Summary
En metod för att isolera submitochondrial vesiklar anrikade i F1FO ATP-syntas-komplex från råtthjärna beskrivs. Dessa blåsor tillåter studier av aktiviteten hos F1FO ATPas komplex och dess modulering användning av tekniken med patch clamp inspelning.
Abstract
Mitokondrier är inblandade i många viktiga cellulära funktioner inklusive metabolism, överlevnad 1, utveckling och, kalcium signalering 2. Två av de viktigaste mitokondriella funktioner är relaterade till effektiv produktion av ATP, den energi valuta i cellen, genom oxidativ fosforylering, och förmedling av signaler för programmerad celldöd 3.
Enzymet primärt ansvarig för produktionen av ATP är den F1FO-ATP-syntas, även kallad ATP-syntas 4-5. Under de senaste åren har betydelsen av mitokondrier i apoptotiska och nekrotiska celldöd fått stor uppmärksamhet. I apoptotiska celldöd, BCL-2 familjen proteiner såsom Bax in den mitokondriella yttre membranet, oligomerisera och permeabilize yttre membran, släpper proapoptotiska faktorer i cytosolen 6. I klassisk nekrotisk celldöd, såsom den som produceras av ischemi eller excitotoxicitet i nervceller, en large, dåligt reglerade ökning matrix kalcium bidrar till öppnandet av ett inre membran por, den mitokondriella permeabilitet övergången pore eller MPTP. Detta depolariserar det inre membranet och orsakar osmotiska skift, bidrar till yttre membran bristning, frisättning av pro-apoptotiska faktorer, och metabolisk dysfunktion. Många proteiner innefattande Bcl-Xl 7 interagerar med F1FO ATP-syntas, modulera dess funktion. Bcl-xL interagerar direkt med betasubenheten av F1FO ATP-syntas, och denna interaktion minskar läckage konduktans inom F1FOATPasecomplex, ökar netto transport av H + från F1FO under F1FO ATPas aktivitet 8 och därigenom öka mitokondriell effektivitet. Att studera aktiviteten och modulering av ATP-syntas, isolerade vi från submitochondrial gnagare hjärnan blåsor (SMVs) innehåller F1FO ATPas. De SMVs bibehåller den strukturella och funktionella integriteten hos F1FO ATPas såsom visas i Alavian et al. Här beskriver vi en metodatt vi har framgångsrikt använts för att isolera SMVs från råtthjärna och vi avgränsa tekniken patch clamp att analysera kanal aktivitet (jon läcka konduktans) av SMVs.
Protocol
Ett. Brain Mitokondriell Isolering (Anpassat från Brown MR et al. 9)
- Offra råttan med metoder som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
- Skär huvudet av djuret genom halshuggning, skära in i huden och exponera skallen.
- Öppna skallen försiktigt genom att klippa med sax eller rongeur. Ta bort hjärnan.
- Finhacka fint hjärnan utan lillhjärnan i Isolation Buffer (se tabell 1) och för över det till en 5 ml glas / teflon-homogenisator (se utrustningslista).
- Homogenisera vävnad försiktigt 10 gånger (inga bubblor), ca 5 min.
- Centrifugera provet vid 1500 x g under 10 min vid 4 ° C i en bänk-topp-centrifug.
- Spara supernatanten (mitokondriell och synaptosomer) och kassera pellet (kärnämne och cellskräp). Centrifugera vid 16.000 x g under 10 min vid 4 ° C i en bänk-topp-centrifug.
- Kasserasupernatanten och återsuspendera pelleten i 500 | il Isolation Buffer. Störa synaptosomer med cellsönderdelning kärl (se utrustningslista). Applicera ett tryck av 1200 psi under 10 min, följt av snabb dekompression.
- Varva blandningen på Ficoll gradienter (se tabell 2), plats i SW-50.1 rotor och centrifugera vid 126.500 xg under 20 minuter vid 4 ° C i en ultracentrifug (se utrustningslista). Pelleten är det renade mitokondrierna är skiktet mellan de olika densiteterna av Ficoll störningsfri synaptosomer.
- Tvätta pelleten genom centrifugering i isoleringsbuffert vid 16.000 x g under 10 min vid 4 ° C i en bänk-topp-centrifug.
2. Submitochondrial Blåsor (SMV) Isolering (Anpassat från Chan et al. 10)
- Återsuspendera mitokondrier i 200 ^ Isolation Buffer kombineras med en lika volym av 1% digitonin och låt stå på is i 15 min.
- Lägg mer Isolation Buffer och centrifugera vid 16.000 x g under 10 min vid 4 ° C i en bänk-topp-centrifug. Gör detta två gånger.
- Återsuspendera pelleten i 200 l Isolering buffert och tillsätt 2 pl 10% Lubrol PX (C12E9). Blanda och låt stå på is under 15 min.
- Layer blandningen på Isolation Buffer, placera i SW-50,1 rötor och centrifugera vid 182.000 x g vid 4 ° C under 1 timme.
- Tvätta slutliga pelleten genom centrifugering i en desk-top centrifug i isoleringsbuffert vid 16.000 x g under 10 min vid 4 ° C.
Tre. Elektrofysiologiska inspelning
- En typisk elektrofysiologi rigg innefattar en förstärkare, en PC-dator utrustad med en Digidata 1440A analog-till-digital-omvandlare gränssnitt tillsammans med pClamp10.0 programvara, manipulatorer, ett mikroskop, en vibrationsisolering bord, Faradays bur.
- Borosilikatglas kapillärrör in i en flammande / Brun mikropipett avdragare Modell P-87. En pipett-avdragare programmet är optimerat förgenerera pipetter med motstånden mellan 80 och 100 Mohm.
- SMVs placeras i en fysiologisk intracellulär lösning (ATP tillsätts vid lämplig tidpunkt under inspelning) (tabell 3). Patch clamp pipetter är fyllda med samma lösning (ingen ATP). Recordings framställs genom bildande av en giga-ohm tätningen på SMVs vid rumstemperatur. Blåsor visualiseras genom faskontrastmikroskopi med en Nikon eller Zeiss inverterat mikroskop.
- Den membranpotentialen hålls vid spänningar som sträcker sig från -100 mV till + 100 mV under perioder om 10 sekunder. Inspelningar filtreras vid 5 kHz med förstärkaren kretsen. Nivå av herrelösa elektrisk eller icke-specifik brus på mindre än 1 Pa är önskvärda för en lyckad inspelning.
- Data analyseras med Clampfit 10,0 programvara till exempel för att bestämma frekvensen och amplituden för enkanaliga händelser. Spänning beroendet bestämdes genom att avsätta en ström spänning relation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första steget i vår protokoll möjliggör för isolering av renade mitokondrier såsom visas med Western blöt i figur 1. I figur 2 visas ett exempel på en hjärnhärledd submitochondrial vesikel patch inspelning. Använda inside-out patch konfiguration vi visar kanal aktivitet moduleras av ATP. Kontrollen (CTL) inspelning (vänster) visar flera konduktans kanal aktivitet med en topp konduktans av 600 pS i genomsnitt. som omedelbart minskade vid tillsats av 1 mM ATP till badet. Den totala effekten av ATP är att minska konduktansen hos SMVs fläckar i ett koncentrationsberoende sätt. För att mäta effektiviteten i F1FO ATPas efter isolering, mätte vi rörelse av H ^-joner in i de SMVs som svar på ATP-hydrolys såsom visas i fig. 3, att mäta minskningen i fluorescens intensiteten hos SMV-uteslutna H + indikator ACMA. ATP-känsliga H + är jon kvarstad i SMVs förbättras efter läggaUtgåva av ATP. Denna analys kan användas för att mäta effektiviteten i H +-jon sekvestrering. Mindre effektiva SMVs kommer att ackumuleras H + joner långsammare eller till ett mindre toppvärde. Till exempel H + jon sekvestrering dämpas genom tillsats av BcI-Xl-inhibitorer och FCCP (Alavian et al., 2011).
| Slutlig koncentration | |
| Sackaros | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
Tabell 1. Isolation Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Sackaros | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18.75 l 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 pl 1 M (pH 7,4) |
| Top Layer 7,5% av Ficoll | |
| Ficoll lager | 10 ml |
| Isolation Buffer | 6 ml |
| Bottenskikt 10% Ficoll | |
| Ficoll lager | 15,5 ml |
| Isolation Buffer | 2,5 ml |
Tabell 2. Ficoll lager.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7,3 |
Tabell 3. Intern Solution.
Figur 1. Representant immunoblot av lysat renat från cytosol och mitokondrier. Det övre fältet visar en immunoblot med användning av en antikropp mot det cytosoliska proteinet GAPDH. Den undre panelen visar en immunoblot med användning av en antikropp mot den mitokondriella innner membranproteinet CoxIV.
Figur 2. Två representativa patch clamp inspelning före och efter tillsats av 1 mM ATP. Hållpotential är +70 mV. Den streckade linjen representerar 0 Pa. Varje spår är inspelad i 10 sekunder och det är 10 sekunder mellan spåren.
Figur 3. Exempel spår av fluorescensintensiteten förändringar avden ACMA indikatorn över tiden i närvaro av SMVs och i frånvaro (svarta spår) och närvaro (röda spår) av ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs häri möjliggör isolering av rent mitokondrier vid slutet av steg 1 och submitochondrial vesiklar (SMVs) efter steg 2 från hela hjärnan utan åtskillnad av cell phenotypes.SMVspurified genom denna metod är i huvudsak fri från föroreningar av andra subcellulära organeller, såsom visas i Figur 1 och vårt tidigare arbete (Alavian KN et al. 8) och bibehåller sin strukturella och funktionella integritet före frysning. Efter frysning och upptining, isolerade mitokondrier eller SMVs används för inspelningar och biokemiska analyser, men inte för respiratoriska studier.
Denna metod kan dessutom användas för att isolera mitokondrier från lever med användning av samma steg. Eftersom mitokondrierna och SMVs tenderar att bilda kluster när ströks i den elektrofysiologiska inspelning kammaren, bör uppmärksamhet ägnas åt att lasta av provet, som en överdriven klumpar eller överdriven utspädning kan minska möjty of tätning formation. Dessutom bör man vara uppmärksam på flera tekniska detaljer innan isoleringen. Det är viktigt att använda rena verktyg och att hålla dem på is. Alla bör utföras på is och alla centrifuger satt till 4 ° C. Förbereda Ficoll lutning korrekt är avgörande för ett lyckat experiment. Skapa en perfekt separation mellan de två koncentrationer av Ficoll förbättrar renheten av subcellulära fraktioner.
En begränsning av denna teknik tas ut av det slutliga beloppet av protein, som kan vara små om prov från en viss hjärna region önskas t.ex. mitokondrier från substantia nigra pars compacta eller striatum. Sammanslagning prover från flera djur kan vara nödvändigt att öka den totala mängden protein skördas.
Mitokondrier eller SMVs alikvoteras vid 1 mg / ml och förvarades vid -80 ° C, och de är stabila för inspelningar i flera månader, men det är preferable inte frysas den mitokondriella provet efter upptining. Blåsor renade genom denna metod är användbar för att studera ATP-syntas, med hjälp av olika metoder såsom patch clamp inspelning, biokemiska tekniker och andra funktionella studier. Med detta preparat man kan analysera effekterna av droger eller små molekyler på F1FO ATPas aktivitet och struktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
