Summary
Простой и воспроизводимые процедуры описаны сделав три структурно различных собраниях коллагена от общей коммерчески доступных коллагена I типа мономера. Родные типа, волокнистых длинный интервал или сегментарного долго коллагена интервал может быть построена путем изменения условий, в которых 300 нм долго и 1,4 нм в диаметре мономера строительный блок подвергается.
Abstract
Коллагена присутствует во внеклеточной матрицы тканей животных, чтобы обеспечить структурную леса и механическую прочность. Эти родные коллагеновых волокон имеют характерные полосы периодичностью ~ 67 нм и формируются прижизненно по иерархической сборки коллагена I типа мономеров, которые являются 300 нм в длину и 1,4 нм в диаметре. В пробирке, путем изменения условий, в которых Блоки мономера здания подвергаются, уникальных сооружений, располагающихся в масштабах до 50 мкм может быть построено, в том числе не только родных волокон типа, но и волокнистых длинный интервал и сегментарных долго коллагена расстояния. Здесь мы представляем процедур для формирования трех различных структур коллагена от общей коммерчески доступных коллагена мономера. Использование протоколов, которые мы и другие, опубликованные в прошлом, чтобы сделать эти три типа обычно приводят к смеси структур. В частности, unbanded фибрилл были широко Found при принятии родной коллаген, и родной фибриллы часто присутствует при принятии волокнистого коллагена долгое расстояние. Эти новые процедуры имеют преимущество получения желаемого фибрилл коллагена типа почти исключительно. Формирование желаемой структуры проверяется визуализации с использованием атомно-силового микроскопа.
Introduction
Коллаген является класса структурных белков, которые имеют тройную спиральную структуру образуется из трех полипептидных цепей. Эти тройной винтовой мономеров дальнейшей сборки в иерархической способом с образованием постепенно более крупные структуры. Есть, по крайней мере, 28 генетически различных типов коллагена, которые были определены 1. Комбинированные, коллагены составляют 30% от общего белка у животных, типа я преобладающей формой учета до 90% всех белков коллагена 2. I тип коллагена находится как fibrillous структур в коже, связках, сухожилиях и костях. Атомно-силовой микроскоп (АСМ) и электронной микроскопии (ЭМ) изображения типа I родной коллагеновых волокон обычно показывают полосы с характерным периодом ~ 67 нм (часто называемый D-диапазонов) 3-5.
I тип коллагена мономер является тройным heterotrimer винтовые, состоящие из двух одинаковых α1 (I) цепи и один α2 (I) цепи, каждая болеетысяч аминокислот. Это длинный и тонкий с размерами 300 нм в длину и 1,4 нм в диаметре. I тип коллагена мономера могут быть легко получены путем разбивки естественно, образуются высшие структуры порядка 6. Мы 7 и многие другие 8-10 показали, что эти растворимые строительные блоки мономер может быть использован для восстановления D-диапазонов фибрилл в пробирке (рис. 1).
В дополнение к родным коллагеновых волокон, два других высших структур порядка коллагена были найдены сформировать в пробирке с использованием тех же строительных блоков мономеров. Две структуры волокнистых длинный интервал (FLS) и сегментарные длинный интервал (SLS) коллагена (рис. 1). FLS коллагена fibrillous конструкции как родные коллагена, но характеризуется большей полосы периодичностью, чем родные коллагена 11. Экстракорпоральное, FLS коллаген образует когда коллаген мономера в сочетании с α1-кислого гликопротеина
Цель этой рукописи представить подробные процедуры принятия родной коллагеновых волокон, а также FLS и SLS коллагена, что даже самый неопытный исследователь может воспроизвести. Использование имеющихся в продаже передовые исходные материалы, мы постарались сделать протоколы как можно более простым и до сих пор они работали надежно. Мы также подробно, как использовать AFM, чтобы охарактеризовать различные структуры коллагенаы, которые сделаны. Эта работа будет полезна для исследователей, которые хотят изучать один или более из этих структур высшего порядка коллагена и / или использовать их в качестве предшественников в других приложениях, но в настоящее время отсутствия опыта или просто не хотят работать с образцов тканей.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: вода, используемая во всех протоколах есть сопротивление> 18 MΩ.cm.
1. Родные коллагеновых волокон
- Комбинат 6 мкл воды, 20 мкл 200 мМ Na 2 HPO 4 до рН 7 с HCl и 10 мкл 400 мМ KCl в трубке микроцентрифуге и перемешать.
- Добавить 4 мкл мономера коллагена (~ 3 мг / мл в 0,01 N HCl) к трубке микроцентрифуге и перемешать. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.
- Поместите пробирке содержащий реакционную смесь в теплом блоке, который был предварительно нагревают до 37 ° C и оставить от 3 до 4 часов. На данный момент, решение должно быть немного облачно и содержат в основном родные коллагеновых волокон.
2. Волокнистые Длинные Коллаген Расстояние
- Диализировать 1 мл мономера коллагена (~ 3 мг / мл в 0,01 N HCl), используя 12-14 кДа MWCO мембрану против 400 мл воды, меняя воду в четыре раза в течение 24 часов при комнатной температуре. Диализованной collagан мономер, который не используется сразу можно хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования.
- Комбинат 20 мкл воды, 20 мкл 3 мг / мл α1-кислого гликопротеина в воде и 20 мкл диализованной мономера коллагена в пробирке. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.
- Оставьте пробирке содержащий реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. На данный момент, решение должно быть ясно и содержат преимущественно FLS коллагеновых волокон.
3. Сегментные Длинные Коллаген Расстояние
- Комбинат 67 мкл воды, 60 мкл 100 мМ глицин-HCl буфере при рН 3,3 и 40 мкл 10 мг / мл ATP в воду в трубы микроцентрифуге и перемешать.
- Добавить 33 мкл мономера коллагена (~ 3 мг / мл в 0,01 N HCl) к трубке микроцентрифуге и перемешать. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.
- Оставьте пробирке содержащий реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. На данный момент, решение будет отображаться ясно, но следуетв основном содержат SLS коллагена.
4. AFM характеристика
- Cleave поверхность кусок слюды прикреплены к субстрату AFM путем покрытия поверхности слюды с куском скотча, а затем пилинг его. Проверьте ленту потом подтвердить, что весь слой слюды расщепляться в целях уменьшения неровностей на поверхности и убедиться, что старого образца снимается, если слюды используется повторно.
- Применяют 20 мкл раствора коллагена фибрилл в свежесколотых слюды подложки. Оставьте на 5 минут.
- Аккуратно смойте раствор коллагена фибрилл с водой. Желательно не применять воду непосредственно на центр подложку слюды, но на краю и позволить ей течь сквозь образец.
- Высушите поверхность под струю газообразного азота. Желательно, чтобы направить поток на краю, а не в центре подложки из слюды.
- Под оптическим микроскопом при 200-кратном увеличении,родные и FLS образцов коллагена должны показать скопления фибрилл. SLS коллаген не будет видно.
- Уникальные характеристики трех различных структур коллагена наблюдать с помощью АСМ. Как правило, мы изображении родной коллагеновых волокон с AFM в прерывистый режим контакта с помощью кремниевых АСМ зондов, в то время как FLS и SLS коллагена мы обычно изображение с АСМ в режиме контакта с помощью нитрида кремния АСМ зондов. Мы делаем это, потому что времени и затрат. Кремний АСМ зондов, как правило, острее, чем нитрида кремния зондов АСМ, которые делают их особенно полезными для работы с изображениями узкие полосы структуре родного коллагеновых волокон. Тем не менее, кремний АСМ зонды являются гораздо более склонны к загрязнению образцов коллагена, чем нитрида кремния зондов АСМ и нужно часто менять. Таким образом, мы оставляем за собой использование кремниевых зондов АСМ основном для работы с изображениями родной коллагеновых волокон, где разрешение больше необходимости и мы работаем в режиме прерывистой контакт с пролОнг своей жизни полезности.
Мы рекомендуем начальных 100 × 100 мкм 2 проверки, которая должна показать, по крайней мере, несколько конструкций коллагена. Оттуда, увеличить для сканирования размеры 10 × 10 мкм 2, а затем 2 × 2 мкм 2 для наблюдения полос Периодичность родным и FLS коллагена, или тонкие черты SLS коллагена. Это также хорошая идея, чтобы проверить по крайней мере два других регионов на коллаген образец чтобы убедиться, что начальные сканирует представитель.
Representative Results
Родные коллагена
Реакционной смеси ~ 0,3 мг / мл коллагена мономера в 100 мМ фосфата и 100 мМ KCl при рН 7 оставили при 37 ° С в течение 3-4 часов даст раствор, содержащий родной коллагеновых волокон типа с четким ~ 67 нм D-полосы, без unbanded фибрилл.
Под оптическим микроскопом при 200-кратном увеличении, пучки из нескольких волокон обычно можно увидеть на подложку слюды особенно при просмотре дифференциального интерференционного контраста (DIC) микроскопии (рис. 2). В типичном образце, случайные 100 × 100 мкм 2 сканирования с помощью АСМ, как правило, показывают, по крайней мере несколько волокон, которые являются 5-50 мкм в длину (рис. 3а-в). Индивидуальные, разделенных коллагеновых волокон могут быть легко идентифицированы на данном этапе. С 512 × 512 пикселей 2 изображений сканирование, масштабирование в 10 × 10 мкм 2 размер сканирования показывает, что все объединились фибриллы (рис. 3d-F 2 размера сканирования (рис. 3G-я).
Кольцевание периодичность может быть определен простым измерением и усреднения продольное расстояние между несколькими пиками и долинами. Кроме того, если программное обеспечение АСМ позволяет, одномерного преобразования Фурье вдоль продольного сечения также может быть использован. Рисунке 4 показано АСМ-изображение высотой фибрилл и соответствующие продольным сечением.
FLS коллагена
Реакционной смеси 1 мг / мл μ1-кислого гликопротеина и ~ 1 мг / мл коллагена мономера в воде оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин принесет решение FLS фибрилл коллагена.
Глыбы фибриллы, подобное тому, что наблюдается в случае родного коллагена, можно легко увидеть на подложку слюды под оптическим микроскопом при 200 × мagnification. В типичном образце, случайные 100 × 100 мкм 2 сканирования с помощью АСМ, как правило, показывают, по крайней мере несколько фибрилл. С 512 × 512 пикселей 2 размер сканирования изображения, полосы Периодичность может быть измерена путем увеличения в 10 × 10 мкм 2 сканирования (рис. 5а) или, точнее, с 2 × 2 мкм 2 сканирования (рис. 5б). Рисунке 5в показывает продольное сечение FLS фибрилл.
SLS коллагена
Реакционной смеси 2 мг / мл АТФ и ~ 0,5 мг / мл коллагена мономера в 100 мМ глицин-HCl буфере при рН 3,3 оставляют при комнатной температуре в течение 2 часов даст решение коллагена SLS.
Как правило, SLS кристаллитов не будут видны в оптический микроскоп. AFM требуется, чтобы подтвердить наличие кристаллитов SLS. В типичном образце, случайные 100 × 100 мкм 2 сканирования с помощью АСМ, как правило, показывают, что многиеточками. Увеличение в 10 × 10 мкм 2 сканирования, как правило, показывают несколько кристалликов SLS (рис. 6а). А 2 × 2 мкм 2 сканирования (рис. 6, б) показывает более тонкая структура кристаллитов SLS.
Рисунок 1. Три структурно различных форм коллагена, который может быть сформирован в пробирке из коллагена мономера. АСМ-изображения изображающие мономера коллагена и три высших структур коллагена порядке все по той же шкале размеров (2 × 2 мкм 2).
Рисунок 2. Цифровое изображение при ~ 200-кратное увеличение оптической микроскопии DIC родной коллагеновых волокон на слюду (а) нетронутой и (б) thresholded и заостренные тØ выделить фибрилл.
Рисунок 3. АСМ изображения родной коллагеновых волокон на слюду. Периодически контактном режиме АСМ амплитуды изображения отображаются.
Рисунок 4. (А) 0,5 × 1 мкм 2 прерывистый контакт режиме АСМ высота изображения (вертикальная шкала = 100 нм) и (б) продольное сечение родного коллагена фибрилл.
Рисунок 5. АСМ изображения FLS коллагена на слюду. (А) 10 × 10 мкм 2 контактном режиме АСМ отклонения изображение, (б) 2 × 2 мкм 2 контактном режиме АСМ изображение и отклонения (с) продольнуюСечение FLS коллагена фибрилл.
Рисунок 6. АСМ изображения SLS коллагена на слюду. Периодически контактном режиме АСМ амплитуды изображения отображаются.
Discussion
Очищенная коллагена мономер устойчив при низких значениях рН и температуры и образование коллагеновых волокон родной существу включает повышение рН и температуры раствора мономера коллагена. Процедуры для восстановления полосовых коллагеновых волокон из мономеров, существовали на протяжении более 50 лет. Процедура что наши лаборатории, используемые в наших первых исследований с коллагеном 15 лет назад, 7, основанные на процедурах обобщены Чепмена и его сотрудниками в 1986 10. Условия для образования фибрилл коллагена в том, что ранние работы были 0,18 мг / мл коллагена мономера в Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, рН 7,4) буфере при 34 ° C. Недостатком этой и других процедур, которые мы пытались это то, что всегда есть unbanded фибрилл образуется наряду с желаемой диапазонов фибрилл. Наши новые условия ~ 0,3 мг / мл мономера коллагена в 100 фосфата мм и 100 мм KCl при рН 7 оставили при 37 ° С в течение 3-4 часов. ПроцедурамДюре, описанные здесь отличается в каждом аспекте от ранее порядок внесения родной коллагеновых волокон. Но наиболее заметно, мы удвоили ионной силы путем повышения концентрации буфера и добавления 100 мМ KCl. Увеличение ионной силы в более последовательное формирование исключительно объединились коллагеновых волокон.
По нашему опыту, только раз, что эта процедура не дала родного коллагена типа было, когда раствор мономера коллагена было рекомендовано дату прошлого производителем использования. Когда это происходит, то, что наблюдалось в диапазоне от меньше фибрилл, которые все unbanded много фибрилл, но по-прежнему наблюдается преимущественно unbanded. Обратите внимание, что истекший мономера коллагена часто все же быть с успехом использован, чтобы сделать родные коллагена, но когда это не удается, новые мономера коллагена обязательно должны быть приобретены.
FLS впервые выявленных Highberger и др. 17. Коллагена подготовки зачисляются на Orekhovicч и соавт. 18. Дальнейшие исследования привели Highberger и Шмитта к выводу, что это был α1-кислого гликопротеина, что способствует формированию FLS 12. Мы были позже удалось повторить процедуру для принятия FLS коллагена путем объединения имеющихся в продаже мономера коллагена и α1-кислого гликопротеина при низких значениях рН и медленно позволяющий рН возрастет на диализ смеси с водой в течение 24 часов 11. Теперь мы представляем модификацию, что процедуру диализа мономера коллагена от воды первого и просто сочетая его с α1-кислого гликопротеина в воде с образованием FLS коллагена. Условия для FLS коллагена сборки описанных здесь гораздо меньше времени. Мономера коллагена еще нуждается в предварительной диализу против воды, но это может быть сделано в натуральном и затем хранят при температуре 4 ° С стабильно, пока оно используется. Эта новая процедура дает преимущественно FLS диапазонов коллагеновых волокон.
Из нашего опыта, α1-кислотных гликобелка с низким комбинированным содержанием белка и воды, а также вывод выше содержание сахара, имеет решающее значение для успешного делает FLS фибрилл. Мы, как правило, свяжитесь с производителем, что α1-кислого гликопротеина много мы используем комбинированный% белка и содержанием воды 82 или меньше. И как с процедурой родной синтез коллагена, коллаген мономер, который слишком стар, может также привести к неспособности производить FLS коллагена. Кроме того, чистота воды, используемой для диализа имеет решающее значение в этой процедуре. Например, диализ коллагена мономера даже против ~ 8 MΩ.cm, а не> 18 MΩ.cm воды приводит к коллагена решение, которое не будет являться FLS коллагена.
Из трех типов коллагена фибрилл, проще всего сделать это SLS коллагена. Самая ранняя подготовка SLS был описан Шмитт и сотрудников 15. Мы опубликовали адаптации этой процедуре 12 лет назад для изготовления SLS коллагена с использованием коммерчески доступных сбагентств 14. Процедура просто повлекло объединения 2 мг / мл АТФ и 0,5 мг / мл коллагена мономера в 0,05% (V / V) уксусной кислоты при рН 3,5, и оставляя смесь при комнатной температуре в течение ночи.
По нашему опыту, важнейшим аспектом сборка SLS, что должно контролироваться является рН реакционного раствора. SLS собраны в более основных условий (рН 3,6-3,9 ~) результаты в агрегированных скоплений кристаллитов. Более кислой среде (рН 2,9-3,2 ~) приводит к тоньше, разделенных кристаллитов, чем те, собранных в идеальных условиях рН 3.3-3.5. Реакция рН за пределами этого диапазона (<2,8 и> 4) не дают никаких SLS коллагена. В прошлом, мы скорректировали рН реакционной смеси при добавлении уксусной кислоты. Для упрощения процедуры еще дальше, в этой рукописи мы ввели глицин-HCl буфера для контроля рН.
Три различные структуры коллагена формируются из протоколов, описанных выше, имеют характерИСТИК функции, которые могут быть обнаружены только на инструменты, способные нанометровым разрешением. Родные и FLS коллагена характеризуется полосы периодичности ~ 67 нм и ~ 270 нм. Наибольший размер коллагена SLS находится всего в ~ 360 нм. Мы описали в частности, как мы используем AFM для характеристики трех различных структур коллагена. Тем не менее, любой операционной AFM в контакте или прерывистого режима контакт с любым АСМ зонд, имеющий <10 нм радиус должен также быть в состоянии изображении этих коллагеновых структур. Кроме того, электронная микроскопия может быть, и был использован для характеристики этих коллагеновых структур 19.
Основным преимуществом этих процедур является то, что они производят преимущественно желаемого коллагена построить. Только другой формы коллагена, который находится в этих реакций исходного мономера, который часто видно на фоне АСМ-изображений. В случае родным и FLS коллагена, они могут быть легко отделена от большинства unreaИДКТК мономера повторным центрифугированием и промывки полученного родным или FLS коллагена гранул с водой.
Мы представили простые и надежные процедуры для принятия родной, FLS и SLS коллагена с использованием современных, коммерчески доступных исходных материалов. Мономера коллагена используется во всех этих процедур является коммерчески доступным в очищенной форме. α1-кислого гликопротеина и СПС также являются коммерчески доступными.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех многочисленных прошлых студентов, аспирантов и пост-докторантов, которые посвятили свое время и усилия на изучение коллагена фиброгенеза в нашей лаборатории. Естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады постоянно предоставил финансирование для наших исследований коллагена.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe - Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
References
- Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. Collagen at a glance. J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).
- Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. Guide to Collagen Characterization for Bio Studies. J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).
- Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).
- Petruska, J. A., Hodge, A. J. A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).
- Smith, J. W. Molecular Pattern in Native Collagen. Nature. 219, 157-158 (1968).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions. PNAS. 41, 1-7 (1955).
- Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy. Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).
- Wood, G. C., Keech, M. K. The formation of fibrils from collagen solutions. Biochem. J. 75, 588-597 (1960).
- Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen Fibril formation. J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).
- Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure. Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).
- Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study. PNAS. 37, 286-291 (1951).
- Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).
- Paige, M. F., Goh, M. C. Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy. Micron. 74, 355-361 (2001).
- Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. A new particle type in certain connective tissue extracts. PNAS. 39, 459-470 (1953).
- Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis. PNAS. 76, 313-317 (1979).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts. JACS. 72, 3321-3322 (1950).
- Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. O prokollagene kohzi. Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).
- Lin, A. C., Goh, M. C. Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy. Proteins. 49, 378-384 (2002).
