Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Resumen

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Resumen

Neurona adecuada a la interacción glia es fundamental para la función fisiológica del sistema nervioso central (SNC). Esta comunicación bidireccional está sofisticadamente mediada por vías de señalización específicas entre neuronas y glía ^1,2. Identificación y caracterización de estas vías de señalización es esencial para la comprensión de cómo neurona a la interacción glia formas CNS fisiología. Anteriormente, los cultivos de neuronas y células gliales mixtos han sido ampliamente utilizados para la prueba de las vías de señalización entre las neuronas y la glía. Lo que hemos aprendido de estos preparativos y otras herramientas in vivo, sin embargo, se ha sugerido que la señalización mutuas entre neuronas y glía ocurrieron a menudo en compartimentos específicos dentro de las neuronas (es decir, axón, dendrita, o soma) ^3. Esto hace que sea importante para desarrollar un nuevo sistema de cultivo que permite la separación de los compartimentos neuronales y, específicamente, examina la interacción entre células gliales y neuroNAL / axones dendritas. Además, el sistema de cultivo mixto convencional no es capaz de diferenciar los factores solubles y directos señales de contacto entre la membrana neuronal y glial. Además, la gran cantidad de neuronas y células gliales en el co-cultivo convencional sistema carece de la resolución necesaria para observar la interacción entre un solo axón y una célula glial.

En este estudio, se describe un axón y un sistema nuevos glia co-cultivo con el uso de una plataforma de cultura microfluídico (MCP). En este sistema de co-cultivo, las neuronas y las células gliales se cultivó en dos cámaras separadas que están conectadas a través de múltiples canales centrales. En esta plataforma de microfluidos cultura, sólo los procesos neuronales (especialmente los axones) puede entrar en el lado glial a través de los canales centrales. En combinación con el etiquetado potente proteína fluorescente, este sistema permite el examen directo de las vías de señalización entre las interacciones axonal / dendrítico y glial, tals axón mediada por la regulación transcripcional en células gliales, el tráfico del receptor mediada por células gliales en terminales neuronales y gliales mediada por el crecimiento del axón. El diámetro estrecho de la cámara también significativamente prohíbe el flujo del medio de neurona enriquecido en la cámara de glial, facilitando el sondeo de la membrana directa-proteína interacción entre axones / dendritas y superficies gliales.

Protocolo

1. Asamblea de la Cámara de Cultura Microfluidic (MCP)

1. MCP (Figura 1) son cámaras abiertas diseñado para culturas compartimentados de diferentes tipos de células ^4. Típicamente tiene dos compartimentos que están conectados a través de los canales centrales (3 m de diámetro). Asamblea del MCP con fondo de cristal platos es necesario para la preparación de las culturas y de análisis de imágenes posteriores.
2. En primer lugar, capa estériles con fondo de vidrio platos con poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) disuelto en tetraborato de sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM, pH 8,5) y se incubaron durante la noche a 37 ° C.

Resultados

Time-lapse de imágenes de análisis axón inducida por la activación del promotor GLT1 en astrocitos

La neurona de compartimentado y el sistema de co-cultivo de astrocitos permite sólo los procesos neuronales, especialmente los axones, para interactuar selectivamente con los astrocitos. Tras el establecimiento con éxito de axón y astrocitos (u otras células gliales) co-cultivo en el ensamblado MCP, diferentes tipos de interacciones gliales del axón puede ser estudiado como; axón inducida por la a.......

Discusión

La neurona MCP y basado en sistema de astrocitos de co-cultivo permite la disección de neurona detallada a astroglía vías de señalización permitiendo que sólo los axones pasan los canales centrales y la interacción con las células astrogliales. Este sistema de co-cultivo se puede configurar cómodamente con neurona convencional y los procedimientos de astrocitos cultura. También se describe una aplicación práctica de este sistema de co-cultivo mediante el empleo de un reportero eGFP base para demostrar axón dependiente d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El suero fetal bovino	Hyclone	SH30070.03	para placas neurona por neurona medio cutlure
El suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F4135	por medio de cultivo de astrocitos
Glial nervio factor derivado	De I + D de sistemas	212-GD	Aplicar 10-20 ng / ml a lado de la cámara de neurona
Dulbecco modificado del águila de mediano alto de glucosa	Sigma-Aldrich	11995
70 mm filtro de células	BD Falcon	352350
Vidrio estéril plato de fondo	MatTek Corporación
Plataformas de microfluidos cultura	Xona microfluídica LLC	SND150
6 pocillos de la placa de cultivo	Cellstar	657 160
			Neurona medio de cultivo Medio Neurobasal 2% suplemento B27 Neurobasal 2 mM de glutamato mediante la adición de 1% 100x GlutaMAX 1% de penicilina-streptomysin
			Neurona medio de cultivo para la célula de recubrimiento Medio Neurobasal 2% suplemento B27 Neurobasal 2 mM de glutamato mediante la adición de 1% 100x GlutaMAX 1% de penicilina-streptomysin 5% de suero fetal bovino SH30070.03
			Medio de cultivo de astrocitos Dulbecco modificado eagle glucosa medio-alto 10% de suero fetal bovino F4135 1% de penicilina-streptomysin
			Materiales Tabla 1. Utilizados en el cultivo de microfluidos plataforma basada axón neuronal y glial sistema de co-cultivo.