Summary
Une technique expérimentale pour le traitement de défauts ostéochondraux dans l'articulation du genou du lapin est décrite. L'implantation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans des défauts ostéochondraux offre un développement prometteur dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. La préparation de la fibrine cellule caillots
Protocol
A. Préparation d'un lapin de donateurs pour l'isolement des cellules souches mésenchymateuses (salle d'opération)
- Les cellules sont isolées à partir de New blancs (NZB) lapins mâles Zélande à l'âge de 4 mois et environ 3 kg de poids corporel.
- Induire une anesthésie par propofol (10 mg / kg de poids corporel iv) et le sacrifice avec du pentobarbital sodique (100 mg / kg de poids corporel iv).
- Rasage fourrure de membres postérieurs, le dos et le ventre avec une tondeuse électrique et l'aspirateur sur la fourrure.
- Désinfectez la zone rasée soigneusement avec de l'éthanol à 70%.
- Utilisez une pince émoussée, ciseaux pointus (ou scalpel) et les couteaux en os pour les tissus et les ligaments.
- Faire une incision le long de la surface crânienne de la jambe et du mollet.
- Refléter la peau et du tissu sous-cutané soit par dissection tranchants ou contondants.
- Séparez les muscles et les ligaments du tibia et du fémur. Gardez coupes aussi près de l'os que possible de faire une dissection propre. Ne pas séparer fémur tibia en ce moment.
- Couper THRough l'articulation de la hanche pour séparer la tête du fémur dans le cotyle.
- Élever le complexe tibio-fémorale.
- Utilisez le scalpel pour gratter les tissus mous reste de l'os ou les os frotter avec des tissus de tissu stérile. À ce stade, le fémur et le tibia sont toujours connectés.
- Retirer la rotule en coupant, puis couper les ligaments du genou aux os séparés enfin.
- Pulvérisation os séparé avec 70% d'éthanol, laissez sécher à l'air et placez chaque os dans un tube à centrifuger de 50 ml avec un milieu de culture cellulaire (DMEM + 1% de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep)) pour les garder humides.
- Maintenant basculer sous une culture hotte à flux laminaire stérile cellulaire.
B. Rinçage des MSC de lapin de Bones et extension (Culture Cellulaire Hood)
- Collectez les os de tubes et de les placer dans des boîtes de 150 mm à l'aide de pinces stériles.
- Retirez les deux extrémités des os avec une scie stérile et déplacer les pièces de nouveaux plats de 150 mm.
- Remplir une seringue de 10 ml avec medium (DMEM), attacher une aiguille de calibre 18 et de l'insérer dans l'ouverture de la moelle osseuse.
- Ensuite, rincez cavité de la moelle avec le milieu pour vider la moelle osseuse dans le plat. Ensuite, rincez à l'autre bout, si possible. Si nécessaire, sciez plus à partir des extrémités. Si l'os se casse, il suffit de rincer l'intérieur de l'os.
- Aspirer la suspension d'un milieu de cellules dans la seringue et rincer la moelle osseuse jusqu'à ce que la suspension demeure mobile à travers la cavité de la moelle osseuse et pas plus loin de la moelle osseuse des caillots apparaissent.
- Une fois la moelle osseuse ont été recueillies à partir de tous les os, perturber les touffes de moelle en passant par une aiguille de calibre 18: remplir une seringue avec une aiguille attachée et le forcer à en moyenne.
- Ensuite, on filtre la suspension à travers un filtre de cellules dans un tube de 50 ml. Afin d'éviter la perte de cellules, lavez culture plat 2x avec 10 ml de milieu et de filtrer ainsi.
- Centrifuger la suspension à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension cellulaire pêleet dans 10 ml de milieu (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Globules Séparez les périphériques cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant une solution de séparation Biocoll.
- Remplissez 5 ml de Biocoll Séparation solution dans un tube de 15 ml et ajouter avec précaution 5 ml de suspension cellulaire sur le dessus et centrifuger à 800 g pendant 20 min à température ambiante (sans frein).
- Résultats possibles, voir Figure 1: Etre plus dense que Biocoll, globules rouges sédiments au fond tandis que les cellules souches mésenchymateuses CMSP et restent à l'interface.
- Retirez délicatement interface dans un tube de 15 ml et laver avec 5 ml de PBS.
- Centrifuger comme décrit dans l'étape 22, remettre en suspension dans 5 ml de PBS et répéter 2 à 3 fois.
- Ensuite, centrifuger à 350 g pendant 10 min à température ambiante (avec frein).
- Remettre en suspension dans 10 ml de milieu et de compter les cellules dans un hémocytomètre.
- Cellules de la plaque à une densité d'ensemencement initial de l'ordre de 5 x 10 6 à 150 plats mm.
- Après 2-3 jours, redéplacer les cellules non adhérentes. Vous pourriez avoir à rincer avec PBS premier pour éliminer les débris cellulaires. Ajoutez milieu complet frais (DMEM + 10% sérum de veau foetal (FCS) + 1% Pen / Strep) par la suite.
- Nourrir les cellules tous les 3-4 jours (Figure 2).
- Après 5-10 jours, le passage des cellules pour la première fois.
C. Préparation des caillots de fibrine in vitro
- Au jour de l'implantation, libérer les cellules adhérentes de flacons / plats par un min-exposition de 3 à 0,25% de trypsine-EDTA. Arrêter la trypsine en ajoutant un milieu complet.
- Distribuer des cellules dans un tube Falcon de 50 ml et les laver deux fois avec PBS.
- Déterminer la viabilité cellulaire et numéros par coloration au bleu trypan.
- Ajouter 50.000 cellules / tube de centrifugation et recueillir pellets par centrifugation à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Préparation d'un mélange maître pour au moins un caillot plus que nécessaire.
- Reprendre le culot cellulaire dans 17 pi de PBS et mélanger 25 ul de la composante de fibrinogène TISSUCOL-Kit avec cette 17 ul suspension de MSC.
- Prenez une plaque stérile avec des trous pré-percés (3x3.6 mm), conformément à des trous de forage in vivo (figure 3).
- Tout d'abord, ensemencer une solution de thrombine 4 pi (500 UI / ml) dans un trou, suivie de l'addition immédiate de 42 ul de fibrinogène suspension cellulaire et de nouveau quatre solution de thrombine pi sur le dessus. Ne pas mélanger la suspension pour éviter la coagulation dans la pointe de la pipette. Tout d'abord, le volume de 50 ul du fibrinogène suspension cellulaire pipetté doit dépasser le bord des trous pré-percés sans fondre en raison de la tension de surface. Cependant, après coagulation complète (après 60 min) le caillot se contracte et se glisse dans le trou pré-percé.
- Retirez le caillot soigneusement à l'aide d'une pince émoussée et le placer dans un tube à centrifuger avec PBS. Préparer 2 caillots / animal.
- Prenez les caillots à la salle de chirurgie.
D. Implantation des allogéniques de cellules souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine
- Induire une anesthésie de lapin (NZB, mâle, 3,5-4,0 kg de poids corporel, vieux 5-6 mois) par injection intraveineuse de propofol (10 mg / kg de poids corporel).
- Raser le genou à opérer avec une tondeuse électrique et vide la fourrure. Toutes les procédures nommés avant sont effectuées dans une salle de préparation de la chirurgie pour éviter la contamination de l'environnement stérile de la salle d'opération.
- Après l'intubation, maintenir l'anesthésie avec 1,5 mg / kg / min propofol et 0,05 mg / kg / min fentanyl par voie intraveineuse. Surveiller anesthésie en utilisant la capnographie, l'oxymétrie de pouls et de la fréquence du pouls.
- Désinfecter le genou rasée à fond et couvrir le reste de lapin avec un pansement stérile.
- Palper la rotule et d'effectuer une incision de la peau interne de la rotule.
- Ouvrez l'articulation du genou par une arthrotomie parapatellaire interne dans des conditions stériles. Essayez d'éviter de couper des petits vaisseaux sanguins superficiels.
- Déplacer la rotule latéralement (Figure 4).
- Après Inspection de l'articulation de genou pour les lésions du cartilage concomitantes ou anomalies communes, créer deux défauts ostéochondraux (3 mm de profondeur, la figure en forme de huit) dans la gorge de la trochlée avec une perceuse électrique de commande de l'air stérile (3,6 mm de diamètre) avec un dispositif d'arrêt (Figure 5).
- Nettoyez les défauts et les rincer avec une solution saline stérile.
- Avant l'implantation, remplir 20 pi de colle de fibrine dans les défauts et les distribuer uniformément sur le fond du défaut.
- Puis implanter les caillots emmanché dans la figure défaut en forme de huit.
- Après coagulation, déplacer la rotule à l'intérieur de la gorge de la trochlée et plier et étirer le genou à quelques reprises.
- Déplacer la rotule latéralement une fois de plus et vérifier si fibrinogène cellulaires caillots sont toujours en place.
- Remplacez à nouveau la rotule et terminer l'opération de fermeture de la plaie en couches avec bouton sutures simples (4-0 Vicryl) et une suture cutanée continue (4-0 Monocryl) (tous deux avec suture absorbablematériel).
- Enfin, sceller la plaie avec un spray pansement perméable à la vapeur d'eau.
- Pour les soins post-opératoires, la blessure est vérifiée par jour pendant 7 jours. Les lapins reçoivent pour l'analgésie post-opératoire Carprofen 4 mg / kg sc toutes les 24 heures (4 jours) et Buprénorphine 0,03 mg / kg sc toutes les 12 heures (pendant 2,5 jours). Une stabilisation du genou (par exemple pansement) n'est pas nécessaire.
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Representative Results
La technique chirurgicale décrite permet un isolement réussi et l'implantation de cellules souches mésenchymateuses allogènes dans un défaut ostéochondral artificielle. Le dispositif expérimental a entraîné une intégration réussie de l'implant dans le cartilage environnant.
Le défaut a été comblé par la réparation des tissus aux propriétés biomécaniques et la durabilité similaire par rapport au cartilage environnant. La fibrine-cell-caillot a été préparé in vitro sur un plateau stérile avec des trous pré-percés, qui avaient la même taille que le défaut osteochondral (Figure 3). En conséquence, il n'y avait pas de fissures entre le caillot de fibrine implanté et le cartilage environnant, ce qui serait un facteur de risque de dégénérescence prématurée ou délaminage (Figure 6). Un cicatrisation basale du tissu de réparation a été assurée car l'os sous-chondral a été pénétré, et donc a travaillé sur un cisaillement. Un autre aspect important est le STIFFNESS du tissu de réparation, qui doit correspondre à la bonne santé des tissus environnants de cartilage afin d'éviter une charge accrue sur elle et une possible dégénérescence prématurée. Dans nos expériences préliminaires (données non présentées), nous avons montré qu'après 12 semaines, une rigidité suffisante pourrait déjà être atteint. En outre, une surface intacte et homogène de la greffe a été trouvée, ce qui a réduit la contrainte de cisaillement et de possibles dommages de l'implant (Figure 6).
Figure 1. La séparation des cellules sanguines et plasma de CMSP et les MSC en utilisant Biocoll Solution séparation.
Figure 2. Monocouche de cellules souches mésenchymateuses (New Zealand White rabbit) après 5 jours de culture.
Figure 3. Plaque stérile avec des trous pré-percés (3x3.6 mm) du haut étant remplies d'un fibrine cellule caillot.
Figure 4. Ouvert articulation du genou après arthrotomie parapatellaire interne.
Figure 5. Défauts ostéochondraux (3 mm de profondeur, 3 mm de diamètre, figure en forme de huit) dans la gorge de la trochlée.
Figure 6. Ouvert du genou 12 semaines après l'implantation de deux-cell-caillots de fibrine en deux défauts ostéochondraux forés.
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Discussion
Au cours des dernières années, la possibilité de traiter les défauts ostéochondraux articulaires complexes - tels que ceux résultant d'ostéochondrite, ostéonécrose et les traumatismes - avec les approches d'ingénierie tissulaire est devenu de plus en plus attrayant. Dans les entités pathologiques mentionnés précédemment, des dommages aux tissus s'étend à l'os sous-chondral et implique deux tissus caractérisés par différentes capacités de guérison intrinsèques 1. Il ya un intérêt croissant pour le rôle de l'os sous-chondral pour les processus pathogènes de osteochondral dommages articulaires 11,23. Les conditions fonctionnelles du cartilage articulaire et de son support osseux sont étroitement liés. Les blessures des deux tissus nuire à l'environnement mécanique ainsi que l'équilibre homéostatique de l'ensemble de joint 24. Des altérations dans l'appareil ostéo par une rupture mécanique de la mobilité articulaire, la formation de corps lâche, l'usure mécanique dans le compartiment impliqué et l'attrition dessurfaces adverse peut conduire à une apparition plus précoce et le développement de l'arthrose 1,11. Par conséquent, les approches d'ingénierie tissulaire pour la régénération des défauts ostéochondraux doivent être accompagnées d'une restauration adéquate de l'os sous-chondral afin de renforcer l'union effective avec les tissus environnants d'accueil 2. Les cellules souches mésenchymateuses semblent être une source de cellules idéal pour offrir à ces exigences spécifiques de réparation osteochondral. Le protocole met en évidence la promotion de l'os et de la restauration d'un tissu de cartilage par potentiellement induire la différenciation sélective de cellules souches mésenchymateuses transplantées dans des lignées ostéogéniques et chondrocytaire.
En comparaison avec les chondrocytes, les cellules souches mésenchymateuses ont plusieurs avantages importants: ils peuvent être facilement isolées de la moelle osseuse, synovialis et le tissu adipeux sans une plus grande morbidité côté des bailleurs de fonds. Les cellules souches mésenchymateuses ne différencient au cours de l'expansion in vitro etpeut donc être élargi à la culture en grand nombre pour traiter les gros défauts du cartilage articulaire. En outre, ils semblent être immunosuppresseur et - en réponse à des stimuli appropriés - peuvent se différencier en chondrocytes et les ostéocytes 25,26. Un autre avantage remarquable de cellules souches mésenchymateuses affiche leur hypoimmunity, ce qui signifie que les cellules souches mésenchymateuses allogéniques peuvent être utilisés sans aucun signe de réaction de rejet 27. Par conséquent, une cellule-piscine d'un ou deux animaux donneurs peut être suffisant pour toutes les expériences. Cela réduit le temps de fonctionnement et des dommages supplémentaires pour les animaux.
Plusieurs expériences ont montré des résultats prometteurs en utilisant la colle de fibrine pour la réparation osteochondral 19,20. Habituellement, l'inoculation du fibrinogène suspension cellulaire avec une solution de thrombine a été décrit comme une procédure faite in situ, directement dans les lésions ostéochondrales artificiels. Après une courte période de temps de pré-coagulation (après quelques minutes,) De l'opération est généralement terminée par déplacement de la rotule et de la fermeture de la plaie.
Dans plusieurs essais pilotes, nous avons découvert que de disposer de suffisamment de coagulation de la fibrine cellules en suspension, il faut plus de 60 minutes In situ -. Lors de l'opération - il n'est pas possible d'attendre plus de 60 minutes pour l'ensemble de la coagulation. En outre, par l'utilisation d'une plaque stérile avec des trous pré-percés simulant les lésions ostéo-cartilagineuses, il a été possible de montrer que la quantité de colle de fibrine, qui a été utilisé pour remplir évidemment le défaut complètement, n'était pas suffisant en raison de la diminution du caillot durcissement . Cela nécessite une augmentation du volume de colle de fibrine à l'avance afin d'obtenir un remplissage congruente et complète du défaut. Effectuer la préparation du caillot in vitro, il est possible d'ajuster facilement la forme construction à la taille appropriée du défaut foré et donc combler le défaut osteochondral totalement et congruente.
En outre, unn in vitro préparation des caillots de cellules empêche une fuite de la colle, mais (après seulement quelques minutes) pas complètement durci fibrine suspension cellulaire. Par conséquent, il peut être garanti que le volume initialement prévu restera dans le défaut et débutera avec l'intégration du cartilage et le remodelage.
La technique décrite permet une méthode normalisée pour la recherche sur les cellules souches expérimental dans le domaine de la réparation osteochondral. Le protocole prévoit de manière reproductible afin d'isoler des cellules souches mésenchymateuses en vue de réimplanter plus tard dans les défauts du cartilage ostéochondraux de l'articulation du genou du lapin. Chondrocytes autologues ont déjà été implantés dans des défauts ostéochondraux dans une cellule de fibrine-modèle 19. L'utilisation d'un modèle in vitro de préparation caillot ainsi que les cellules souches mésenchymateuses à la place de chondrocytes dans semble être une nouvelle approche plus avantageux et prometteur pour la rénovation et la réparation des lésions ostéochondrales.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par l'Association allemande pour la recherche (subvention HE 4578/3-1) et en partie par le 7e PC de l'UE-Project "GAMBA" NMP3-SL-2010-245993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
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