Summary
우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.
Abstract
발달 순서를 통해 세포 행동의 생체 역학의 이미징은 조직 패턴의 메커니즘을 이해하기위한 강력한 기술이 될 수 있습니다. 동물의 개발 과정, 주요 세포 증식 및 패터닝 이벤트는 매우 빠르게 발생합니다. 예를 들어, Caenorhabditis의 elegans에서 애벌레의 몸 계획에 필요한 모든 세포 분열은 7 mitotic주기 1, 수정을 한 후 6 시간 이내에 완료되며, Drosophila의 embryogenesis의 16 살 이상 mitoses 미만이 24 시간 2에 발생합니다. 반면, 공장 개발하는 동안 세포 분열은 일반적으로 하루 3,4,5의 순서에 속도가 느린 있습니다. 이 독특한 도전과 세포 분열 및 식물 organogenesis 동안 차별화 이벤트의 동적 동작을 문서화 장기 라이브 영상에 대한 필요성을 부과. Arabidopsis 표피는 조사 신호, 세포의 운명, 그리고 식물의 개발을위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 떡잎에서이 조직이 구성되어 공기와 균일하게 분포 stomata 사이 사이 방수 포장 세포, 밸브을 열고 가스 교환 및 물 손실을 제어 할 가깝습니다. 이 stomata의 적절한 간격은 기능에 중요합니다, 그들의 개발은 비대칭 부서 및 조직 표피 (그림 1) 생산하는 세포 분화 단계의 순서를 따릅니다.
이 프로토콜은 개발 며칠 동안 세포와 표피의 단백질의 관찰을 할 수 있습니다. 이 시간 프레임은 줄기 세포 부서 및 stomata와 표피 포장 세포 등의 표피 세포의 분화의 정확한 문서를 수 있습니다. 형광 단백질은 세포 분열과 분화 과정 중에 역학을 평가하기 위해 관심 단백질에 융합 할 수 있습니다. 이 기술은 일에 stomatal - 계보 (Lineage) 세포의 확산 단계에서, 우리는 소설 단백질, 극지 6 현지화를 이해 할 수 있습니다이 비대칭 분열 이벤트 및 부서가 발생 직전 세포 피질의 특성 영역에 움직임을 이전 셀에 표시됩니다 전자 Arabidopsis의 떡잎의 표피. 이미지 등록 및 능률적 인 동영상은 쉽게 시간이 지남에 따라 변경으로 동적 단백질 지역화와 세포 유형을 시각화하는 공개 도메인 소프트웨어를 사용하여 생성 할 수 있습니다.
Protocol
1. 종자 살균
- 33 % 가정용 표백제, 0.1 % 트리톤 X-100 : 종자 살균 솔루션을 준비합니다.
- 원하는 형광 기자 구조 (들)과 유전자형 (들) 1.7 ML 튜브 및 살균 솔루션 1 ML을 적용 들고 장소 종자. 15 분에 nutator에 품다.
- 멸균 후드에 뒤에 종자를두고, 튜브에서 살균 솔루션을 제거 할 pipettor를 사용합니다. 한 ML 멸균 물을 씻어. 네 번 반복합니다.
- 이일 이상 4 ° C에서 알을 품다.
2. 상공 회의소 슬라이드 미디어 준비
- 용해 될 때까지 Bacto의 200 ML 플라스크의 물에 한천 (순수하지 아가로 오스), 그리고 전자 레인지의 0.5 % 솔루션의 20 ML을 섞는다. 솔루션을 끓고 할 때는 신중을 기해야합니다.
- 약 60 ° C.에 솔루션을 냉각
- pipettor과 한천 솔루션 1 ML를 수집하고 천천히 챔버 슬라이드 (랩 - 테크 II 쏠 수 # 1.5 독일어 Coverglass 시스템) 내부의 커버 유리에 적용됩니다. 솔루션 which이 너무 뜨겁거나 접착제 또는 균열 유리가 다 녹을 수 있습니다 너무 빨리 적용됩니다.
- 즉시 한천 솔루션의 두 번째 ML를 추가합니다. 한천 미디어는 이제 완전히 슬라이드 챔버의 바닥을 커버해야합니다. 이 최소한의 미디어 수분을 유지하고 가스 확산을 허용 × 4 5 일짜리 저장 영양소를 포함 식물 자엽에서 개발을 지원하기에 충분한 것입니다.
- 챔버가있는 benchtop에 차가운 슬라이드 커버. 술병이 단단히 덮여있다 경우, 솔루션은 저장 및 나중에 사용하기 위해 재가열 될 수 있습니다.
3. 시드 해부
- 4 ° C 저장소에서 무균 종자의 튜브를 제거합니다.
- 해부 현미경의 무대에 종이 조직을 놓고 물을 축축하게하다. 부드러운 표면을 생성 할 조직을 조정합니다. 조직은 해부에 대한 씨앗을 안정하는 데 사용됩니다.
- 관에서 조직 Pipet 20-30 종자를 뷰의 해부 범위의 필드에 넣어주의 것.
- 날카로운 집게 (Roboz, # 5 생물 팁을)를 사용신중하게 묘목 내부에서 씨앗 코트를 제거합니다. 바깥 쪽과 안쪽 모두 integuments를 제거해야합니다.
- 때 이미지 떡잎, 그것은 hypocotyl와 잔뿌리를 제거하는 유용합니다. Cotyledons은이 프로토콜에 따라 며칠 동안 개발하기에 충분한 영양소가 포함되어 있습니다. 그대로하면 hypocotyl은보기의 시간 경과 필드의 떡잎을 이동 크게 바르게하고 길어합니다. hypocotyl 무료로 cotyledons 썰 메스를 사용합니다.
- microtube 또는 이와 유사한에, 물에 익숙해 해부 cotyledons을 잡아.
- cotyledons의 원하는 수에 도달 할 때까지 3.4-3.6를 반복합니다. 15-20 성공적으로 dissections는 설치하기 전에 권장합니다.
4. 상공 회의소 슬라이드에 장착 Cotyledons
- 작은 (18mm 2) 커버 슬립, 한천 매체를 통해 잘라 챔버 슬라이드의 유리베이스에서 전체 층을 엘리베이터를 사용합니다.
- Pipet이 버티고에서 물을 최소로 cotyledons를 해부해제 한천 층 아래에있는 챔버 슬라이드, 튜브에.
- 부드럽게 cotyledons에 한천을 낮 춥니 다. 초과 물이있는 경우, cotyledons을 방해하지 않도록주의하는 것 조직으로 거리에 즐겨보십시오. 마운트가 완료되면 표본은 더 이상 쉽게 이동할 없습니다.
- 챔버 슬라이드과 현미경 단계에 이동 슬라이드 커버를 놓습니다.
5. 시간 경과 영상
- 이미지가 원하는 형광 (들)에 역 공 촛점 현미경을 설정합니다. 사용 LSM700 매개 변수 : GFP, 440-530 nm의에서 필터 밴드 패스 488 나노 미터 및 수집에 여기에, RFP, 570-610 nm의에서 필터 밴드 패스 555 나노 미터 및 수집에 여기에.
- 손해에 대해 마운트 된 표본을 검사합니다. 그대로의 위치를 프로그램이 제대로는 현미경 소프트웨어에 cotyledons를 장착. 선 (禅) 2009 년 : 20x 목적이있는 떡잎에 초점와 챔버 슬라이드의 센터로 목표를 이동합니다. 취득 모드에서 0.5 줌을 변경하고 프레임 크기 <48x48 픽셀 / em>는. 위치에 따라 위치 확인란 및 스캔 개요 이미지 ... 버튼을 선택한 다음, 30-35로 수평 및 수직 타일 번호를 향상시킬 수 있습니다. 스캔이 완료되면 관찰하기 위해 각 떡잎의 특성 항목 탭 및 장소 십자선 아래에 위치 버튼을 클릭합니다.
- 모든 samples.In 선 (禅) 2009 년 자엽의 표피를 포함한 Z 시리즈를 설정합니다 : Z-스택 확인란을 클릭합니다. 위치 목록 아래의 각 위치를 선택하고 버튼 이동을 누릅니다. 떡잎의 표피의 맨면에 집중하고 Z-스택 아래의 설정 첫 번째 버튼을 클릭합니다. 표피가 유용하게 볼 수있는에서 가장 낮은 위치에 집중하고 세트 마지막 버튼을 클릭합니다. 설정하는 최선의 Z-슬라이스의 두께를 보여줍니다하는 최적의 옆에있는 버튼을 클릭합니다. 이러한 설정은 모든 샘플을 포괄 확인하기 위해 각 떡잎을 확인, Z 매개 변수가 개인에 대해 설정 될 수 없습니다선 (禅) 2009 년 idual 위치.
- 원하는 해상도와 길이의 시계열을 설정합니다. 3 일간 15-30 분 간격 표피 세포 분열의 단백질 역학에 효과적입니다. 이 간격은 필요에 따라 변경 될 수 있습니다. 선 (禅) 2009 년 : 시간 시리즈 확인란을 클릭합니다. 시간 시리즈에서 텍스트 필드에 슬라이더 또는 입력을 사용하여 원하는 이미지 번호를주기를 설정합니다. 30 일 간격을 설정하고 분을 선택 풀다운 메뉴를 사용합니다.
- xyzt 다중 위치 스캔을 시작합니다. 위치의 번호가 스캔 사양에 의해 제한해야합니다, 총 스캔 시간이 원하는 간격보다 클 경우, 시간 지점이 정확하지 않습니다. 이미지 GFP 및 RFP는 59에서 30 분 간격으로 Z-슬라이스가 시스템을 사용할 때 여섯 동시 입장의 최대 가능합니다. 선 (禅) 2009 년 : 변경 프레임 크기 원하는 해상도와 시작 실험을 클릭합니다.
6. 비디오 편집
- 공 촛점 데이터 파일에서 최대 강도 등 TIFF와 같은 무손실 형식의 이미지 파일을 각 시간 / 위치 조합과 수출의 Z-투영합니다. 파일 이름은 영화으로 결합하는 소프트웨어에 대한 위치 당 하나의 시리즈 (예를 들어, 극지-GFP_0001_pos1 등 극지-GFP_pos1_0001, 극지-GFP_pos1_0002되지 않음)에 있어야합니다. 선 (禅) 2009 년 : 사용 복사 : 후 별도의 파일로, 최대 강도 프로젝션으로 위치를 분할 할 수있는 처리 탭 아래 하위 집합입니다. (: - 시리즈 수출, 전체 해상도 이미지 창 파일) 마지막으로, TIFF로 내보낼 수 있습니다.
- bUnwarpJ 매크로 9 일 (: 등록 : bUnwarpJ 플러그인)를 실행하여 연속 이미지를 정렬 피지 7,8을 사용합니다. 모노로 등록 모드를 변경합니다. 모든 고급 옵션은 기본 값을 사용할 수 있습니다. 오랜 시간 경과 시퀀스를 들어, 다운로드 및 설치 매크로 "아핀 + 일관된 탄성 2D 이미지 등록"을 자동으로 일련의 이미지에 bUnwarpJ을 적용됩니다, 그리고 개방 Y파일을 사용하여 Google 데이터 : 가져 오기 : IT를 사용하는 이미지 시퀀스. 대걸레의 랜드 마크 추출 및 실행 선택 해제합니다.
- 정렬 이미지의 순서를 열고 원하는 비디오 포맷 (AVI 좋은 선택이 될 것입니다)에 저장 피지 / ImageJ 또는 QuickTime Pro를 사용합니다.
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Representative Results
이 방법으로 수집 된 정보를 시간 점의 집합은 그림 3에 표시됩니다. 셀 멤브레인은 RFP (PM-RB)와 GFP는 30 분 시간 척도에서 (극 :: 극지-GFP)을 기본 발기인에 따라 극 단백질에 6을 융합하고 있습니다으로 분류됩니다, 우리는 단백질 현지화의 변화와 함께 세포 분열을 참조하십시오 을 이전. 비대칭 셀 stomatal 계보 (Lineage) 형태의 부서 줄기 세포과 같은 추가 비대칭 분열을받을 수있는 능력을 보유 meristemoids, 그리고 그들의 누이 세포라는 stomatal 전구체, stomatal 계보 (Lineage) 지상 세포 (SLGCs)을했다. SLGCs는 stomatal 전구체 운명을 가정하지 않습니다, 그들은 자주 포장 세포에 transdifferentiate하지만, 잎이 확장 된 첫 번째에서 떨어져 간격을두고 다른 meristemoid를 생성하기 위해 비대칭 분할 기능을 재개 할 수 있습니다. 이 운명의 모든 극의 표현 및 현지화 :: 극지-GFP (그림 3, 비디오 1)에 반영됩니다.
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그림 1. stomatal 개발 도식. Protodermal 전지는 기본 나선형 루프 - 나선형 전사 인자 말문이 (SPCH), 비명 소리 (SCRM) 및 SCRM2에 의해 제어 단계에서 meristemoid 어머니 세포로 stomatal 혈통 (MMC)를 입력합니다. MMCs는 meristemoid (M)와 stomatal 계보 (Lineage) 지상 셀 (SLGC)를 생산하기 위해 비대칭 분열,이 단계는 여러 번 발생하고 이격하는 stomata하여 한 메커니즘을 제공 할 수 있습니다. 가드 어머니 셀 (GMC)에 meristemoid의 셀 상태 변화는 신원은 MUTE bHLH뿐만 아니라 SCRM / 2에 의해 구체적으로 지향된다. 이 성숙 경비 세포에 GMC와 차별화 (GC)의 최종 대칭 부문 SCRM / 2 10과 bHLH FaMA는 필요합니다.ig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 시드 분해 및 장착 절차의 다이어그램. 씨앗 4에 소독 및 실시 ° C는 씨앗 코트와 hypocotyls 제거하고, cotyledons은 거꾸로 공 촛점 현미경에 이미지에 대한 챔버 슬라이드에 한천 미디어에서 장착.
그림 3. 시간 경과 영상이 보여 극 :: 비대칭 세포 분열을 이전 극지-GFP 말초 현지화. 시리즈 A : 극지-GFP는 처음 약 이시간 asymme하기 전에 다음 균일하게 분포가 나타납니다극 - GFP의 segregates 거리에 초기 meristemoid의 사이트에서 tric 부문 (화살촉). 시리즈 B : 초기 비대칭 부문 (화살촉) 이어, 극지-GFP는 meristemoid에 의해 어머니 셀 (GMC) 상태를 보호하기 위해 신속한 전환을 암시, 두 세포에서 사라집니다. 자매 셀 아마 나중에 비대칭 분열을 presaging, 극-GFP 발현을 회복하면서 GMC (별표)는 대칭 분할 및 stomatal 보호 세포를 형성하는 차별화합니다.
동영상 1. 편리한 하나의 stomatal 전구체 세포의 증폭 및 간격 동안 극 :: 극 - GFP 현지화의 등록 동영상입니다. 처음 극지-GFP는 셀에 균일하게 나타납니다, 39 시간으로 발아 후이 강하게 polarizes, 그냥 분할하기 전에 (40.0h) 세포의 반대편 끝 부분에 작은 meristemoid을 배치. 오른쪽에있는 큰 세포는 stomatal 계보 (Lineage) 정체성을 회복하고, 45에서 시간 극 - GFP 현지화는 stomatal 전구체에 인접 이동. 47 시간의 부서는 처음부터 기존의 meristemoid (왼쪽)에서 도보로 지향하는 meristemoid을 (오른쪽) 생산하고 있습니다. 최종 결과는 한 셀을 사이에두고 두 개의 stomata입니다. (동영상에서 누락 된 이미지는 수집되지 않았습니다 및 중요한 변경 사항을 대표하지 않습니다.) 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 시간 경과 공 촛점 기술은 휘황 태그 단백질 표현과 극 및 기타 동적으로 변화하는 단백질의 경우 자신의 기능의 올바른 이해에 매우 중요합니다 Arabidopsis 떡잎의 표피의 개별 셀의 국산화의 길이 방향 연구를 할 수 있습니다. 이전 지속 시간 경과 영상은 Arabidopsis 루트 곰팡이 감염 11 분열 조직의 성장 5,12을 검사하는 데 사용하지만, 자엽의 표피를 추가하면이 기술의 기능성을 확장 및 추가 단백질의 사용을 허용, 특히 stomatal 개발의 확장 필드를 지원했습니다 .
프로토콜의 주요 한계는 현재는 초기 개발에 필요한 영양소를 포함 cotyledons에 제한되어 있다는 점이다. 또한, 떡잎 개발은 젤 매체는 가스 교환을 제한하기 때문에 공중에 공사 것과 정확히 동일하지 않습니다. 스캐닝 라경 노출 및 객실 등은 떡잎 확장 및 엽록체의 성숙을 유도, photomorphogenesis에 대한 적절한 있지만, stomata는 종종 낮은 CO 2 농도에 따라 인접 쌍으로 발전 할 수 있습니다. 이 경향이 프로토콜에 지시 한 매체의 얇은 레이어와 최소한의 장착 물을 사용하여 줄일 수있다.
형광 선택은이 기술의 성공을 위해 중요하다. GFP 및 RFP 모두 잘 작동하고, 두 번 세포 주변을 시각화하거나 단백질 공동 현지화을 평가하기 위해 라벨 수 있습니다. 사용자 정의 필터는 크게 autofluorescence을 절감하고 엽록소가 존재 경우에도 형광 단백질 태그의 민감한 감지 할 수 있습니다. 그러나, germinating cotyledons으로도 필터링 CFP의 autofluorescence은 LSM700를 사용하여 거의 모든 신호의 가시성을 배제 할 수있을만큼 강하다. 스펙트럼 unmixing 기능이있는 악기를 들어, fluorophores의 넓은 선택 가능한 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 극지 :: 극지-eGFP 건설에 대한 시간 경과 프로토콜과 린 Pillitteri 개발에 도움을 아만다 Rychel 감사드립니다. 우리는 또한 PM-RB 구조로 제공 ABRC에 감사하고 있습니다. 이 프로토콜은 일본 과학 기술 청에서 프레스토 수상의 지원을 통해 개발되었습니다. 극지에 관한 연구는 워싱턴 왕실 연구 기금 (RRF-4098)와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (MCB-0855659)의 대학에 의해 지원되었다. 키 관리 프로토콜은 NSF 대학원 연구원 (DGE-0718124)이며, KUT는 HHMI - GBMF 수사관입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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