Summary
Kreft assosiert Fibroblaster (kafeer) legge til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer spredning, angiogenese, og betennelser. Her beskriver vi en metode for å isolere rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer fra frisk mus og menneskelig vev ved celle sortering, ved hjelp PDGFRα som en overflate markør.
Abstract
Kreft-tilknyttede fibroblaster (kafeer) er de mest fremtredende celletype i tumor stroma av mange kreftformer, særlig brystkreft, og deres fremtredende tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig prognose 1,2. Er cafs en aktivert subpopulasjon stromale fibroblaster, hvorav mange uttrykker myofibroblast markør α-SMA 3. Kafeer stammer fra lokale vev fibroblaster samt fra benmargen-avledet celler rekruttert til å utvikle svulst og vedta en CAF fenotype under påvirkning av svulsten mikromiljøet 4. Kafeer ble vist til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer tumor celleproliferasjon, angiogenese, og invasjonen 5-8. Vi viste at kafeer forbedre tumorvekst ved å formidle tumor-fremme betennelse, starter tidligst pre-neoplastiske stadier 9. Til tross for økende bevis av de viktigste rollen kafeer spille i å tilrettelegge tumorvekst,studerer cafs har vært en pågående utfordringen grunnet mangel på CAF-spesifikke markører og de aller heterogenitet av disse cellene, med mange subtyper sameksisterende i tumor mikromiljøet 10. Videre studerer fibroblaster in vitro hindret av det faktum at deres genuttrykk profilen er ofte endret i vevskultur 11,12. Å løse dette problemet og for å tillate objektiv gene expression profilering av fibroblaster fra fersk mus og menneskelig vev, har vi utviklet en metode basert på tidligere protokoller for Fluorescence-Activated Cell Sortering (FACS) 13,14. Vår tilnærming er avhengig av å benytte PDGFRα som en overflate markør for å isolere fibroblaster fra frisk mus og menneskelig vev. PDGFRα er rikelig uttrykt av både normale fibroblaster og kafeer 9,15. Denne metoden gjør det mulig isolering av rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer, inkludert, men ikke begrenset til α-SMA + aktivert myofibroblasts. Isolerte fibroblaster kan deretter værebrukt til karakterisering og sammenligning av utviklingen av genuttrykk som oppstår i kafeer under tumorigenesis. Faktisk rapporterte vi og andre uttrykk profilering av fibroblaster isolert av celle sortering 16. Denne protokollen ble vellykket utført for å isolere og profilere høyanriket bestander av fibroblaster fra huden, mammary, bukspyttkjertel og lunge vev. Videre tillater vår metode også dyrking av sortert celler, for å utføre funksjonelle forsøk og for å unngå forurensning av tumorceller, som ofte er en stor hindring ved forsøk til kultur cafs.
Protocol
1. Dissecting Mammary eller hud vev fra mus
- Før dissekere ønsket vev fra mus, forberede følgende forsyninger og reagenser:
Rekvisita:
- Kirurgi verktøy (vasket med oppvaskmiddel og deretter dyppet i 70% etanol).
- Styrofoam overflate du kan hvile musen på under disseksjon.
- Pinner eller nåler for å holde mus under disseksjon.
- Glasskrukke med lokk for fordøyelsen, inneholder magnetiske rørestav (autoklaverte).
- Vannbad ved 37 ° C, som inneholder en nedsenkbar magnetrører og nok vann til å senke fordøyelsen jar, mens den hviler på oppstuss plate.
Reagenser:
- FACS buffer I: (4 ° C): Dulbeccos fosfatbufret saltvann CMF (Kalsium Magnesium Free) + 0,5% BSA
- Collagenase løsning (laget umiddelbart før bruk):
0,05 g kollagenase II
0,05 g kollagenase IV
0.01 g Deoxyribonuclease
20ml FACS buffer I. Hold collagenase løsning på is inntil bruk. - PharmLyse (salmiakk Lysing Reagent).
- FACS buffer II: Dulbeccos fosfatbufret saltvann CMF + 1% FCS.
- Disseksjon av brystkjertlene (se også 17).
- Avlive hunnmus ved hjelp av karbondioksid (CO 2) innånding.
- På en Styrofoam overflate, plassere musen på ryggen og pin fast alle fire lemmer med 25 gauge nåler (figur 1A). Spray musen sjenerøst med 70% etanol.
- Ved hjelp av pinsett, dra opp abdominal huden på midtlinjen og gjør et lite snitt med skarp saks.
- Starter fra snittet, skåret til skinnet opp til halsen på dyret samtidig unngå punktering abdominal eller thorax hulrom.
- Kutt huden på bakbena fra midtlinjen snitt mot benet, noe som resulterer i en "Y form".
- Trekk huden vekk fra mus kropp og pin ned, utsettemelkekjertlene festet til undersiden av huden (figur 1B).
- Bruk Q-tips til å forsiktig skille brystkjertlene fra huden mens kutte konjunktiv vev med små skarp saks for å skille melkekjertlene mot ryggraden av musen.
- Abdominal kjertler (# 4, 5) er best for denne protokollen. Du kan også bruke 2. melkekjertlene, men husk at disse kjertlene er anatomisk ligger i umiddelbar nærhet til pectoralis muskelen som kan være vanskelig å skille, noe som resulterer i cellene av blandet vev opprinnelse.
- Merk: Når dissekere svulstvev, anbefales det å fjerne nekrotiske områder.
- Disseksjon av huden vev: Den enkleste måten å få huden vev, uten å måtte forholde seg til hårfjerning er å bruke mus ører. Hvis en større mengde vev er nødvendig, kan du barbere bort håret fra mus torso og dissekere huden.
- Avlive mus bruker CO 2 inhalation.
- Bruke skarp saks, avskåret begge ørene og sted umiddelbart i fordøyelsen krukke inneholdende et lite volum (~ 0,5 ml) av PBS på isen.
2. Utarbeidelse av melkekjertlene / hud Single Cell Suspension
- Plasser brystkjertlene / hud i fordøyelsen krukke inneholdende et lite volum av PBS på isen. Hvis vevet er blodig vask x2 med PBS, og kast overflødig PBS.
- Finhakk grundig med buet saks.
- Tilsett 20 ml collagenase løsning (Merk: Denne mengden kollagenase løsning vil effektivt dissosiere ca 5 g mammary eller tumorvev og ører fra opptil 15 mus).
- Plasser umiddelbart på røre plate i 37 ° C vannbad, og inkuber i 15 min under omrøring ved middels hastighet.
Merk: optimale inkubasjonstider kan variere hvis bearbeider andre vev.
- For å stoppe reaksjonen, tilsett 30 ml kald DMEM + 10% FCS.
- Strai vevet / media blandingen gjennom en 70 um celle silen plasseres på toppen av en 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger koniske røret i 5 min ved 450 xg ved 4 ° C.
3. Red Blood Cells Lysis
Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig hvis mus var hjerte-perfused med PBS før de ble ofret.
- Aspirer supernatanten ved hjelp av en glass pipette tilknyttet vakuum, uten å forstyrre cellepellet.
- Å lysere RBC, resuspender cellepellet i 10 ml PharmLyse løsning og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Nøytralisere PharmLyse løsningen ved å tilsette omtrent 40 ml FACS buffer I.
- Spinn konisk tube med celler i 5 min ved 450 xg ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten.
4. Blokkering av Endogen Fc
- Valgfritt: telle celler for å avgjøre nødvendig volum for de neste trinnene.
- Resuspender celler i1-3 ml FACS buffer I (avhengig celle nummer, og mengden av antistoff du vil bruke).
- Legg FcBlock (anti-mus CD16/CD32) for å nå 1:50 fortynning (10 ug / ml) og inkuber på is i 10-20 '.
Du trenger ikke å vaske av FcBlock.
5. Flekker
- Ta ut 100 ul alikvoter til Eppendorf-rør som skal brukes som en un-farget kontroll og ensfargede kontroller (i henhold til antall av fluorescerende antistoffer brukes).
- Å merke fibroblaster: legge til anti-PDGFRα (direkte konjugert til fluorofor) til en fortynning på 1:50 (10 ug / ml).
- Å merke andre cellepopulasjoner (f.eks immunceller, makrofager, endotelceller osv.): legge til passende fluorescently konjugerte antistoffer mot overflate markører, til en 1:50 fortynning.
Merk: selv PDGFRα er en robust markør for fibroblaster, anbefales det å inkludere antistoffer for immunceller og for epitelceller i ordeh å utelukke noen doble positive populasjoner og dermed øke renheten av isolerte fibroblaster.
- Tilsett 2 ul av hver antistoff til hver av de enkelte fargekontrollalternativer Eppendorf rør.
- Inkuber celler med antistoffer i 1 time på is i mørket.
- Å vaske: Fyll rørene med FACS buffer jeg og spinne i 5 min ved 450 xg ved 4 ° C.
- Aspirer supernatant Resuspender celler i FACS buffer I til en konsentrasjon på ca 2 x 10 6 celler / ml, eller den konsentrasjon mest hensiktsmessig for sortering med tilgjengelige FACS sorter.
Valgfritt: Celler kan bli resuspendert i FACS-buffer II for varigheten av sortering. Dette kan forbedre cellelevedyktighet. Imidlertid kan eksponering for faktorer i serum ha en effekt genekspresjon, som bør bli testet, og tatt hensyn til.
- Overfør merkede celler i FACS rør med filter topp: filtrere celler i rørene for å hindre celle klumper.
- Å utelukke død celles, add 7AAD (0,5 mikrogram / ml) eller propidium jodid (PI) til prøver (med unntak av un-farget kontroll).
Merk: For å unngå å sløse celler, kan du legge 7AAD/PI til FN-farget prøve etter opptak i FACS, og bruke igjen som 7AAD bare kontroll.
- Hold prøver på isen mens analysere.
6. Isolering av celler ved FACS
(Merk: denne delen av protokollen krever forkunnskaper i drift en FACS sorter, f.eks BD FACS AriaII, eller ved hjelp av en dyktig tekniker).
- Bruke FACS sorter programvare (BD FACSDiva), forberede aktuelle analyser tomter å analysere frem scatter (FSC), side scatter (SSC), 7AAD, FITC, PE og andre fluoroforen brukes til å merke celler (figur 2).
- Før mating av hvert prøve til cellen sorter, vortex kort å resuspendere cellene.
- Start med å analysere unstained prøven i ellerder for å sette gating for hele cellepopulasjon, for å separere ut celleavfall, og å bestemme autofluorescens eller bakgrunnsfarging.
- Analyser unstained prøver + 7AAD å bestemme og gate befolkningen av levende celler fra total cellepopulasjon.
- Analysere hver enkelt farge kontroll for å bestemme og kalibrere parametere som kompensasjon.
- Analyser farget prøven å definere posisjonen av porter for sortering.
- Gang parametere og porter for ønskede cellepopulasjoner er satt, begynner sortering de merkede cellepopulasjoner inn Eppendorf rør eller 15 ml koniske rør inneholdende dyrkningsmediet eller RNA lyseringsbuffer (eksempel RLT buffer eller Trizol).
Merk: Hvis sortering et stort antall celler, er det ikke anbefalt å sortere direkte til RNA lyseringsbuffer, som det store volumet av skjede fluidum medfølgende cellene vil fortynne lyseringsbuffer og redusere utbyttet.
- Spin celler ned immediately etter sortering er ferdig, og overføring til frisk medium eller RNA lyseringsbuffer, avhengig av formålet med eksperimentet.
- Hvis sortering for å kultur isolerte celler, utføre steril sorter. For bedre utvinning av celler, bruke fenolrødt gratis DMEM + 5% FCS istedenfor FACS buffer II og samle celler i kultur medium med 20% FCS.
- Hvis dyrkning sorteres fibroblaster, alwaysplate på kollagenindusert belagte plater og aldri direkte på plast som dette resulterer i aktivering av fibroblaster som fører til endringer i deres genekspresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke PDGFRα som en markør for fibroblaster resulterer i isolasjon av høyanriket bestander av vev fibroblaster. Nivået av renhet etter sortering var 99%, som kvantifisert ved post-sorter analysen (figur 2A). Beregning av prosenten av kontaminerende ikke-fibroblastceller av den relative ekspresjon av celle-spesifikke kontroll gener (figur 2B) viser vanligvis 0,1 til 0,6% forurensning. Dette nivået av renhet gir høy kvalitet transkriptom profilering av isolerte fibroblaster 9.
I melkekjertler, varierer andelen av fibroblaster i vevet mellom 5-20% i normal mammary vev, og 1-5% i MMTV-PyMT tumorer. Den relative andel av fibroblaster i svulstvev er lavere enn i pre-neoplastisk vev, til tross for økning i totalt antall av fibroblaster, grunn av den massive utvidelse av epiteliale kupé. Den reduserte% av fibroblaster isolert fra tumorvev er også et resultat avlagt tekniske problemer og redusert effektivitet av celle sortering fra en svært nekrotisk vev.
Isolerte fibroblaster kan dyrkes rett etter sortering, men kan kreve noen dager for å gjenopprette (figur 2D). Det er viktig å utføre alle videre forsøk med lave passasje celler, som primære fibroblaster gjennomgå senescence under forplantning i kultur.
Figur 1. Rensing av fibroblaster fra ferske melkekjertler. A-FVB / n / PyMT mus. B-Exposed melkekjertler. C-Fresh melkekjertler ble dissekert fra FVB / n / PyMT mus og fordøyd med collagenase til en enkelt celle suspensjon. Celler ble immun-merket med antistoffer for fibroblast overflate markør (PDGFRα) og macrophages overflaten markør (F4/80) etterfulgt av separering av FACS. Drevet fibroblaster ble enten kultivert eller lysert for RNA rensing. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Profilering av sortert fibroblaster. A-encellete suspensjoner av mus brystkjertlene ble farget med PDGFRαand F4/80 antistoffer. FACS sortering tomten vises (venstre panel). P2 er fibroblaster gate (PDGFRα + celler) og P4 er makrofager gate (F4/80 + celler). Et innlegg slags analyse ble utført for å bestemme renheten av sortert fibroblaster og makrofager (midten og til høyre paneler). B-Analyse av sortering renhet ved QRT-PCR av celle-spesifikke kontroll gener for fibroblast (PDGFRα, Col-1α), immunceller (CD45, CSF-1R) og epitelceller (E-cadherin). Resultatene ble normalisert til to hus å holde gener (GAPDH og MGUS). Relativ uttrykk for GAPDH vises. C-Kvantifisering av PDGFRα uttrykk totalt usortert befolkning av mammary fibroblaster. D-Tissue kultur sortert fibroblaster. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens eksperimenter utført i vevskultur kan være informative og foreslå funksjonelle prinsipper som kan verifiseres i vivo, er det kjent at store endringer i genekspresjonen av celler i kultur 11,12. For å unngå en vev kultur skritt når profilering av genuttrykk i fibroblaster, utviklet vi en protokoll som gjør det mulig isolering av normale, samt kreft-tilknyttede fibroblaster fra fersk mus eller menneskelig vev. Denne protokollen ble vellykket anvendt med hud, bukspyttkjertel og bryst vev fra mus og fra menneske 9. Isolering av fibroblaster ved FACS sortering krever en overflate markør som etiketter fibroblaster. Vi fastslått at PDGFRα er en robust overflate markør som muliggjør isolering av høyanriket bestander av fibroblaster 9. Videre er PDGFRα uttrykt på både normale vev fibroblaster og på kafeer, og dermed gir saklig isolasjon og profilering av vev fibroblaster stedet focusing på en bestemt undergruppe.
Fibroblaster er en heterogen cellepopulasjon i forhold til ekspresjonen av markør molekyler så vel som i sin opprinnelse og signalering egenskaper 8,10,18. Mens PDGFRα er en robust overflate markør for fibroblaster, betyr det ikke merke 100% av fibroblaster i alle vev resulterer i en umerket subpopulasjon av celler, avhengig av vevstype. I huden, ca 90% av fibroblaster er PDGFRα + (ikke vist), mens i brystkjertlene ca 85% av totale vev fibroblaster er PDGFRα + (Figur 2C). Prosentandelen av PDGFRα uttrykkende fibroblaster kan variere i andre vevstyper, og må defineres for hvert vev. Likevel, i huden og i melkekjertler, vil benytte PDGFRα som celleoverflate markør føre høyanriket populasjoner av flertallet av vev fibroblaster, slik uttrykk profilering eller dyrkning av sortert celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yitzchak Oschry og Dr. Orit Sagi-Asif for deres hjelp med FACS sortering. Denne forskningen ble støttet med tilskudd til NE fra EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° [276890], fra Israel Cancer Association (# 20110078), og fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
