Summary
此协议描述了使用的肽：MHC四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性的T细胞群体，并通过流式细胞术分析它们。这种方法能够直接研究内源性T细胞群的兴趣
Abstract
研究与体内实验模型的适应性免疫识别能力，根据他们的T细胞抗原受体（TCR）的特异性的T细胞的基本需要。许多的间接的方法是可在其中通过测量确定的官能反应，如增殖，细胞因子的产生，或活化标志物的表达的1与特定的抗原和表位的特异性T细胞在体外刺激T细胞堆积人口。然而，这些方法只能识别特定表位的T细胞表现出的许多可能的功能之一，它们是不够敏感检测表位特异性的T细胞在幼稚前体频率。一种流行的选择是TCR基因转殖继转移模型，其中单克隆T细胞的TCR转基因小鼠接种到组织相容性的主机创建一个大的前体人口的表位特异性的T细胞，可以EASI光年跟踪与一个同类系的标记抗体2,3使用。虽然功能强大，该方法遭受从实验与工件的非生理性T细胞的频率与一个单一的抗原决定簇特异性的4,5。此外，该系统不能被用于研究的功能内的异质性的表位特异性的T细胞克隆的多克隆人口。
理想的方式来学习适应性免疫应包括使用的方法，区分TCR特异性完全由结合到同源肽：MHC（住房抵押贷款公司）的直接检测表位特异性T细胞的内源性T细胞库。住房抵押贷款公司的四聚体和流式细胞仪的使用来完成这6，但被限制在检测高频只符合下列抗原诱导的克隆扩增的特定表位的T细胞群体。在这个协议中，我们描述了一种方法，协调使用的住房抵押贷款公司四和磁学抽动细胞富集技术，使极低频小鼠淋巴组织3,7的特定表位的T细胞的检测。利用这种技术，人们可以全面跟踪整个在小鼠内源性T细胞表位的特定人群的免疫反应的所有阶段。
Protocol
1。淋巴组织细胞分离
- 加入1毫升：冰：冷cEHAA（EHAA + 10％FBS，钢笔/链球菌，庆大霉素，2mM的L-谷氨酰胺，55 mM的2 - 巯基乙醇）或其它等效的T细胞的介质，以60毫米的培养皿中含有一个小正方形100μm的尼龙网和冰。
- 安乐死鼠标。
- 取出脾和淋巴结尽可能方便。这些措施应包括至少在腹股沟，腋窝，上臂，子宫颈癌，肠系膜淋巴结肿大。将它们放置在顶部的尼龙网眼的培养皿中。
- 使用平顶一个封闭的1.5 ml离心管中， 轻轻捣烂的尼龙网，解放淋巴细胞的淋巴组织。的cEHAA和移液管向上和向下添加另一1毫升的工作到悬浮液中的细胞。通过另一块尼龙筛放在15ml的聚丙烯离心管中的顶部，将细胞转移。洗净的菜和另1毫升冰冷的cEHAA，宝网oling卷到同一管内。重复实现了最终的细胞悬浮液体积为4ml。
- 加入冷的分拣机缓冲液（PBS + 2％FBS，0.05％叠氮化物），至终体积为15毫升，离心管在300×g离心5分钟，4℃下
- 小心地吸出上清液，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。中：Fc的嵌段（分拣机缓冲液+ 2.4G2抗体）中重悬细胞沉淀，至终体积等于大约两倍的颗粒本身。例如，一个天真的小鼠的脾和淋巴结肿大，通常会产生一个约100微升细胞沉淀。在这种情况下，加入100μl的Fc块，使体积至200μl。如果已经发生了很大程度的细胞结块，小心地取出细胞聚集在这一点上与枪头。
2。四聚体染色
- 添加PE-或APC-标记的住房抵押贷款公司四聚体，使最终浓度为10nM（或凭经验优化的浓度）。
- Mix和温浴特1小时，在室温下（或凭经验优化时间和温度）。
- 加入冷分拣机缓冲液至体积为15毫升，离心管，4℃，300×g离心5分钟将样品在冰上或4°C从现在开始。
- 小心地吸出上清液，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。分拣机，至终体积为200μl的缓冲液中重悬细胞沉淀。对于双四聚体富集，重悬，至终体积为150μl。
3。磁富集
- 美天旎抗-PE或抗-APC微球中加入50微升。对于双四聚体浓缩，加入50微升两个。
- 混合孵育20分钟，在4°C。
- 加入冷分拣机缓冲液至体积为15毫升，离心管，4℃，300×g离心5分钟
- 在等待过程中，成立了美天旎LS在MidiMACS或QuadroMACS磁铁的磁性列。上一个开放的15毫升的聚丙烯离心管中放置机架的正下方列。
- 3毫升分拣机缓冲液加入到柱顶部，允许它排放到15毫升的试管。
- 放置为100μm的尼龙网正方形柱顶部。
- 当细胞已完成纺纱，小心地吸出上清液，将沉淀重悬于3毫升分拣机缓冲液。
- 细胞悬浮液转移到柱顶部通过尼龙筛。
- 当细胞悬浮液已完全耗尽成列，与另外3毫升分拣机缓冲液冲洗的原管和传输缓冲器通过尼龙筛入列，漂洗的过程中啮合。丢弃的尼龙网。
- 当缓冲区已完全耗尽入列，另外3毫升分拣机的缓冲列。
- 共3×3毫升洗涤，重复步骤10。
- 列磁铁和一个新的15毫升的聚丙烯离心管中取出。
- 加入5毫升分拣机的缓冲吨他列。
- 立即将柱塞压入列的顶部，在一个连续的动作，推动柱塞一路下来，强迫将缓冲区列管。
- 含有洗脱的结合的部分和流过的未结合的部分在300×g离心5分钟，4℃下离心管
- 小心地吸出上清液从绑定的馏分，确保没有在管的侧面上留下的液体微滴。细胞沉淀重悬在分拣机的缓冲液中，至终体积正好95微升。吸液和未结合的级分重新悬浮至终体积为2ml。
4。流式细胞仪
- 对于每个馏分，取出5微升，并加至200μl的计数珠（调整到200,000 /毫升在分拣机的缓冲液中的浓度）在5毫升的FACS管。抛开在4°C后进行分析。为了节省时间，珠可以预先等分标记的试管中，在实验开始之前。
- 准备是翠菊混合的抗体染色的细胞表面标志物（ 表1）。为了节省时间，这可以做到在实验开始前的。
- 对于绑定的馏分，直接添加一个剂量的抗体鸡尾酒〜90微升的细胞在管内。如果未结合的部分的分析，需要的话，90微升的细胞转移到一个5毫升的FACS管中，并添加一个剂量的抗体鸡尾酒。
- 设置为流式细胞仪单色补偿控制面板。以使用对于每个荧光染料，混合5毫升FACS管中的剩余的未结合的部分细胞加入50μl用1μl的共轭到相应的荧光染料的抗CD4抗体。记住设立染色的控制，以及。
- 涡街流量计和培育所有样品为30分钟，在4°C
- 在300×g离心5分钟，4℃，加入5毫升分拣机的缓冲液中，以每管和离心机
- 绑定馏分，小心吸上清液和细胞悬浮在200μl分拣机buf中FER。转移到了1.2毫升的FACS微管细胞。冲洗管到相同的微管200微升分拣机的缓冲区和游泳池。如果细胞团块是显而易见的，通过细胞通过一个50微米的过滤器。
- 对于未结合的部分补偿控制，倒出或吸出上清液，重悬在2毫升分拣机的缓冲区。
- 设置的流式细胞仪使用单色的补偿控制。作为一个额外的参数被记录，选择侧向散射宽度（SSC-W）。
- 分析连续列入门使用的序列，以确定CD4 +或CD8 + T细胞，如在图1和图2所示的染色样品。结合态，收集尽可能多的细胞尽可能最大的200事件总数。对于未绑定的部分，收集1,000,000总额事件。保持或低于3000事件每秒采集速率。
- 使用同一台机器上设置，计数珠样品进行分析。收集10,000个事件。</ P>
- FCS文件保存所有数据。
5。数据分析
- FCS数据文件的计数珠样本，使用FlowJo软件分析。绘制前方散射由FITC和设置栅极aroung的计数珠（请参阅图1和图2）。确定计数每个样品中检测到的小珠的总数。从收集的事件总数中减去的数量来确定的细胞收集的事件。
- 计算在每个样品中的所有细胞，使用框1中列出的方程的总数。
- 分析FCS数据文件的彩色绑定和未绑定的部分样品。连续列入门设定一个序列，以确定淋巴+侧分散宽度卤味 ，转储，CD3 +，CD4 +或CD8 +，四聚体+ T细胞在每个样品中，如在图1和图2中示出。
- 总量乘以频率每个列入门用于定义CD4 +四聚体的样品中的细胞数，由+或CD8 +四聚体+细胞的表位特异性T细胞（专栏1）计算的总数量。
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Representative Results
图1描述了代表性的流式细胞仪地块pMHCII四聚体富集的脾脏和淋巴结从幼稚小鼠的样品，而图2示出了有代表性的数据，先前与相关肽+ CFA免疫小鼠。串行浇注删除的分析CD4 + T细胞群的自体荧光和其他有害事件。的CD8 + T细胞群体作为一个有用的内部pMHCII四聚体染色的CD4 + T细胞的阴性对照。需要注意的是结合态的富集通常包含一个显着较高比例的自体荧光的细胞比未结合的部分，使门控更具挑战性的。
计算绝对数字的表位特异性ţ细胞样品中的相乘的所有细胞的总数的结合的馏分富集样品中，从该胎圈计数分析所确定，这些细胞是四聚体+中所占的比例，作为确定NED从细胞染色分析（见专栏1）。
对于天真的鼠标在图1中，所有细胞的浓度样品绑定馏分是（五千五百八十九分之四千四百一十一）（200,000）（0.200/0.005）= 6.31×10 6个 / ml。样品中的所有细胞的总数为（6.31×10 6个 / ml）（0.095）= 6.00×10 5。最后，表位特异性CD4 + T细胞的总数是（6.00×10 5）（41.5％）（96.6％）（10.2％）（62.3％）（0.64％）= 98。
对于在图2中的免疫小鼠，绑定馏分样品中的所有单元的浓度是（6410/3590）（200,000）（0.200/0.005）= 1.43×10 7个/ ml。样品中的所有细胞的总数为（1.43×10 7个 /毫升）（0.095）= 1.36×10 6个 。最后，表位特异性CD4 + T细胞的总数为（1.36×10 6）（40.9％）（93.9％）（9.54％）（72.0％）（42.7％）= 1.53×10 4 </ STRONG>。
富集的效率下降作为表位的特异性T细胞的数目增加8，因此可以看出，在含有非常高的频率的表位特异性的T细胞的样品的未结合部分的四聚体+细胞。在这种情况下，存在表位的特异性T细胞的数目的未结合的部分中，可以分别计算并添加到结合的部分中发现的数量。因此，在图2中的样品的未结合的部分中的所有单元的浓度是（969分之9031）（200,000）（0.200/0.005）= 7.46×10 7个/ ml，所有细胞的总数是（7.46所述10 7 /毫升）（2.0）= 1.49×10 8，和的总数量的表位特异性的CD4 + T细胞是（1.49×10 8）（62.7％）（96.4％）（44.5％）（54.7％）（0.0409 ％）= 8.97×10 3。添加号码绑定和未绑定的部分，有1.53×10 4 + 8.97×10 = 2.43所述10共4个表位特异性CD4 + T细胞在整个样本。事实上，如果是足够鲁棒的表位特异性的细胞膨胀，浓缩过程可被跳过。
| 荧光染料 | 抗体 |
| 太平洋蓝 | 的转储（B220，CD11b和素CD11c，F4/80） |
| 太平洋橙色 | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | 住房抵押贷款公司四聚体或表型标记 |
| PerCP | CD4 |
| APC | 住房抵押贷款公司四聚体或表型标记 |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
表1。抗体染色战略的
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图1流式细胞仪分析表位特异性CD4 + T细胞在天真的小鼠pMHCII四聚体为基础的浓缩。代表图上所显示的绑定的（A）和（B）未绑定的分数。接连不断的门，选择淋巴散射+，侧散射widthlo，自卸车，CD3 +事件。这些，CD4 +或CD8 +事件被选通，用于分析的特定表位的T细胞或背景染色。取未染色细胞的绑定（C）和绑定（D）部分混合荧光珠数颗，分别进行分析。 点击这里查看大图 。
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图2。流式细胞仪分析表位特异性CD4 + T细胞肽免疫小鼠后，pMHCII四聚体为基础的浓缩。代表图上所显示的绑定的（A）和（B）未绑定的分数。接连不断的门，选择淋巴散射+，侧散射widthlo，自卸车，CD3 +事件。这些，CD4 +或CD8 +事件被选通，用于分析的特定表位的T细胞或背景染色。取未染色细胞的绑定（C）和绑定（D）部分混合荧光珠数颗，分别进行分析。 点击这里查看大图 。
第1个框的表位特异性的T细胞数计算。
表位的特异性T细胞的绝对数量的最佳计算荧光计数珠与援助。的等分试样，未染色的从每个样品中的细胞混合，具有限定体积的计数珠设置在公知的浓度，然后通过流式细胞术分析。可以推断出在样品中的细胞的浓度，从比较它们的频率与已知浓度的荧光计数珠。
然后，计算出样品中的细胞的总数乘以细胞浓度与总的样品体积。
样品中的特定表位的T细胞的总数是简单的四聚体阳性的细胞的百分比乘以样品中的所有细胞的总数。
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Discussion
本协议提出的住房抵押贷款公司四聚体为基础的细胞富集方法的研究表位特异性T细胞内源性T细胞剧目是一个功能强大的工具。住房抵押贷款公司四聚体的使用，可以直接基于绑定同源住房抵押贷款公司配体的能力，其电阻温度系数的表位特异性的T细胞的检测。的富集提供了一个极为罕见的群体可以检测到抗原特异性T细胞的T细胞内源性剧目没有他们的基因构成任何操作或前体频率的灵敏度水平。其结果是，这种技术允许研究者直接追踪从在体内实验系统从他们的幼稚水平的内源性抗原特异性T细胞群，通过免疫反应的各个阶段。
该协议进行了优化，使用住房抵押贷款公司类II（pMHCII）的四表位特异性CD4 + T细胞从二级淋巴器官，以丰富s的小鼠。然而，该技术也适用于住房抵押贷款公司I类（pMHCI）四聚体和CD8 + T细胞的9。与CD4，CD8辅助受体起着重要的作用，在稳定TCR-MHC相互作用，这样就可以有实际的影响pMHCI四聚体染色10。最值得注意的是，CD8抗体的使用应该限制在不损害CD8 +四聚体结合的克隆，它们应该被添加到四聚体染色后的细胞。事实上，一些pMHCI四聚体已被设计与突变MHCI-CD8 +结合位点，以减轻CD8 + T细胞的非特异性结合的11,12。
四聚体的浓度，培养时间，及培养温度可以大大影响效率的四聚体染色，和条件应进行优化，以实现高的四聚体的信号，低背景信号，低的四聚体的内化，和最小的变化，细胞生理学的最佳组合。在理想的情况下，这些条件应Ë实验确定每一个独特的试剂。然而，在我们的手中，最终浓度为10nM的和在室温下孵育1小时，提供良好的通用条件大多数pMHCI或pMHCII四聚体。一般来说，pMHCI四聚体似乎更容易比pMHCII四聚体染色，和染色通常可以低至30分钟，在4℃下进行。
此过程的规模适合于几乎所有的次级淋巴器官鼠标在单个样品的分析。因此，每个样本代表了一个相当全面的分析，整个循环的外周T细胞库的鼠标。表位特异性的T细胞，也可以从其他相关组织，包括胸腺13,14富集。当thymii从4-5周龄小鼠进行了分析，表位特异性的单阳性胸腺细胞可检测到周的幼稚T细胞相似的那些号码。表位特异性的双阳性胸腺细胞，然而，很难检测到，由于其低的TCR的表达水平。
此协议也可以适于检测表位特异性的人类CD4 +或CD8 + T细胞在血液或其它组织15-17。小鼠和人类17之间是大致相同的表位特异性的T细胞的频率，因此，50 - 100毫升血液中的分析将产生相当数量的作为汇集的鼠标18的脾脏和淋巴结的T细胞表位特异性。
流式细胞仪分析细胞四聚体为基础的浓缩的一个主要挑战是从背景中区分真正的细胞事件。这主要是由于到的事实，即许多自身荧光的细胞是在这个过程中也非特异性富集。如果不小心开启出来，这些自体荧光的细胞可以显示为假四聚体阳性细胞，甩开的分析的精度，特别是在罕见的幼稚T单元P的箱子opulations。我们的协议采用两个步骤的门控策略CD3 +事件是第一门控远离转储谱系+事件，然后CD4 +远离CD8 +的事件，事件被选通。在这个过程中，自体荧光的细胞，这往往在于沿对角线任何FACS图的中心，被选通，满分分析在两个迭代步骤。有效去除水中的自体荧光事件的在许多荧光色的成本，因此，我们强烈建议您使用流式细胞仪，能够在至少6个荧光参数。
大多数住房抵押贷款公司的四聚体是共轭PE和APC由于这些荧光染料的亮度，和抗-PE和抗-APC磁性微珠都是现成的，使与他们的富集。然而，其他的荧光染料也可以使用，只要相应的磁微珠可。事实上，可以用不同的荧光色素标签的多个四聚体与相应的抗体共轭的话筒一起使用robeads同时丰富的多个表位特异性的T细胞群，从相同的样本。我们已概述一个非常基本的抗体-荧光染料的使用PE-和APC标记的四聚体（ 表1）]是优化的设置，但许多其他有效的组合是可能的表型标记物的研究中，以增加灵活性。
CD8 + T细胞群体可以被用作一个内部的阴性对照，因为它们不应该绑定到pMHCII配体（和表位特异性CD8 + T细胞富集反之亦然）。样品中的四聚体+ CD8 +细胞的频率提供了良好的评估的背景水平的四聚体染色，虽然真正的四聚体阳性的CD8 + T细胞与交叉限制pMHCII表位的特异性，可能存在在非常小的频率19。偶尔在非常强烈的免疫反应，这些细胞可能存在于扩展频率。如果需要的话，TCR转基因T细胞的智慧h或无相关的表位特异性的，可以使用的额外的阳性和阴性对照。请注意，不知什么原因，一些TCR转基因和杂交瘤细胞不染色以及与他们有关的四聚体。
我们的协议涉及的荧光计数珠的使用，以协助在计算细胞数量。虽然细胞计数也可以手动实现，我们发现，用血细胞计数器计数珠的查询结果实验精度更大的使用，尤其是当多个研究者都参与。由于在本协议中所处理的细胞的数量和体积小，实验误差的最小化应该是一个高优先级。
四聚体是细胞固定和通透的兼容，和一些研究已经成功地分析了细胞内细胞因子和转录因子在细胞中表达后，四聚体的细胞富集20,21。但是，所涉及的额外的步骤有助于额外的细胞样品中的损失。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢安德烈·汉和劳伦斯日元的技术援助，成员的詹金斯实验室的帮助，在此协议的发展。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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