Summary
Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.
Abstract
El proceso por el que la región anterior de la placa neural da lugar a la retina de vertebrados sigue siendo un foco importante de investigación tanto clínica como básica. Además de la evidente importancia médica para la comprensión y el tratamiento de enfermedades de la retina, el desarrollo de la retina de vertebrados continúa sirviendo como un importante sistema modelo y elegante para la comprensión neuronal determinación de tipo celular y la diferenciación 1-16. La retina neural consta de seis tipos de células discretas (ganglio, fotorreceptores amacrinas, horizontal,, células bipolares, y las células gliales de Müller) dispuestas en capas estereotipadas, un patrón que es muy conservada entre todos los vertebrados 12,14-18.
Si bien el estudio de la retina en el embrión en desarrollo está intacto claramente necesaria para la comprensión de cómo este órgano complejo se desarrolla a partir de una protuberancia del cerebro anterior en una estructura en capas, hay muchas preguntas que benefician from empleando métodos que utilizan cultivos celulares primarios de presuntas células de la retina 7,19-23. Por ejemplo, el análisis de las células de los tejidos y se disocia en diferentes etapas permite discernir el estado de la especificación de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, es decir, el destino de las células en la ausencia de interacciones con los tejidos vecinos 8,19-22 ,24-33. Cultivo de células primarias también permite al investigador para tratar el cultivo con reactivos específicos y analizar los resultados en un nivel de célula única 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un sistema modelo para el estudio clásico de desarrollo neural temprano 19,27,29,31-32,40-42, sirve como un sistema particularmente adecuado para el cultivo de células primarias de retina 10,38,43-45.
Tejido de la retina presuntiva se puede acceder desde las primeras etapas de desarrollo, inmediatamente después de la inducción neural 25,38,43. Además, dado then cada célula en el embrión contiene un suministro de yema de huevo, células de la retina pueden ser cultivadas en un medio de comunicación muy simples definidos que consisten en una solución salina tamponada, eliminando así los efectos de confusión de incubación o de otros sueros de los productos basados en 10,24,44-45 .
Sin embargo, el aislamiento del tejido de la retina de los tejidos circundantes y el posterior procesamiento es un reto. Aquí, se presenta un método para la disección y disociación de las células de la retina en Xenopus laevis que se usa para preparar cultivos de células primarias que, a su vez, se analizó la actividad de calcio y la expresión génica en la resolución de las células individuales. Si bien el tema presentado en este documento es el análisis de los transitorios de calcio espontáneos, la técnica es ampliamente aplicable a una amplia gama de temas de investigación y enfoques (Figura 1).
Protocol
Todos los experimentos se llevan a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Colegio de William y Mary. Etapas de desarrollo hace referencia en este protocolo son de acuerdo a Nieuwkoop y Faber 46.
1. Disección
- Permitir que el medio de cultivo celular y medio libre de calcio magnesio (CMF) se equilibre a temperatura ambiente. Usted también necesitará Modificado 0,1 X de Marc Ringer (MMR) pH 7.4-7.6.
- Esterilizar los siguientes elementos mediante la aplicación de una luz UV durante 30 min en una campana de cultivo de células de flujo laminar. (Spray cada elemento con etanol al 70% antes de colocar en el capó.)
- Placas de 35 mm de plástico Petri.
- Placas de 60 mm de plástico Petri.
- 35 mm platos Nunclon superficie.
- 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
- p1000 micropipeta (1.000 micropipeta l).
- Aerosol resistente P1000 (1.000 consejos consejos mu l aerosol micropipeta resistentes).
- Alcoholpluma resistente.
- Fine pinza de disección.
- * 15 ml tubos cónicos (sólo para la actividad de imágenes de calcio).
- * Sólo para las imágenes de la actividad del calcio.
- Una vez que la campana ha sido esterilizado UV y soluciones se hayan equilibrado a temperatura ambiente, encienda el flujo laminar de aire en el capó, rocíe guantes y botellas de los medios de comunicación con un 70% de etanol y botellas de los medios de comunicación en el lugar de la capilla.
- En el interior de la campana preparar el siguiente con una micropipeta p1000 para cada placa de las células, lo que garantiza un etiquetado adecuado.
- Un plato de 60 mm de plástico Petri que contiene 10 ml de medio de cultivo celular - Placa de disección.
- Un plato de 35 mm de la superficie de la célula que contiene 2 Nunclon ml medio de cultivo - placa de cultivo. (Nunclon platos de plástico no se trata adicionalmente con ningún adhesivo.)
- Uno de microcentrífuga de 1,5 ml vacío tubo Explante disociación Tube.
- * Una cónico de 15 ml halcóntubo que contiene 15 ml de medio de cultivo celular. Para lavar el exceso Fluo4-AM, cuando la actividad del calcio de imágenes.
- En el interior de la campana, preparar el siguiente con una micropipeta p1000 para cada sesión de disección (más de una retina puede ser diseccionado en una sesión).
- Un plástico de 35 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF - Explante Enjuague Plate.
- Un plástico de 35 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF - Explante Plate disociación.
- Fuera de la campana preparar el siguiente:
- Un plato de Petri de plástico de 60 mm por placa de células que contienen 10 ml de 0,1 X MMR - La celebración de la Plata.
- Un plato de Petri de plástico de 60 mm por placa de células que contienen 10 ml MMR 0,1 X - Placa hermanos.
- Uno de plástico 60 mm placa de Petri por sesión de disección que contiene 10 ml de 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaína) - Placa de anestesia.
- Si la disección de un embrión que es más joven que la etapa 30, se añaden 10 mg de colagenasa B en la placa de disección (resultando en una solución 1 mg / ml de colagenasa B), agitar para disolver y dejar de lado.
- Seleccione un embrión de la fase deseada, traslado a la placa de sujeción con una pipeta no estéril y retire la membrana vitelina (si el embrión aún no ha nacido), utilizando unas pinzas finas.
- Transferir varios embriones en escena idéntica a la placa de hermanos con una pipeta no estéril.
- Si el embrión es la etapa 25 o anterior, proceder directamente con la disección, transferir el embrión a la placa de anestesia con una pipeta de transferencia estéril y no permitir que el embrión para sentarse hasta que el movimiento y la respuesta a los estímulos cesa. Esto podría tomarhasta un minuto.
- Proceda con disección (Figura 2) bajo un microscopio de disección (objetivo 4X, 10X ocular).
Para la etapa de embriones 25 años o menos:
- La transferencia de embriones a la placa de disección con una pipeta no estéril.
- Utilizando dos pares de pinzas finas, realizar un corte sagital medio en el lado ventral del embrión, comenzando en el extremo posterior y continuando a través de la glándula de cemento en la parte anterior del embrión.
- Abra cuidadosamente el embrión agarrando uno de los bordes del corte y la difusión de izquierda y derecha. Esto da lugar a un embrión con el lado dorsal que mira al interior de la placa de disección, y con el ectodermo ventral extendido abierto para revelar el endodermo y mesodermo dentro.
- Comience quitando el endodermo y el mesodermo (Figura 2A y 2B). La primera y más grande de este tejido es muy "suaves" en apariencia concélulas grandes y organización poco obvio.
- Una vez retirada la capa, el somitas y la notocorda se hará visible. Para un mejor contraste, mover el embrión a una separada 60 mm plato de plástico de Petri que contenía 10 ml de medio de cultivo celular y 100 l de 1% de solución de sulfato de Nile Blue (en agua) durante 2-3 min antes de transferir de nuevo a la placa de disección. Esto va a manchar el ectodermo, somitas y la notocorda para facilitar la identificación y la orientación.
- Centrándose en la porción anterior del embrión, retirar cuidadosamente la notocorda y cualquier mesodermo restante exponer el cerebro y vesículas ópticas (Figura 2C).
- Una vez que el cerebro y vesículas ópticas están completamente expuestas, utilizar las pinzas para cortar el tubo neural y ectodermo subyacente justo posterior al cerebro.
- Convertir esta parte (el cerebro y vesículas ópticas) de manera que el ectodermo es en la parte superior.
- Teniendo cuidado de no dañar las vesículas ópticas subyacentes, cuidadosamente estésmover el ectodermo (Figura 2D).
- Por último, el uso de fórceps, separe las vesículas ópticas del cerebro (Figura 2D y 2E).
Para los embriones mayores de la etapa 25:
- Mientras que el embrión se encuentra en la placa de anestesia, quite la parte ventral del embrión con fórceps.
- Para obtener un mejor contraste, mueva el embrión a un plato de Petri de 60 mm de plástico que contiene 10 ml 0,1 X MMR y 100 l de 1% del Nilo Azul Sulfato durante 2-3 min antes de transferir a la placa de disección. Esto se mancha el azul ectodermo.
- Una vez en la placa de disección, tire hacia atrás el ectodermo que cubre la retina (o vesícula óptica para la etapa de embriones 26-30) (Figura 2F y 2G). Si Nilo Azul se utilizó sulfato, el ectodermo se tiñe de azul, pero el tejido de la retina subyacente no.
- Retire la retina o vesícula óptica cuidadosamente con forceps (Figura 2H, 2I y 2J). Es útil para mantener el embrión en su lugar con un par de fórceps y retirar la retina o vesícula óptica con la otra.
2. Disociación de tejido y de células Plating
Nota Importante - Al transferir los tejidos, no se permite la retina o vesícula óptica tocar ninguna frontera aire-líquido, y si esto ocurre, las células se lisan.
- Una vez que la vesícula óptica o de la retina ha sido diseccionado cuidadosamente traslado al explante Enjuagar la placa con una micropipeta p100 usando aerosoles consejos resistentes y deje reposar durante 30 s.
- Transferir 80 l de tripsina al 0,1% en CMF del explante Placa de disociación para el tubo de explante de disociación.
- Usando una micropipeta p100 y aerosoles consejos resistentes, transfiera la retina o vesícula óptica del explante Enjuagar la placa con la Dissociati Explanteen el tubo, evitando la transferencia de los explantes solución de enjuague.
- Permitir que el tejido se disocian en el tubo de explante de disociación durante 1 hora a temperatura ambiente. Una retina fue utilizado por placa, sin embargo, en cuenta que es posible utilizar más de un plato por si así se desea para aumentar el número de células por placa.
- Para la placa de las células, primero retire lentamente 40 l de la solución del tubo de explante de disociación y desechar usando una micropipeta p100 y aerosoles puntas resistentes. El uso de un conjunto de p100 a 40 l y aerosoles puntas resistentes, transferir las células (ahora que el tejido se ha disociado) a la placa de cultivo. Al aspirar las células sobre la placa, pipetear lentamente y mantener las células en un área pequeña en el centro de la placa.
Nota: Si múltiples imágenes de las células se deben tomar durante todo el experimento, adjuntar una rejilla (Cellattice) a la cara inferior de la placa de cultivo
- Permitir que las células de sentarse en reposo durante al menos 1 hr a adherirse a la placa Nunclon. Después de este tiempo, deben ser tratados con mucho cuidado o podrían desprenderse.
- Células de cultivo a etapa deseada mediante la observación de los embriones de hermanos, que se crían en la misma temperatura que las células. Si las células vivas no se están utilizando para su posterior manipulación, pueden ser fijados en solución de MEMFA en este momento.
Nota importante: La mayoría de los experimentos se fijan dentro de las 6 horas de la siembra de las células. La longevidad de las células en cultivo depende de la etapa en la que se disecó el tejido y la cantidad de yema de huevo todavía presente en las células, las células disecadas de más joven (etapas néurula) están sanos en cultivo durante 5-6 días mientras que las células adquirido de mayores embriones (natación renacuajoetapas) seguirán siendo viables en cultivo durante 2-3 días.
3. El calcio de imágenes 47-49
Este protocolo utiliza sensible al calcio Fluo4-AM microscopía confocal y para cuantificar los transitorios de calcio en las células individuales. Todos los pasos que utilizan Fluo4-AM se debe realizar fuera de la luz, como Fluo4-AM es sensible a la luz. Todos los lavados deben ser añadidos o eliminados utilizando una micropipeta p1000 y consejos de aerosol resistentes. Pipetas se debe hacer lentamente y hacia el borde de la placa para evitar alterar las células. Los medios no se cambia porque los cultivos son generalmente fijados dentro de las 6 horas de ser diseccionado. Para más largo plazo las culturas, los medios de comunicación debe cambiarse diariamente.
- Fluo4-AM se almacena a -20 ° C, y se aconseja almacenar en 5 ml de alícuotas. Antes de usar, descongelar una alícuota de 5 l de Fluo4-AM de la luz y añadir 2 l de Pluronic F-127 directamente a esta alícuota.
- Después de cultivar las células durante la cantidad de tiempo deseada (por lo menos1 hr), quite 1 ml de medio de cultivo celular de la placa de cultivo. Agregue esto a la Fluo4-AM y Pluronic, mezclando por pipeteo suave.
- Lentamente transferir la totalidad de esta solución hasta el borde de la placa de cultivo de las células para ser fotografiados y dejar las células en esta solución en reposo durante 1 h para absorber la Fluo4-AM.
- Para lavar el exceso Fluo4-AM del medio de cultivo celular, completan la serie de lavado siguiente:
- Eliminar 1 ml de medio de la placa.
- Añadir 3 ml de medio de cultivo celular (del tubo cónico de 15 ml) a la placa.
- Realizar dos lavados adicionales, cada vez retirando lentamente 3 ml de solución de la placa y la adición de 3 ml de medio de cultivo celular.
- Las células debería estar ahora en 4 ml de medio de cultivo celular y contienen Fluo4-AM. Fluo4-AM es escindido enzimáticamente una vez dentro de la célula, evitando que fuera de difusión de la célula o en cualquier compartimiento unidas a la membrana. Antes de colocar la placa sobre la platina del microscopio confocal de imágenes, trace una línea vertical roja con marcador permanente en el plato mientras se mantiene cubierta para evitar que las partículas de marcadores de la contaminación de la cultura. La línea vertical se extrae por el lado de la placa de Petri (la base de la placa de Petri no, la tapa). Su propósito es indicar la orientación de la placa de cultivo con respecto al campo de visión de modo que la orientación precisa y la alineación de las células individuales podría ser restablecido en un punto posterior.
- La placa está lista para su carga en la platina del microscopio confocal de formación de imágenes. Visualizar las células por medio de la configuración de campo claro en un microscopio de barrido láser confocal (objetivo 20X). Encontrar un área de células densas que no contenga grumos, preferiblemente con un campo de visión que contiene los números de cuadrícula grande en el cubreobjetos Cellatice para hacer encontrar el mismo campo de visión más fácil más adelante, cuando el cultivo después de la formación de imágenes en SITu hibridación. Antes de la formación de imágenes, la selección hacia abajo a través de la cultura y tomar una imagen de campo brillante de la parrilla por debajo de las células para registrar la ubicación y la orientación del cultivo celular. Esto permite la reorganización de las células para su posterior análisis.
- Elevar el plano focal y capturar una imagen de campo brillante de las células antes de la obtención de imágenes de calcio comenzando (Figura 3A).
- Una vez que el plano central de las células está en el foco, la placa está lista para formación de imágenes de la actividad del calcio. Configuraciones variará dependiendo del microscopio y la aplicación. Nosotros imagen de las células utilizando un láser de argón 488 nm para 1, 2, o 12 horas con los parámetros siguientes:
- 1 hr imágenes:
- El argón 488 nm láser escanea el 4% de su potencia máxima de 30 mW.
- Escanear una vez cada 4 segundos (900 escaneos por hora).
- 2 hr imágenes:
- El argón 488 nm láser escanea el 4% de su potencia máxima de 30 mW.
- Escanear una vez cada8 seg (450 lecturas por hora).
- 12 hr imágenes:
- El argón 488 nm láser escanea el 2% de su potencia máxima de 30 mW.
- Escanear una vez cada segundo 48 (75 lecturas por hora).
- 1 hr imágenes:
Estos parámetros se traducirá en un conjunto de 900 imágenes de cuadro fijo para cada marco de tiempo. Actividad de calcio, entonces se puede grabar mediante el análisis de los niveles de fluorescencia sobre las imágenes en curso temporal (Figura 3B) con el uso de una aplicación de procesamiento de imágenes tales como ImageJ 50.
4. La fijación de las células
- Después de obtención de imágenes, las células se pueden fijar durante 30 min mediante la eliminación de 3 ml de solución de la placa y la adición de 1 ml de 2X MEMFA para el resto de 1 ml de medio de cultivo.
- Después de la fijación, quitar MEMFA y deshidratar las células con una serie de lavados de 5 min, cada uno un volumen de 1 ml:
- 25% de etanol en 1X tampón fosfato salino (PBS).
- 50% de etanol en 1X PBS. <li> 75% de etanol en sdd H 2 O (agua destilada estéril desionizada).
- Sustituir el último lavado con 1 ml de etanol al 100% y la placa de almacenar a -20 ° C.
Nota: El metanol también se puede utilizar para estos lavados y para el almacenamiento.
5. La hibridación fluorescente in situ (FISH)
Los cultivos se puede ensayar usando el protocolo estándar para FISH Xenopus como se describe 51 con modificaciones para el cultivo celular como se indica por el Laboratorio de Anderson 52. Las modificaciones al protocolo Anderson Lab se enumeran a continuación. Todos los lavados se llevan a cabo en las placas de 35 mm en volúmenes Nunclon de aproximadamente 1 ml, a menos que se indique lo contrario. Soluciones son como se definen en Sive et al. 53 a menos que se indique lo contrario.
Nota importante: No utilice fluoresceína marcado con sondas de ARN cuando se realiza la hibridación in situ sobre las células captadas porla actividad del calcio. Anti-fluoresceína anticuerpos se unirán a Fluo4 residual-AM en las células y puede causar señal positiva en todas las células en el cultivo.
Día 1: La permeabilización e hibridación
- Rehidratación lavados deben ser clasificados a la deshidratación del disolvente utilizado para el almacenamiento. Para nuestros experimentos, los lavados se clasifica al etanol en 1X PBS.
- Después de la rehidratación, se lavan las células tres veces adicionales en 1X PBS durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
- Mezclar 25 ml de 0,1 M trietanolamina (pH 8,0) con 62,5 l de anhídrido acético en un tubo Falcon y se mezcla rápidamente hasta la completa dispersión como se discute en la Anderson Lab 52 protocolo. Incubar los cultivos en esta mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Después del tratamiento con anhídrido acético, lavar las células en solución salina citrato 1X sodio (SSC) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Quitar el último lavado de SSC y reemplazar con 0,2 M HCl (en sdd H 2 O) durante 10 min para permeabilizar las células. </ Li>
- Lavar HCl con dos lavados en 1X PBS durante 5 min.
- Prehybridize en tampón de ISH a 60 ° C en un baño de agua con agitación durante un mínimo de 6 horas, pero no durante la noche como prehybridize Esto disminuye de señal.
- Hibridar durante la noche a 60 ° C durante 8-14 horas en 750 l de sonda diluida (1:250 dilución a partir de una sonda purificada). La sonda purificada rangos de concentración de 1,0 a 1,5 g / l.
Día 2: Extracción de la sonda no unida e Incubación del anticuerpo
- Retire la sonda y enjuague cultivos durante 5 min en 0,2 X SSC a 60 ° C. Lave en agua dulce SSC 0,2 X durante 1 hora a 60 ° C.
- Eliminar culturas del baño de agua y se deberán adaptar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Enjuague en 0,2 X SSC a temperatura ambiente durante 5 min.
- Lavar durante 15 minutos en 1X PBS con 0,1% Triton-X-100 (PBT).
- Para inactivar peroxidasas endógenas, lavar durante 1 hora en un 2% de H 2 O 2 en la solución PBT.
- Bloque en 2% de reactivo de bloqueo en tampón de ácido maleico (MAB) durante 1 hora a temperatura ambiente. Hemos encontrado que este método de bloqueo aumenta la sensibilidad en comparación con los métodos anteriores de bloqueo en las ovejas 20% de suero en PBT.
- Incubar los cultivos en 1 ml de Reactivo 2% de bloqueo en el MAB que contenía una dilución 1:1.000 de un anticuerpo conjugado con POD durante la noche a 4 ° C.
Día 3: Extracción de anticuerpo no unido y Desarrollo de fluorescencia
- Eliminar la solución de anticuerpo y lavar 3 veces en TBST durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar 4 veces en TBST durante 15 min a temperatura ambiente mientras se continua agitación a una velocidad lenta.
- Lavar dos veces en PBT a temperatura ambiente durante 10 min.
- Aplicar 750 l de 1:200 fluoresceína tiramida o Cy3 tiramida diluido 1:25 en PBT. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y añadir 2,5 l 0,3% de H 2 2. Roca por 40 minutos para permitir la señal a desarrollar.
- Lavar al menos 4 veces durante 15 minutos cada uno en TBST a temperatura ambiente con agitación.
- Una vez que la señal ha desarrollado completamente, lavar durante 5 min en PBT 1X.
- Fijar en 1X MEMFA durante 1 hora a temperatura ambiente y almacenar en 1X PBS a 4 ° C.
6. Resultados imagen Pescados y registro Co-con datos de imágenes de calcio
- Al término de FISH, placas de cultivo celular se crean imágenes para determinar qué células visualizar una señal positiva para la fluorescencia de una sonda dada. Utilice el cubreobjetos Cellattice para encontrar el campo de visión exacto estudiado durante imagen de calcio y alinear la placa a la orientación de los marcos de calcio imagen.
- Enfoque al plano central de las células y tomar una sola imagen de alta resolución usando el helio-neón HeNe 543 nm láser en el 15% de su máximo de 1 mW de potencia (Figura 3C).
- En el original 900 marco conjunto de imágenes tomadas del protocolo imágenes de calcio,identificar células individuales como regiones de interés (ROIs) mediante el uso de un programa de procesamiento de imagen (tal como ImageJ 50). Extraer datos de ROI de fluorescencia como un conjunto de puntos de datos que representan el tiempo de fluorescencia valores de par (Figura 4).
- Superponer la imagen FISH resultados con las ROIs identificados a partir de las imágenes de calcio (Figura 3D).
- Registrar cada ROI como positivos para la sonda, negativo para la sonda, o desconocido - en el caso de que la célula correspondiente a la ROI ya no se puede encontrar dentro del campo de visión de la imagen FISH.
- Proceso ROI datos de fluorescencia utilizando scripts de análisis estadístico (como se diseñó a través de MATLAB o otro lenguaje de programación) para comparar los niveles de calcio en la actividad entre las diferentes etapas disecados (Figura 5A y 5C) o células positivas para diferentes sondas FISH (Figura 5B y 5D). Todos los scripts utilizados en nuestro laboratorio están disponibles gratuitamente bajo petición.
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Representative Results
Ejemplos de éxito disecados vesículas ópticas (etapa 25) y retinas (etapa 35) se muestran en las Figuras 2E y 2J. Aunque este protocolo se puede utilizar en varias etapas de desarrollo, es crítico para obtener sólo tejido de la retina para asegurar la precisión para experimentos adicionales. Retire con cuidado la epidermis en todo momento y asegurarse de que las pinzas no perforar el tejido de la retina. En la etapa 35 años o más, la lente puede ser visto como una capa transparente en la parte superior de la retina y se puede quitar por raspado cauteloso usando fórceps.
Un cultivo primario de células con éxito chapado se muestra en la Figura 3A. Cuando disociar tejido, es importante no dejar el explante de la retina en la solución de aclarado durante más tiempo que el tiempo de incubación recomendado de 30 seg para evitar que el tejido de disociar en la solución de aclarado. Además, asegurar que el tejido se permite que se disocian en la solución de tripsina durante una hora completa(Mayores embrionario y fases larvarias puede requerir incluso más) para permitir una distribución uniforme de las células en la placa de cultivo. Una vez que las células se colocan, tenga cuidado al mover la placa y el cambio de las soluciones para evitar el lavado de las células de la placa.
Las Figuras 3B y 3C demuestran imágenes de escaneado de calcio y actividad en experimentos de hibridación fluorescente in situ (FISH), respectivamente. Las células que parecen verde brillante en la imagen de calcio son células que están experimentando un aumento transitorio en los niveles de calcio intracelular como resultado de la liberación de las reservas de calcio internos. Las células entonces se pueden ensayar para la expresión de genes mediante FISH, y patrones de expresión génica puede ser correlacionada con los patrones de actividad de adición de calcio mediante la superposición de las imágenes (Figura 3D). Usando una combinación de secuencias de comandos de Python y MATLAB (disponible gratuitamente bajo petición), los datos se obtuvieron mediante el análisis de la actividad de fluorescencia de cada indivial región de interés (ROI) a través del curso de la formación de imágenes. Un ejemplo de la actividad del calcio para una celda individual (ROI) durante 1 hr de formación de imágenes se muestra en la Figura 4; una espiga es visible en aproximadamente 57 min de formación de imágenes. En la Tabla 1, los datos representativos del porcentaje de células positivas para diferentes sondas se muestran, mientras que no hay datos específicos para este experimento reportado en la literatura (el punto de nuestros experimentos actuales es determinar estos porcentajes), nuestros resultados son consistentes con los datos de tipos similares de experimentos relacionados con la actividad del calcio en la médula espinal 17,55,56.
Parámetros utilizados para el análisis incluyen el número, la frecuencia y la amplitud de los picos. Figura 5 proporciona resultados representativos de imágenes de calcio y experimentos de FISH en células embrionarias de retina utilizando sondas para xVglut1, Ptf1a, y xGAD67. Usando MATLAB scripts, el número de espigas por each ROI y se determina el número de espigas se promedia para todos los ROIs en el experimento. El número promedio de picos de cada experimento puede compilarse con otros experimentos, lo que resulta en la media de un grupo de experimentos. Parcelas de distribución acumulativa puede ser creado para mostrar la distribución del número promedio de picos para todos los experimentos dentro de un grupo. Está MATLAB se utilizan entonces para el análisis estadístico de los datos.
La Figura 5 muestra los datos representativos siguientes análisis MATLAB. En resumen, nuestros resultados muestran que la actividad del calcio está regulado por el desarrollo, con un pico de adición en la etapa 35 (p <0,002) (Figuras 5A y 5C). En términos de la correlación de la actividad del calcio con células positivas para una sonda específica, mientras que no hubo diferencias estadísticamente significativas, sin embargo, hubo una tendencia (p = 0,08) para las células positivas para xGAD67 (un marcador para las células diferenciadas GABAérgicas) para mostrar generará mayores r niveles de actividad del calcio spiking que las células positivas para un marcador glutamatérgica o para Ptf1a, un gen que codifica un factor de transcripción de genes correlacionados con la promoción del fenotipo GABAeric. Aunque preliminar, estos datos sugieren que puede haber células GABAérgicas, que se desarrollan de una manera independiente de Ptf1a o que la actividad dependiente de la especificación del neurotransmisor no está actuando a nivel de Ptf1a.
Figura 1. Esquemática de procedimiento. Una vez tejido de la retina se diseca y se disocia cultura, célula primaria puede ser utilizado para una amplia variedad de aplicaciones.
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Figura 2. Fotografías disección. Embriones se tiñeron en Nilo Azul Sulfato de mayor contraste. AE: Etapa 24. FJ: Etapa 35. Abreviaturas:. Ov, vesícula óptica, fb, cerebro anterior, sc, la médula espinal, yo, mesodermo, así que, somitas, le, lente, cg, glándula de cemento, re, la retina, epitelio; ep Haga clic aquí para agrandar la figura .
Figura 3. Imágenes de cultivo celular con ROIs círculo. A. Campo claro. B. Imagen siguiente Fluo-4 (AM) el tratamiento con ROIs círculo. C. imagen FISH (flechas indican ejemplos de células positivas para la subunidad alfa del canal de calcio CaV2.1 tensión gated). D. superposición de campo claro, Fluo-4, y las imágenes FISH.
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Figura 4. Ejemplo de actividad del calcio para una sola celda (ROI). Trama de la fluorescencia (en unidades de fluorescencia relativa, rfu) frente al tiempo (en minutos) de una imagen de fluorescencia de calcio Fluo4.
Figura 5. Mostrando resultados spiking calcio por etapa y la sonda. A. Promedio del número de puntos del calcio en las etapas 30 (n = 4), 35 (n = 8), y 38 (n = 13). B. número medio de puntos del calcio por la cultura entre diferentes sondas utilizadas para la hibridación in situ en la etapa 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), y Ptf1a (n = 4). C. trama de distribución acumulativa del número medio de espigas por cultivo en las etapas 30, 35, 38. D. acumulado DISTRIBUCIen la parcela del número medio de espigas por cultivo para células identificadas como señal positiva para la sondas de hibridación in situ en la etapa 35,. xVglut1, xGAD67 y Ptf1a Haga clic aquí para agrandar la figura .
| Sonda | Etapa | n (placas) | n (células) | Porcentaje Positivo |
| xGAD67 | 35 | 4 | 1042 | 2% |
| 38 | 4 | 690 | 2% | |
| Ptf1a | 30 | 3 | 352 | 1% |
| 35 | 6 | 1856 | 1% | |
| xVglut1 | 30 | 1 | 47 | 57% |
| 35 | 3 | 692 | 2% | |
| 38 | 3 | 364 | 4% | |
Tabla 1. Porcentaje de células positivas.
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Discussion
Con sus tipos celulares bien caracterizadas que se conservan en todos los vertebrados, la retina proporciona un modelo útil para el estudio de los procesos moleculares-celulares que regulan la especificación del tipo de célula y la diferenciación. Cultivo celular primario proporciona un método potente para la investigación de una gran variedad de procesos que incluyen la expresión génica, la dinámica de proteínas y el calcio y la actividad eléctrica en el nivel de resolución única célula. A continuación les presentamos una técnica sencilla para cultivo de células primarias de tejido disecado presunto retina en Xenopus laevis, un organismo particularmente susceptibles para este tipo de estudios, dado que el presunto retina es fácilmente accesible desde las etapas más tempranas del desarrollo y cultivo de células primarias que pueden ocurrir en un medios definidos que consisten en una simple solución salina.
Aunque fácilmente adaptable a la mayoría de los ajustes de laboratorio, hay varios pasos que requieren una atención especial. Dissections se debe realizar con fórceps recién afilado. Los más pequeños etapas (<st. 30) se benefician del tratamiento con colagenasa B mezclado con el medio de cultivo celular. Todos los pasos que implican la transferencia de tejido o células procedentes de un medio a otro debe realizarse con especial cuidado para evitar que el tejido o las células entren en la proximidad de la interfase aire-solución. La pipeta que contiene el tejido debe estar completamente sumergido en un montón de líquido y las células o el tejido expulsado muy lentamente. Después de que las células han sido recubierto, todas las transferencias de fluidos, incluyendo, Fluo4-AM Además, y medio de cultivo celular, o lavados de fijación, deben ser cuidadosamente realizado dado que las células pueden ser fácilmente desplazado. Como con todos los cultivos celulares, la esterilidad es preocupación, así se debe tener cuidado para esterilizar todos los materiales. Por último, dejando que los explantes de retina disociadas rendir el tiempo designado en el medio de disociación es fundamental para la fijación de las células con éxito y para evitar la aglutinación.
Durantela condición de disección y de cultivo descrito en este protocolo, ambos necrosis y la apoptosis son sumamente limitadas (menos de 5-10% de las células). La pérdida de células en la placa (apoptosis) raramente se percibe durante las sesiones de formación de imágenes pre y post confocal. Manipular cultivos celulares cuidadosamente es fundamental para la viabilidad celular. Solución cambia debe realizarse muy lentamente y de manera constante para evitar la necrosis celular y la apoptosis. Mientras que los experimentos para delinear la relación precisa de tipos de células retinianas están actualmente en curso, que tenga en cuenta que una gran variedad de tipos de células retinianas parecen estar representados en los cultivos y que las células gliales de Müller (que tienen una morfología distinta) no son dominantes en las culturas .
Una preocupación potencial en el análisis de las placas después de los experimentos de hibridación in situ es que algunas de las células pueden haberse movido, pero esto puede ser tratado con la utilización de programas de rastreo celular. También, inherente a la técnica de cultivo de células primarias, una limitación importante es the obvia pérdida de patrón espacial que está presente en el tejido intacto. La identidad de las células individuales debe ser establecido utilizando ensayos moleculares en lugar de por la posición en el tejido. Sin embargo, esta característica también ofrece la oportunidad de analizar el estado de la especificación de las células de forma muy precisa y en ausencia de continuas interacciones célula-célula. También permite que el investigador para tratar selectivamente las células con factores de crecimiento u otros compuestos y analizar con precisión los efectos sin la influencia de señales de las células vecinas. Si bien se ha empleado esta disección de retina y la técnica de cultivo celular primario para la correlación de imágenes de calcio con marcadores específicos de neurotransmisores fenotipo, esta técnica es adaptable a una amplia gama de otras aplicaciones posteriores, incluyendo grabaciones electrofisiológicas y de simples ensayos de gen de expresión de células utilizando RT-PCR o "siguiente -gen "transcriptoma análisis (Figura 1).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos cortésmente las gracias al Dr. John Hayes para los scripts, los Dres. Eric Bradley y Christopher Del Negro para obtener ayuda con la microscopía confocal, de Drew Hughes, Laura Odorizzi, Garafalo Alex, Rebecca Lowden, y Liz MacMurray por su trabajo en el desarrollo del proyecto y proporcionar datos preliminares, el Dr. Greg Smith por sus útiles sugerencias sobre el análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (NINDS IR15N5067566-01) para el SMS y el Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant al Colegio de William y Mary.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||||||
| For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
| BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
| Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
| 35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
| Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
| Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
| Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
| Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
| Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
| Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
| Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
| 500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
| For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
| Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
| Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
| LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
| For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
| Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
| Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
| NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
| Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
| Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |
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