Summary
Cancer associeret Fibroblaster (CAFS) lette tumor initiering, vækst og progression gennem signalere, der fremmer spredning, angiogenese og inflammation. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere rene populationer af normale fibroblaster og CAFS fra frisk muse og humane væv ved cellesortering under anvendelse PDGFRα som overflademarkør.
Abstract
Cancerassocierede fibroblaster (CAFS) er de mest fremtrædende celletype i tumorstroma af mange cancere, især brystcancer, og deres fremtrædende tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig prognose 1,2. CAFS er en aktiveret subpopulation af stromale fibroblaster, hvoraf mange udtrykker myofibroblast markør α-SMA 3. CAFS stammer fra lokale væv fibroblaster såvel som fra knoglemarv-afledte celler rekrutteres til det udviklende tumor og vedtage en CAF fænotype under indflydelse af den tumormikromiljøet 4. CAFS blev vist at lette tumorinitiering, vækst og progression gennem signalering som fremmer tumorcelledeling, angiogenese og invasion 5-8. Vi viste, at CAFS forbedre tumorvækst ved at formidle tumor-fremmende inflammation, der starter tidligst præneoplastiske trin 9. Trods stigende tegn på den vigtige rolle, CAFS spille ved at lette tumor vækst,studere CAFS har været en løbende udfordring på grund af manglen på CAF-specifikke markører og det store forskellighed disse celler, med mange undertyper sameksisterende i tumormikromiljøet 10. Endvidere undersøger fibroblaster in vitro hindres af, at deres genekspression nu ofte ændres i vævskultur 11,12. For at løse dette problem og muliggøre uvildig genekspression profilering af fibroblaster fra frisk mus og humane væv, vi udviklet en metode baseret på tidligere protokoller for Fluorescence cellesortering (FACS) 13,14. Vores fremgangsmåde er baseret på anvendelse af PDGFRα som overflademarkør at isolere fibroblaster fra frisk muse-og humant væv. PDGFRα er rigeligt udtrykt ved både normale fibroblaster og CAFS 9,15. Denne fremgangsmåde tillader isolering af rene populationer af normale fibroblaster og cafeer, herunder, men ikke begrænset til α-SMA + aktiverede myofibroblaster. Isolerede fibroblaster kan derefteranvendes til karakterisering og sammenligning af udviklingen i genekspression, der opstår i CAFS under tumorigenese. Faktisk vi og andre rapporterede udtryk profilering af fibroblaster isoleret ved cellesortering 16. Denne protokol blev med succes udført for at isolere og profilere højt beriget populationer af fibroblaster fra hud, bryst, bugspytkirtel og lungevæv. Desuden er vores fremgangsmåde tillader også dyrkning af sorterede celler, for at udføre funktionelle forsøg og for at undgå forurening med tumorceller, hvilket ofte er en stor hindring, når de forsøger at dyrke CAFS.
Protocol
1. Dissekering Mammary eller hudvæv fra mus
- Før dissekere det ønskede væv fra mus, forberede følgende leverancer og reagenser:
Tilbehør:
- Kirurgiske værktøjer (vasket med detergent og derefter dyppet i 70% ethanol).
- Styrofoam underlag til at placere musen på under dissektion.
- Stifter eller nåle til at holde musene under dissektion.
- Glaskrukke med låg for fordøjelsen, som indeholder magnetisk omrørerstav (autoklaveret).
- Vandbad ved 37 ° C indeholdende en nedsænkelig magnetisk omrører og tilstrækkeligt vand til nedsænkning af fordøjelsen jar, medens hvilende på omrørerplade.
Reagenser:
- FACS buffer I: (4 ° C): Dulbeccos phosphatbufrede saltvand CMF (Calcium Magnesium Free) + 0,5% BSA
- Collagenase opløsning (lavet umiddelbart før brug):
0,05 g Collagenase II
0,05 g Collagenase IV
0,01 g deoxyribonuclease
20ml FACS buffer I. Hold collagenaseopløsning på is indtil brug. - PharmLyse (ammoniumchlorid Lysing reagens).
- FACS buffer II: Dulbeccos phosphatbufrede saltvand CMF + 1% FCS.
- Dissektion af mælkekirtlerne (se også 17).
- Aflive hunmus ved hjælp af kuldioxid (CO 2) indånding.
- På en Styrofoam overflade, skal du placere musen på ryggen og pin fast alle fire lemmer med 25 gauge nåle (figur 1A). Sprøjte mus generøst med 70% ethanol.
- Brug en pincet, træk op bughuden ved midterlinjen og lave et lille snit med en skarp saks.
- Begyndende fra indsnittet, skære huden op til halsen af dyret, uden at punktere de abdominale og thorakale hulrum.
- Skære huden på bagbenene fra midtliniesnit mod benet, hvilket resulterer i en "Y-form".
- Træk hud væk fra musen, og pin ned, udsættermælkekirtlerne fastgjort til undersiden af huden (figur 1 B).
- Anvende Q-tips til forsigtigt at adskille mælkekirtler fra huden, mens der skæres bindevaev med små skarp saks for at adskille mælkekirtlen mod ryggen af musen.
- De abdominale kirtler (# 4, 5) er bedst for denne protokol. Du kan også bruge den 2. mælkekirtlerne, men huske på, at disse kirtler anatomisk er placeret i umiddelbar nærhed af pectoralis muskel, som kan være svære at adskille, hvilket resulterer i celler af blandet væv oprindelse.
- Bemærk: Ved dissekering tumorvæv, anbefales det at fjerne nekrotiske regioner.
- Dissektion af hudvæv: Den nemmeste måde at få hudvæv, uden at skulle beskæftige sig med hårfjerning er at bruge musen ører. Hvis en større mængde væv er nødvendig, kan du barbere hår fra muse torso og dissekere huden.
- Aflive mus ved anvendelse af CO2 inhalation.
- Ved hjælp af skarpe saks, afbrød begge ører og sted straks i fordøjelsen krukke indeholdende en lille mængde (~ 0,5 ml) PBS på is.
2. Fremstilling af mælkekirtlen / hud enkelt cellesuspension
- Anbring brystkirtler / huden i fordøjelsen beholder indeholdende en lille mængde PBS på is. Hvis vævet er blodig vask x2 med PBS, og derefter kassere overskydende PBS.
- Hakkekød grundigt med krum saks.
- Tilføj 20 ml collagenase opløsning (Bemærk: denne mængde af collagenase løsning vil effektivt dissociere cirka 5 g mamma eller tumorvæv og ører fra op til 15 mus).
- Umiddelbart på omrøres plade i 37 ° C vandbad, og der inkuberes i 15 minutter under omrøring ved medium hastighed.
Bemærk: optimale inkubationstider kan variere, hvis fordøje andre væv.
- For at standse reaktionen, der tilsættes 30 ml kold DMEM + 10% FCS.
- Strai vævet / media blanding gennem en 70 um si celle anbragt oven på et 50 ml konisk rør.
- Centrifuger konisk rør i 5 minutter ved 450 x g ved 4 ° C.
3. Røde blodlegemer Lysis
Bemærk: Dette trin er ikke nødvendigt, hvis musene var hjerte-perfunderet med PBS, før de blev aflivet.
- Aspirer supernatanten under anvendelse af en glaspipette tilknyttet vacuum, uden at forstyrre cellepelleten.
- At lysere RBC, resuspender cellepellet i 10 ml PharmLyse opløsning og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Neutralisere PharmLyse opløsning ved tilsætning af omkring 40 ml FACS buffer I.
- Spin den konisk rør med celler i 5 minutter ved 450 x g ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten.
4. Blokering af Endogen Fc
- Valgfrit: tælle celler for at bestemme det passende volumen for de følgende trin.
- Resuspender cellerne i1-3 ml FACS buffer I (afhængig af celle nummer, og mængden af antistof, du vil bruge).
- Tilføj FcBlock (anti-muse CD16/CD32) at nå 1:50 fortynding (10 ug / ml), og der inkuberes på is i 10-20 '.
Ingen grund til at vaske FcBlock.
5. Farvning
- Tag 100 ul portioner til eppendorfrør, der skal anvendes som en ikke-farvet kontrol og én farve kontroller (i forhold til antallet af fluorescerende anvendte antistoffer).
- At mærke fibroblaster: tilføj anti-PDGFRα (direkte konjugeret til fluorofor) i en fortynding på 1:50 (10 ug / ml).
- At mærke andre cellepopulationer (fx immune celler, makrofager, endotelceller etc.): tilføj passende fluorescerende konjugerede antistoffer mod overflademarkører, at en 1:50 fortynding.
Note: Selv om PDGFRα er en robust markør for fibroblaster, anbefales det at indbefatte antistoffer for immunceller og for epitelceller i wordsis til at udelukke eventuelle dobbelte positive befolkninger og dermed forøge renheden af isolerede fibroblaster.
- Der tilsættes 2 pi af hvert antistof til hver af de enkelte farvekontrol eppendorfrør.
- Inkuber celler med antistoffer i 1 time på is i mørke.
- At vaske: fylde rør med FACS-buffer I og spinde i 5 min ved 450 xg ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten, resuspender celler i FACS-buffer I til en koncentration på cirka 2 x 10 6 celler / ml, eller en hvilken koncentration mest passende for sortering med tilgængelige FACS sorter.
Valgfrit: Celler kan resuspenderet i FACS-puffer II, så længe sortering. Dette kan forbedre cellelevedygtighed. Imidlertid kan udsættelse for faktorer i serum påvirke genekspression, som skal testes, og tages i betragtning.
- Overfør mærkede celler i FACS rør med filter top: filterceller ind i rørene for at forhindre celleklumper.
- At udelukke døde cellers, add 7AAD (0,5 mg / ml) eller propidiumiodid (PI) til prøver (bortset fra den un-farvede kontrol).
Bemærk: For at undgå at spilde celler, kan du tilføje 7AAD/PI til den un-farvede prøve efter optagelse i FACS, og bruge igen som 7AAD kun kontrol.
- Hold prøver på is, mens analyse.
6. Isolering af celler ved FACS
(Bemærk: denne del af protokollen kræver forkundskaber i at drive en FACS sorteringsanlæg, fx BD FACS AriaII, eller bistand fra en faglært tekniker).
- Ved hjælp af FACS sorter-software (BD FACSDiva), passende analyse plots forberede at analysere forward scatter (FSC), sidespredning (SSC), 7AAD, FITC, PE og enhver anden fluorofor anvendes til mærkning af celler (figur 2).
- Før du ilægger hver prøve til cellesorteringsapparat, kortvarigt vortex for at resuspendere celler.
- Start med at analysere ufarvede prøve i ellerder for at indstille gating for den totale cellepopulation, til at udelukke cellerester, og at bestemme autofluorescens eller baggrundsfarvning.
- Analysere ufarvet prøve + 7AAD at bestemme og gate populationen af levende celler fra den totale cellepopulation.
- Analysere hver enkelt farve kontrol til at bestemme og kalibrere parametre som kompensation.
- Analysere den farvede prøve at definere positionen af portene til sortering.
- Når parametre og porte for de ønskede cellepopulationer er blevet indstillet, begynder sortering de mærkede cellepopulationer i eppendorfrør og 15 ml koniske rør indeholdende dyrkningsmedium eller RNA lysepuffer (såsom RLT-puffer eller Trizol).
Bemærk: Hvis sortering et stort antal celler, kan det ikke anbefales at sortere direkte til RNA lysisbuffer, idet det store volumen af kappevæske ledsager cellerne vil fortynde lyseringsbuffer og reducere udbyttet.
- Spin celler ned immediately efter sortering er færdig, og overførsel til frisk medium eller RNA lysebuffer, afhængigt af formålet med dit eksperiment.
- Hvis sortering med henblik på at kultur isolerede celler, udføre steril slags. Til bedre bevarelse af celler, anvendes phenolrødt-frit DMEM + 5% FCS i stedet for FACS-puffer II og indsamle celler i dyrkningsmedium med 20% FCS.
- Hvis dyrkning sorteres fibroblaster, alwaysplate på collagen-coatede plader og aldrig direkte på plast da dette resulterer i aktivering af fibroblaster, der fører til ændringer i deres genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp PDGFRα som markør for fibroblaster resulterer i isolering af højt beriget populationer af væv fibroblaster. Det niveau af renhed efter sortering var 99%, som kvantificeret ved post-sort analyse (figur 2A). Skønne det procentiske kontaminerende ikke-fibroblastceller ved den relative ekspression af celle-specifikke kontrol-gener (figur 2B) viser typisk 0,1-0,6% kontaminering. Dette niveau af renhed tillader høj kvalitet transkriptom profilering af isolerede fibroblaster 9.
I mælkekirtlerne, varierer andelen af fibroblaster i vævet mellem 5-20% i normalt brystvæv, og 1-5% i MMTV-PyMT tumorer. Den relative procentdel af fibroblaster i tumorvæv er lavere end i præ-neoplastisk væv, på trods af stigningen i det samlede antal fibroblaster, på grund af den massive udvidelse af epitel rum. Den reducerede% af fibroblaster isoleret fra tumorvævet er også et resultat afDen tilføjede tekniske vanskeligheder og forringet cellesortering fra en meget nekrotisk væv.
Isolerede fibroblaster kan dyrkes umiddelbart efter sortering, men kan kræve nogle dage at komme sig (figur 2D). Det er vigtigt at udføre alle yderligere eksperimenter med lave passage-celler, som primære fibroblaster undergår ældning under udbredelsen i kultur.
Figur 1. Oprensning af fibroblaster fra friske mælkekirtler. A-FVB / n / PyMT mus. B-Exposed mælkekirtler. C-Friske brystkirtler blev dissekeret fra FVB / n / PyMT mus og fordøjet med collagenase til en enkelt cellesuspension. Celler blev immun-mærket med antistoffer til fibroblast overflademarkør (PDGFRα) og macrophages overflademarkør (F4/80) efterfulgt af separering ved FACS. Sorteret fibroblaster blev enten dyrket eller lyseres for RNA oprensning. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Profilering af sorteret fibroblaster. A-Enkeltcellesuspensioner af muse brystkirtler blev farvet med PDGFRαand F4/80 antistoffer. FACS-sortering plot er vist (venstre panel). P2 er den fibroblaster gate (PDGFRα +-celler) og P4 er makrofager gate (F4/80 +-celler). En efter sortering blev udført for at bestemme renheden af sorteret fibroblaster og makrofager (midterste og højre panel). B-Analyse af sortering renhed ved qRT-PCR af cellespecifikke kontrol gener for fibroblast (PDGFRα, Col-1α), immunceller (CD45, CSF-1R) og epitelceller (E-cadherin). Resultaterne blev normaliseret til to Parlamentet holde gener (GAPDH og MGUS). Relativ udtryk for GAPDH er vist. C-Kvantificering af PDGFRα udtryk i alt usorteret population af mammae fibroblaster. D-Tissue kultur sorteret fibroblaster. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medens eksperimenter udført i vævskultur kan være informative og antyder funktionelle principper, der kan verificeres in vivo, er det kendt, at store ændringer i genekspression i celler i kultur 11,12. For at undgå en vævskultur trin ved profilering af genekspression i fibroblaster, har vi udviklet en protokol, der tillader isolering af normale, såvel som cancer-associerede fibroblaster fra friske mus eller humant væv. Denne protokol blev anvendt med succes med hud, pankreas og brystvæv fra mus og fra mennesker 9. Isolering af fibroblaster ved FACS-sortering kræver en overflademarkør, at etiketter fibroblaster. Vi konstateret, at PDGFRα er en robust overflademarkør, der muliggør isoleringen af højt beriget populationer af fibroblaster 9. Desuden er PDGFRα udtrykt på både normale væv fibroblaster og på cafeer, således at saglig isolation og profilering af væv fibroblaster snarere end fokng på en bestemt subpopulation.
Fibroblaster er en heterogen cellepopulation i forhold til ekspressionen af markørmolekyler samt deres oprindelse og signalanlæg egenskaber 8,10,18. Mens PDGFRα er en robust overflademarkør for fibroblaster, er det ikke mærke 100% af fibroblaster i alle væv resulterer i en umærket subpopulation af celler, afhængigt af vævstype. I huden, er cirka 90% af fibroblaster PDGFRα + (ikke vist) mens der i mælkekirtlerne omkring 85% af de samlede væv fibroblaster er PDGFRα + (figur 2C). Procentdelen af PDGFRα udtrykker fibroblaster kan variere i andre vævstyper, og skal defineres for hvert væv. Ikke desto mindre, i huden og i mælkekirtlerne, vil anvendelse af PDGFRα som en celleoverflademarkør resultere i stærkt berigede populationer af de fleste væv fibroblaster, hvilket tillader ekspression profilering eller dyrkning af sorterede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yitzchak Oschry og Dr. Orit Sagi-Asif for deres hjælp med FACS sortering. Denne forskning blev støttet af tilskud til NE fra Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. [276.890], fra Israel Cancer Association (# 20.110.078), og fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
