauge catheter | B. Braun | 4268210S | Cuff for PV |
| 18-gauge catheter | B. Braun | 4268130S | Perfusion via PV |
| 24-gauge catheter | B. Braun | 4269071S | Stent for BD and HA |
| 4-0 silk suture | Resorba | H3F | Liver resection |
| 6-0 silk suture | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene (polypropylene) suture | Ethicon | 8701H | SHVC and IHVC |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V304H | Abdominal closure |
| 5-ml syringe | Terumo | SS+T05ES1 | Back pillow |
| Heating pad | Thermo | 190 x 260 mm | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 |
|
| Cold water bath | Huber | 740.000X | Graft preservation |
| Bipolar forceps | Söring | MBC-200 | |
| Mosquito forceps | BONIMED | 451-476-03 | Two pairs used |
| Adson micro forceps | Dimeda | 10.176.12 | |
| Curved micro forceps | AESCULAP | FD281R | |
| Straight micro forceps | Bonimed | 451-476-03 | |
| Curved micro scissors | Medicon | 05.15.83 | |
| Straight micro scissors | AESCULAP | FD12 | Fine incision |
| Scissors | AESCULAP | BC211W | |
| Micro needle holder | AESCULAP | FD241R | Reconstruction |
| Mayor-Hegar Needle holder | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | Abdominal closure |
| DeBakey Bulldog clamp (straight) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey Bulldog clamp (curved) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky clamp | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| Peripheral vascular clamp | Teleflex Medical | 353494 | Recipient SHVC |
| Micro vessel clamp (disposable) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | PV, graft IHVC, and recipient HA |
| Micro vessel clamp (metal) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | Recipient IHVC |
| Lactated Ringer solution | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| Normal saline solution | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | Preservation solution |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | 500 IU before graft perfusion |
| 8.4% sodium bicarbonate | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 0.5 ml after reperfusion |
| 5% Glucose solution | B. Braun | 6714567.06.00 | 1.0 ml after reperfusion |
| Cefuroxim sodium | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | Antibiotic, 16 mg/kg |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Painkiller, 0.1 mg/kg |
| Intensive Care Unit Cage | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | Postoperative care |
References
- Puhl, G., et al. Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model. Liver Transpl. 12, 1841-1849 (2006).
- Yagi, S., et al. Improved Preservation and Microcirculation with POLYSOL After Partial Liver Transplantation in Rats. J Surg Res. 167, e375-e383 (2011).
- Engemann, R., Ulrichs, K., Thiede, A., Muller-Ruchholtz, W., Hamelmann, H. Value of a physiological liver transplant model in rats. Induction of specific graft tolerance in a fully allogeneic strain combination. Transplantation. 33, 566-568 (1982).
- Sumimoto, R., Shinomiya, T., Yamaguchi, A. Influence of hepatic arterial blood flow in rats with liver transplants. Examination of donor liver-derived serum class I MHC antigen in rats with liver transplants with or without hepatic arterial reconstruction. Transplantation. 51, 1138-1139 (1991).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49, 675-678 (1990).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26, 198-205 (1997).
- Zhong, Z., Theruvath, T. P., Currin, R. T., Waldmeier, P. C., Lemasters, J. J. NIM811, a mitochondrial permeability transition inhibitor, prevents mitochondrial depolarization in small-for-size rat liver grafts. Am. J. Transplant. 7, 1103-1111 (2007).
- Spiegel, H. U., Palmes, D. Surgical techniques of orthotopic rat liver transplantation. J. Invest. Surg. 11, 83-96 (1998).
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16, 664-669 (1973).
- Lee, S., Charters, A. C. 3rd, Orloff, M. J. Simplified technic for orthotopic liver transplantation in the rat. Am. J. Surg. 130, 38-40 (1975).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47, 428-431 (1989).
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56, 19-24 (1993).
- Zhao, D., Zimmermann, A., Wheatley, A. M. Morphometry of the liver after liver transplantation in the rat: significance of an intact arterial supply. Hepatology. 17, 310-317 (1993).
- Omura, T., Ascher, N. L., Emond, J. C. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 292-293 (1996).
- Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation--development of a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl. Int. 18, 56-64 (2005).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 582-587 (1996).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45, 830-832 (1988).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48, 166-168 (1989).
- Knoop, M., Bachmann, S., Keck, H., Steffen, R., Neuhaus, P. Experience with cuff rearterialization in 600 orthotopic liver grafts in the rat. Am. J. Surg. 167, 360-363 (1994).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48, 1080 (1989).
- Liu, T., Freise, C. E., Ferrell, L., Ascher, N. L., Roberts, J. P. A modified vascular "sleeve" anastomosis for rearterialization in orthotopic liver transplantation in rats. Transplantation. 54, 179-180 (1992).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22, 62-68 (2002).
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28, 3-11 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. Ltd. London. reprinted by UFAW (1992).
