Summary
Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di fibrina-cell-coaguli
Protocol
A. Preparazione di un coniglio dei donatori per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali (Chirurgia Camera)
- Le cellule sono isolate dal maschio Nuova Zelanda bianchi (NZW) conigli all'età di 4 mesi e di circa 3 kg di peso corporeo.
- Indurre l'anestesia con propofol (10 mg / kg di peso corporeo iv) e il sacrificio con sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo iv).
- Shave pelliccia da arti posteriori, schiena e pancia con un tagliatore elettrico e aspirare la pelliccia.
- Disinfettare accuratamente la zona rasata con il 70% di etanolo.
- Utilizzare pinze smussato, forbici affilate (o bisturi) e frese per il tessuto osseo e legamenti.
- Fare un'incisione lungo la superficie craniale della gamba e del polpaccio.
- Riflettere cute e del tessuto sottocutaneo da una dissezione tagliente o contundente.
- Distinti muscoli e legamenti di tibia e del femore. Mantenere tagli come vicino all'osso possibile per fare una dissezione pulito. Non separare femore dalla tibia in questo momento.
- Tagliare through l'anca per separare la testa del femore dalla dell'acetabolo.
- Elevare il complesso tibio-femorale.
- Utilizzare il bisturi per togliere qualsiasi tessuto molle restante dalle ossa o strofinare le ossa con i tessuti panno sterile. A questo punto, femore e tibia sono ancora connessi.
- Rimuovere rotula da taglio, quindi tagliare ginocchio legamenti articolari alle ossa distinte infine.
- Spray ossa separato con il 70% di etanolo, lasciare asciugare e mettere ogni osso in un tubo da centrifuga da 50 ml con mezzo di coltura cellulare (DMEM + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per mantenerli umidi.
- Ora passare sotto una cultura cappa a flusso laminare sterile cella.
B. Flushing del Coniglio MSC da Ossa e di espansione (Cell Culture Hood)
- Raccogliere le ossa da tubi e metterli in 150 millimetri piatti utilizzando pinze sterili.
- Rimuovere entrambi osso finisce con una sega sterile e pezzi trasferirsi a New mm piatti 150.
- Riempire una siringa da 10 ml con medium (DMEM), collegare un ago di calibro 18 e inserire nell'apertura del midollo osseo.
- Poi, sciacquare cavità midollare con il mezzo per svuotare il midollo osseo nel piatto. Successivamente sciacquare dall'altra estremità, se possibile. Se necessario, segare più dalle estremità. Se osso dovesse rompere, basta lavare l'interno dell'osso.
- Aspirare sospensione medie cella nella siringa e sciacquare il midollo osseo ripetutamente fino sospensione è libera fluttuante attraverso il midollo osseo cavità e nessuna ulteriore midollo osseo coaguli compaiono.
- Una volta che il midollo osseo è stato raccolto da tutte le ossa, disturbare i ciuffi di midollo passando attraverso un ago di calibro 18: Riempire una siringa con ago e forza fuori in mezzo.
- Successivamente, filtrare la sospensione attraverso un filtro cella in un tubo da 50 ml. Al fine di prevenire la perdita di cellule, lavare coltura piatto 2x con 10 ml di mezzo e filtrare pure.
- Centrifugare sospensione a 500 xg per 5 min a RT.
- Rimuovere il surnatante e risospendere cella pellet in 10 ml di terreno (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Globuli separati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e cellule staminali mesenchimali (MSC) usando una soluzione Biocoll separazione.
- Riempire 5 ml di Biocoll Separare soluzione in una provetta da 15 ml e aggiungere cautamente 5 ml di sospensione cellulare in cima e centrifugare a 800 xg per 20 min a TA (senza freno).
- Possibili risultati vedi Figura 1: Essendo più denso rispetto Biocoll, globuli rossi sedimenti sul fondo, mentre le cellule staminali mesenchimali PBMC e rimangono all'interfaccia.
- Rimuovere con attenzione l'interfaccia in un tubo da 15 ml e lavare con 5 ml di PBS.
- Centrifugare come descritto al punto 22, risospendere in 5 ml di PBS e ripetere 2-3x.
- Poi, centrifugare nuovamente a 350 xg per 10 min a TA (con freno).
- Risospendere in 10 ml di mezzo e contare le cellule in un emocitometro.
- Cellule piastra ad una densità di semina iniziale di circa 5 x 10 6 a 150 millimetri piatti.
- Dopo 2-3 giorni, rispostare cellule non aderenti. Potrebbe essere necessario lavare con PBS prima al fine di rimuovere i detriti cellulari. Aggiungere mezzo fresco completo (DMEM + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1% Pen / Strep) dopo.
- Nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (Figura 2).
- Dopo 5-10 giorni, passaggio alle cellule per la prima volta.
C. Preparazione di coaguli di fibrina in vitro
- Al giorno di impianto, rilasciate da cellule aderenti beute / stoviglie da 3 min-esposizione al 0,25% tripsina-EDTA. Arrestare tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo.
- Distribuire le cellule in una provetta da 50 falco e lavare due volte con PBS.
- Determinare la vitalità cellulare e numeri blu tripano colorazione.
- Aggiungi 50.000 cellule / provetta e raccogliere pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare una mastermix per almeno un altro coagulo come necessario.
- Risospendere il pellet di cellule in 17 ml di PBS e mescolare 25 ml di componente di fibrinogeno di TISSUCOL-Kit con questo 17 microlitri di sospensione MSC.
- Prendete un piatto sterile con fori predisposti (3x3.6 mm), in conformità ai fori in vivo (Figura 3).
- Prima, inoculare 4 microlitri soluzione di trombina (500 UI / ml) in un foro, seguita da aggiunta di 42 microlitri immediato fibrinogeno-cell-sospensione e nuovo 4 microlitri soluzione di trombina in cima. Non mescolare la sospensione per evitare la coagulazione nella punta della pipetta. Prima, il volume di 50 microlitri della pipettato fibrinogeno-cell-sospensione sporgerà il bordo dei fori pre-forati senza fondere a causa della tensione superficiale. Tuttavia, dopo la completa coagulazione (dopo 60 min) il coagulo si contrae e si inserisce nel pre-foro.
- Rimuovere il coagulo con cura utilizzando una pinza smussato e posto in una provetta con PBS. Preparare 2 coaguli / animali.
- Prendete i coaguli in sala operatoria.
D. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina
- Indurre l'anestesia di coniglio (NZW, maschio, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 5-6 mesi di età) per iniezione endovenosa di propofol (10 mg / kg di peso corporeo).
- Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia. Tutte le procedure denominate prima vengono eseguite in una camera di preparazione intervento chirurgico per evitare la contaminazione dell'ambiente sterile della sala operatoria.
- Dopo l'intubazione, mantenere l'anestesia con 1.5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg / min fentanil per via endovenosa. Monitorare l'anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca.
- Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una medicazione sterile.
- Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula.
- Aprire l'articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare di tagliare i piccoli vasi sanguigni superficiali.
- Spostare la rotula lateralmente (figura 4).
- Dopo INSPEction dell'articolazione del ginocchio per le lesioni cartilaginee concomitanti o anomalie comuni, creare due difetti osteocondrali (di profondità 3 mm figura a forma di otto) nel solco trocleare con aria sterile trapano elettrico di funzionamento (3,6 millimetri di diametro) con un dispositivo di arresto (Figura 5).
- Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile.
- Prima dell'impianto, riempire 20 pl di colla di fibrina nei difetti e distribuirli uniformemente sul fondo del difetto.
- Poi impiantare i coaguli inserito a pressione nella figura difetto a forma di otto.
- Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e piegare e distendere il ginocchio un paio di volte.
- Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare se il fibrinogeno-cellulari-coaguli sono ancora al loro posto.
- Sostituire nuovamente la rotula e terminare l'operazione con chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continuo (4-0 Monocryl) (entrambe con sutura riassorbibilemateriale).
- Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo.
- Per assistenza post-operatoria, la ferita viene controllato giorno per 7 giorni. I conigli ricevono per la post-operatoria analgesia Carprofen 4 mg / kg sc ogni 24 ore (per 4 giorni) e Buprenorphin 0,03 mg / kg sc ogni 12 ore (per 2,5 giorni). Una stabilizzazione del ginocchio (es. medicazione) non è necessaria.
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Representative Results
La tecnica chirurgica descritta permette un isolamento di successo e impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in un difetto osteocondrale artificiale. Il setup sperimentale ha comportato una integrazione dell'impianto nella cartilagine circostante.
Il difetto è stato riempito da riparazione dei tessuti con proprietà biomeccaniche simili e durata simile rispetto alla cartilagine circostante. La fibrina-cell-coagulo è stato preparato in vitro su un piatto sterile con fori pre-forati, che aveva la stessa dimensione del difetto osteocondrale (Figura 3). Come risultato, non c'erano fessure tra il coagulo di fibrina impiantato e la cartilagine circostante, che sarebbe un fattore di rischio per la degenerazione o delaminazione prematura (Figura 6). Una guarigione basale del tessuto di riparazione è stata assicurata perché l'osso subcondrale era penetrato, e quindi lavorato contro un gruppo di troncatura. Un altro aspetto importante è stata la stiffness del tessuto di riparazione, che dovrebbe corrispondere al tessuto cartilagineo sano circostante per evitare un aumento del carico su di esso e una possibile degenerazione prematura. Nei nostri esperimenti preliminari (dati non mostrati), abbiamo dimostrato che dopo 12 settimane una sufficiente rigidità potrebbe già essere raggiunto. Inoltre, è stata trovata una superficie intatta e omogenea del trapianto, che ha ridotto sforzo di taglio e possibili danni all'impianto (Figura 6).
Figura 1. Separazione delle cellule del sangue e del plasma da PBMC e MSC utilizzando Biocoll Solution separazione.
Figura 2. Monostrato di cellule staminali mesenchimali (New Zealand White rabbit) dopo 5 giorni di coltura.
Figura 3. Piastra sterile con fori predisposti (3x3.6 mm), quello superiore viene riempito con un fibrina-cella-coagulo.
Figura 4. Inaugurato ginocchio dopo artrotomia mediale parapatellare.
Figura 5. Difetti osteocondrali (profondità 3 mm e 3 mm di diametro, a forma di figura otto) nel solco trocleare.
Figura 6. Inaugurato articolazione del ginocchio 12 settimane dopo l'impianto di due fibrina-cell-coaguli in due difetti osteocondrali perforati.
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Discussion
Negli ultimi anni, la possibilità di trattare complesse articolari difetti osteocondrali - come ad esempio quelli derivanti da osteocondrite dissecante, osteonecrosi e traumi - con approcci di ingegneria dei tessuti è diventato sempre più attraente. Nelle entità patologiche precedentemente menzionati, danno tissutale estende all'osso subcondrale e coinvolge due tessuti caratterizzati da differenti capacità curative intrinseche 1. Vi è un interesse crescente per il ruolo di osso subcondrale per i processi patogenetici di danno articolare osteocondrale 11,23. Le condizioni funzionali della cartilagine articolare e il suo osso di sostegno siano collegati saldamente. Gli infortuni di entrambi i tessuti impatto negativo sull'ambiente meccanica così come l'equilibrio omeostatico della intera articolazione 24. Alterazioni nella unità osteocondrale attraverso distruzione meccanica di movimento articolare, formazione di corpo libero, usura meccanica nel compartimento coinvolto e logoramento deisuperfici opposte può portare ad un esordio più precoce e lo sviluppo di artrosi 1,11. Pertanto, gli approcci di ingegneria tissutale per la rigenerazione dei difetti osteocondrali devono essere accompagnati da un adeguato restauro dell'osso subcondrale sottostante al fine di migliorare l'effettiva unione con circostanti tessuti ospite 2. Le cellule staminali mesenchimali sembrano essere una fonte cellulare ideale per fornire questi requisiti specifici di riparazione osteocondrale. Il protocollo evidenzia la promozione di osso e cartilagine dal restauro potenzialmente inducendo la differenziazione selettiva delle cellule staminali mesenchimali trapiantate in lignaggi osteogenico e condrogenico.
In confronto ai condrociti, cellule staminali mesenchimali presentano diversi importanti vantaggi: possono essere facilmente isolate da midollo osseo, synovialis e tessuto grasso senza alcun lato maggiore morbilità donatore. Le cellule staminali mesenchimali non differenziano durante l'espansione in vitro equindi può essere cultura-ampliato in gran numero per il trattamento di grandi difetti della cartilagine articolare. Inoltre, essi sembrano essere immunosoppressiva e - in risposta a stimoli appropriati - può differenziarsi in condrociti e osteociti 25,26. Un altro notevole vantaggio di cellule staminali mesenchimali mostra loro hypoimmunity, il che significa che le cellule staminali mesenchimali allogeniche può essere utilizzato senza alcun segno di reazione di rigetto 27. Pertanto, una cellula-pool da uno o due animali donatori può essere sufficiente per tutti gli esperimenti. Questo riduce il tempo di funzionamento e ulteriori danni agli animali.
Diversi esperimenti hanno mostrato risultati promettenti con colla di fibrina per la riparazione osteocondrale 19,20. Solitamente, l'inoculazione del fibrinogeno-cellula-sospensioni con soluzione di trombina è stata descritta come una procedura eseguita in situ, direttamente nelle lesioni osteocondrali artificiali. Dopo un breve periodo di tempo di pre-coagulazione (dopo pochi minuti) L'operazione è di solito finito spostando la rotula e la chiusura della ferita.
In diversi test pilota, abbiamo scoperto che per sufficiente la coagulazione della fibrina-cellula-sospensioni ci vogliono più di 60 minuti in situ -. Durante l'operazione - è quasi impossibile aspettare più di 60 minuti per tutta la coagulazione. Inoltre, mediante l'uso di una piastra sterile con fori predisposti simulano le lesioni osteocondrali, è stato possibile dimostrare che la quantità di colla di fibrina, che è stato utilizzato per riempire il difetto ovviamente completamente, non era sufficiente a causa della contrazione del coagulo indurimento . Questo richiede un maggiore volume di colla di fibrina in anticipo per ottenere un riempimento congruente e completa del difetto. Eseguire la preparazione del coagulo in vitro è possibile regolare facilmente la forma costrutto alla dimensione appropriata del difetto forato e quindi riempire il difetto osteocondrale totalmente e congruente.
Inoltre, unn in vitro preparazione dei coaguli cella impedisce una fuoriuscita dell'adesivo ma (dopo pochi minuti) non completamente indurito fibrina-cell-sospensione. Pertanto, si può garantire che il volume inizialmente prevista rimarrà nel difetto e inizierà con integrazione cartilaginea e rimodellamento.
La tecnica descritta consente un metodo standard per la ricerca sperimentale con cellule staminali nel campo della riparazione osteocondrale. Il protocollo fornisce un modo riproducibile per isolare le cellule staminali mesenchimali al fine di ri-impiantare successivamente in difetti della cartilagine articolare osteocondrali del ginocchio del coniglio. Condrociti autologhi sono già stati impiantati in difetti osteocondrali in una-cella-modello fibrina 19. Utilizzando un modello in vitro di preparazione coagulo così come le cellule staminali mesenchimali, invece di condrociti sembra essere un nuovo approccio più vantaggioso e promettente per il rimodellamento e la riparazione delle lesioni osteocondrali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dalla German Research Association (concessione HE 4578/3-1) e in parte dal 7 ° PQ UE-Progetto "GAMBA" NMP3-SL-2010-245993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
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