Summary
En metode for å isolere submitochondrial blemmer beriket i F1FO ATP syntase komplekser fra rotte hjernen er beskrevet. Disse vesikler tillate undersøkelse av aktiviteten av ATPase F1FO kompleks og dens modulasjon ved fremgangsmåten ifølge patch clamp opptak.
Abstract
Mitokondriene er involvert i mange viktige cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, overlevelse ett, utvikling og, kalsium signalisering to. To av de viktigste funksjonene mitokondrielle er relatert til effektiv produksjon av ATP, energiverdi av cellen, ved oksidativ fosforylering, og formidling av signaler for programmert celledød 3..
Enzymet primært ansvarlig for produksjon av ATP er den F1FO-ATP syntase, også kalt ATP syntase 4-5. I de senere årene har rollen som mitokondriene i apoptotiske og nekrotiske celledød fått stor oppmerksomhet. I celledød ved apoptose, BCL-2 familien proteiner som Bax inn mitokondrie ytre membran, oligomerize og permeabilize ytre membran, slippe pro-apoptotiske faktorer inn i cytosol seks. I klassisk nekrotisk celledød, slik som den som produseres av iskemi eller eksitotoksisitet i neuroner, en støre, dårlig regulert økning av matrise kalsium bidrar til åpningen av en indre membran pore, mitokondrie permeabilitet overgang pore eller MPTP. Dette depolarizes den indre membran og fører osmotiske skift, bidrar til ytre membran ruptur, frigjøring av pro-apoptotiske faktorer, og metabolsk dysfunksjon. Mange proteiner inkludert BCL-XL 7 samhandle med F1FO ATP syntase, modulerende sin funksjon. BCL-XL samhandler direkte med beta subenhet av F1FO ATP syntase, og dette samspillet reduserer en lekkasje ledningsevne i F1FOATPasecomplex, øke netto transport av H + av F1FO under F1FO ATPase aktivitet åtte og dermed øke mitokondrie effektivitet. Å studere aktiviteten og modulering av ATP syntase, isolert vi fra gnager hjernen submitochondrial vesikler (SMVs) inneholder F1FO ATPase. De SMVs beholde den strukturelle og funksjonelle integritet av F1FO ATPase som vist i Alavian et al. Her beskriver vi en fremgangsmåteat vi har brukt med hell for isolering av SMVs fra rottehjerne og vi avgrense patch clamp teknikk for å analysere aktiviteten på kanalen (ion lekkasje konduktans) av SMVs.
Protocol
En. Brain Mitokondrie Isolasjon (Tilpasset fra Brown MR et al. 9)
- Ofre rotte hjelp av metoder som er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
- Kutt hodet av dyret ved halshogging, kutt i huden og avsløre skallen.
- Åpne skallen forsiktig ved å skjære med en saks eller rongeur. Fjern hjernen.
- Finhakk fint hjernen uten lillehjernen i Isolation Buffer (se tabell 1) og overføre den til et 5 ml glass / teflon homogenisatoren (se utstyrsliste).
- Homogenisere vev forsiktig 10 ganger (ingen bobler), ca 5 min.
- Sentrifuger prøven ved 1500 x g i 10 minutter ved 4 ° C i et benk-topp sentrifuge.
- Lagre supernatanten (mitokondrie og synaptosomer) og kast pellet (kjernefysisk materiale og celle rusk). Sentrifuger ved 16000 x g i 10 minutter ved 4 ° C i et benk-topp sentrifuge.
- Kastsupernatanten og re-suspendere pellet i 500 mL av Isolation Buffer. Forstyrre synaptosomer med en celle avbrudd fartøy (se utstyrsliste). Anvende trykk på 1200 KPa i 10 min, etterfulgt av rask dekompresjon.
- Layer blandingen på Ficoll gradienter (se tabell 2), sted i SW-50.1 rotor og sentrifuger ved 126 500 x g i 20 min ved 4 ° C i en ultrasentrifuge (se utstyr liste). Pelleten er det rensede mitokondriene, er det lag mellom de forskjellige tettheter av Ficoll undisrupted synaptosomer.
- Vask pellet ved sentrifugering i isolerings-buffer ved 16 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C i et benk-topp sentrifuge.
2. Submitochondrial Blemmer (SMV) Isolasjon (Tilpasset fra Chan et al. 10)
- Resuspendere mitokondrier i 200 pl buffer Isolation kombinert med et likt volum av 1% digitonin og la det sitte på is i 15 min.
- Legg til mer isolasjon BuffER og sentrifuger ved 16 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C i et benk-topp sentrifuge. Gjør dette to ganger.
- Re-suspendere pellet i 200 mL Isolation Buffer og tilsett 2 mL av 10% Lubrol PX (C12E9). Bland og la det sitte på is i 15 min.
- Layer blanding på Isolation buffer, sted i SW-50.1 rotor og sentrifuger ved 182 000 x g ved 4 ° C i 1 time.
- Vask endelige pellet ved sentrifugering i en bordplatens sentrifuge i isolerings-buffer ved 16 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
3. Elektrofysiologisk opptak
- En typisk elektrofysiologiske rigg omfatter en forsterker, et PC-datamaskin som har en Digidata 1440A analog-til-digital omformer grensesnitt i forbindelse med pClamp10.0 programvare, manipulatorer, et mikroskop, et vibrasjonsisolering tabell, Faraday-bur.
- Borsilikatglass kapillarrør settes inn i en Flaming / Brown Mikropipette Puller Model P-87. En pipette-avtrekker Programmet er optimalisert for ågenerere pipetter med motstand mellom 80 til 100 MΩ.
- SMVs er plassert i en fysiologisk intracellulær løsning (ATP tilsettes på et passende tidspunkt i løpet av innspillingen) (tabell 3). Patch clamp pipetter er fylt med den samme oppløsning (ingen ATP). Opptakene fremstilles ved å danne en giga-ohm tetningen på SMVs ved romtemperatur. Blemmer er visualisert ved fase-kontrast mikroskopi med en Nikon eller Zeiss invertert mikroskop.
- Membranen potensialet holdes ved spenninger som strekker seg fra -100 mV til +100 mV i perioder på 10 sekunder. Opptak blir filtrert ved 5 kHz med forsterkeren kretser. Nivået av spredt elektrisk eller ikke-spesifikk støy på mindre enn 1 pA er ønskelig for vellykket opptak.
- Verdiene analyseres med Clampfit 10,0 programvare for eksempel for å bestemme frekvensen og amplituden av enkeltkanalhendelser. Spenning avhengighet bestemmes ved å plotte en aktuell spenning forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trinn i vår protokoll tillater isolering av renset mitokondrier som vist ved Western blot i figur 1.. I figur 2 er vist et eksempel på et hjerne-avledet submitochondrial vesikkel lapp opptak. Bruke innsiden ut patch konfigurasjonen vi demonstrere kanal aktivitet modulert av ATP. Kontrollen (CTL) opptak (til venstre) viser multi-konduktans kanal aktivitet med en topp ledningsevne på 600 pS i gjennomsnitt. som straks ble redusert ved tilsetning av 1 mM ATP til badekaret. Den samlede effekten av ATP er å minske ledningsevne på SMVs plastre i en konsentrasjonsavhengig måte. For å måle effektiviteten av F1FO ATPase etter isolering, målte vi bevegelsen av H +-ioner inn i SMVs i respons til ATP-hydrolyse, som vist i figur 3, å måle nedgang i fluorescens intensiteten av SMV-ekskludert H + indikator ACMA. ATP-sensitive H + ion beslaglegging inn SMVs er forbedret etter leggeition av ATP. Denne analysen kan brukes til å måle effektiviteten av H + ion deponering. Mindre effektive SMVs vil akkumulere H + ioner saktere eller til en mindre topp verdi. For eksempel H + ion deponering er attenuert ved tilsetning av Bcl-xL inhibitorer og FCCP (Alavian et al. 2011).
| Endelig konsentrasjon | |
| Sukrose | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
Tabell 1. Isolasjon Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Sukrose | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18.75 ul 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 pl 1 M (pH 7,4) |
| Topp lag 7,5% av Ficoll | |
| Ficoll lager | 10 ml |
| Isolasjon Buffer | 6 ml |
| Bunnlaget 10% Ficoll | |
| Ficoll lager | 15,5 ml |
| Isolasjon Buffer | 2,5 ml |
Tabell 2. Ficoll lager.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mm |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabell 3. Intern Solusjon.
Figur 1. Representative immunoblotanalyse av lysat renset fra cytosol og mitokondriene. Det øvre panelet viser et immunoblot ved hjelp av et antistoff mot cytosolprotein GAPDH. Bunnpanelet viser et immunoblot ved hjelp av et antistoff mot den mitokondrielle innner membranprotein CoxIV.
Figur 2. To representative patch clamp opptak før og etter tilsetning av 1 mM ATP. Holding potensialet er 70 mV. Den stiplede linjen viser 0 pA. Hver trase blir tatt opp i 10 sek, og det er 10 sek mellom sporene.
Figur 3. Eksempel spor av fluorescens intensitet endringer avden ACMA indikator over tid i nærvær av SMVs og i fravær (spor svart) og nærvær (rød kurve) av ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåtene beskrevet heri, muliggjøre isolering av ren mitokondrier ved slutten av trinn 1 og submitochondrial vesikler (SMVs) etter trinn 2 fra hel hjerne uten forskjell av celle phenotypes.SMVspurified ved denne fremgangsmåte er i det vesentlige fri for forurensning av andre subcellulære organeller som vist i Figur 1 og vår tidligere arbeid (Alavian KN et al. 8) og beholder sin strukturelle og funksjonelle integritet før frysing. Etter frysing og tining, isolerte mitokondrier eller SMVs brukes for opptak og biokjemiske analyser, men ikke for respiratoriske studier.
Denne fremgangsmåte kan dessuten anvendes for å isolere mitokondrier fra leveren ved hjelp av den samme fremgangsmåten. Fordi mitokondrier og SMVs tendens til å danne klynger når belagt i elektrofysiologisk registrering kammer, bør oppmerksomhet gis til lasting prøven, som en overdreven klumper eller overdreven fortynning kan redusere multy av sel formasjon. Videre bør det fokuseres på flere tekniske detaljer før du starter isolasjon. Det er viktig å bruke rene og å holde dem på is. Alle prosedyrer bør utføres på is og sentrifuger alle satt til 4 ° C. Klargjøre Ficoll gradient er skikkelig kritisk for et vellykket eksperiment. Skaper en perfekt separasjon mellom de to konsentrasjoner av Ficoll forbedrer renheten av subcellulære fraksjoner.
En begrensning av denne teknikken er pålagt av det endelige beløpet av protein, som kan være lite hvis prøven fra en bestemt hjernen regionen er ønsket for eksempel mitokondrier fra substantia nigra pars compacta eller striatum. Pooling prøver fra flere dyr kan være nødvendig å øke den totale mengde protein høstes.
Mitokondrier eller SMVs er alikvoteres på 1 mg / ml og oppbevart ved -80 ° C og de er stabile for opptak i flere måneder, men det er preferable ikke å fryses mitokondrie prøven etter tining. Vesikler renset ved denne fremgangsmåte er nyttige for å studere den ATP-syntase, ved hjelp av forskjellige metoder slik som patch clamp opptak, biokjemiske teknikker og andre funksjonelle studier. Med dette preparatet kan man analysere virkningene av narkotika eller små molekyler på F1FO ATPase aktivitet og struktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
