Summary
Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.
Abstract
Neurona adecuada a la interacción glia es fundamental para la función fisiológica del sistema nervioso central (SNC). Esta comunicación bidireccional está sofisticadamente mediada por vías de señalización específicas entre neuronas y glía 1,2. Identificación y caracterización de estas vías de señalización es esencial para la comprensión de cómo neurona a la interacción glia formas CNS fisiología. Anteriormente, los cultivos de neuronas y células gliales mixtos han sido ampliamente utilizados para la prueba de las vías de señalización entre las neuronas y la glía. Lo que hemos aprendido de estos preparativos y otras herramientas in vivo, sin embargo, se ha sugerido que la señalización mutuas entre neuronas y glía ocurrieron a menudo en compartimentos específicos dentro de las neuronas (es decir, axón, dendrita, o soma) 3. Esto hace que sea importante para desarrollar un nuevo sistema de cultivo que permite la separación de los compartimentos neuronales y, específicamente, examina la interacción entre células gliales y neuroNAL / axones dendritas. Además, el sistema de cultivo mixto convencional no es capaz de diferenciar los factores solubles y directos señales de contacto entre la membrana neuronal y glial. Además, la gran cantidad de neuronas y células gliales en el co-cultivo convencional sistema carece de la resolución necesaria para observar la interacción entre un solo axón y una célula glial.
En este estudio, se describe un axón y un sistema nuevos glia co-cultivo con el uso de una plataforma de cultura microfluídico (MCP). En este sistema de co-cultivo, las neuronas y las células gliales se cultivó en dos cámaras separadas que están conectadas a través de múltiples canales centrales. En esta plataforma de microfluidos cultura, sólo los procesos neuronales (especialmente los axones) puede entrar en el lado glial a través de los canales centrales. En combinación con el etiquetado potente proteína fluorescente, este sistema permite el examen directo de las vías de señalización entre las interacciones axonal / dendrítico y glial, tals axón mediada por la regulación transcripcional en células gliales, el tráfico del receptor mediada por células gliales en terminales neuronales y gliales mediada por el crecimiento del axón. El diámetro estrecho de la cámara también significativamente prohíbe el flujo del medio de neurona enriquecido en la cámara de glial, facilitando el sondeo de la membrana directa-proteína interacción entre axones / dendritas y superficies gliales.
Protocol
1. Asamblea de la Cámara de Cultura Microfluidic (MCP)
- MCP (Figura 1) son cámaras abiertas diseñado para culturas compartimentados de diferentes tipos de células 4. Típicamente tiene dos compartimentos que están conectados a través de los canales centrales (3 m de diámetro). Asamblea del MCP con fondo de cristal platos es necesario para la preparación de las culturas y de análisis de imágenes posteriores.
- En primer lugar, capa estériles con fondo de vidrio platos con poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) disuelto en tetraborato de sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM, pH 8,5) y se incubaron durante la noche a 37 ° C.
- Al día siguiente, los recubiertos con fondo de vidrio platos se lavaron tres veces con ddH 2 O y se secó bajo la campana de ventilación estéril. Los platos de vidrio de fondo fueron entonces recubiertas adicionalmente con laminina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) y se secó bajo luz UV durante 1 hora. Platos recubiertos están listas para usar o se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso. Estos recubrimiento de unare necesario para las neuronas y astrocitos enchapado en el co-cultivo.
- Para el montaje de la plataforma de la cultura, plataformas de microfluidos de cultivo se colocaron en la parte superior de los recubiertos con fondo de vidrio con platos centrales canales de conexión en su lado inferior para formar un sello hermético. Regular neurona o astrocito medios de cultivo se añadieron (a partir de las áreas de célula de recubrimiento) en ambos lados (Figura 1) en el ensamblado MCP y se incubaron durante 2-4 horas a 37 ° C, para asegurar que no hay fugas entre el MCP y de vidrio plato de fondo. Hemos probado con medio antes de células en placas para asegurar que no haya fugas. El conjunto de la MCP sobre el plato de fondo de vidrio deben estar recién preparadas antes de su uso.
2. Preparación de cultivo neuronal e inducción de los axones neuronales en ensamblado MCP
- Cultivos de células neuronales corticales fueron recién preparada a partir de cerebros de ratón embrionarias 14-16 días de edad. El medio de cultivo neuronal se compone de medio neurobasal, 2% B27 neurobasasuplemento de l, 2 mM de glutamina mediante la adición de 1% de 100x GlutaMAX, y 1% de penicilina-streptomysin. Después de la disección del cerebro del ratón, las meninges se eliminó de la corteza bajo el microscopio de disección. El tejido se troceó a continuación, con una hoja de afeitar para hacer pequeños bloques de tejido con el fin de aumentar el área de superficie expuesta a la tripsina. Los bloques de tejido se trataron con tripsina (Sigma-Aldrich, 0,05% de tripsina) durante 10 minutos en un baño a 37 ° C, y luego disociarse suavemente por trituración con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Las células disociadas se filtraron a través de un filtro 70 micras para recoger suspensión clara de las células neuronales.
- Las neuronas (2-3 x 10 6 / ml, 150 l) se sembraron en las áreas de célula de recubrimiento en el lado derecho (figura 1) de la MCP montado de modo que las neuronas pueden adjuntar en el área de retención celular (Figura 1). Neuronas recién preparados se sembraron con medio de chapado neurona que se complementa con 5% de suero fetal bovino (Hyclone) en la regulaciónr neurona medio de cultivo. Debido a que sólo las neuronas que se conectan en la zona de retención de células son capaces de crecer los axones en el otro lado de la MCP montado a través de los canales centrales, es importante la densidad de placa alto de neuronas en la zona de recubrimiento celular para asegurar suficientes neuronas están unidas a la célula área de retención. Una imagen representativa de alta densidad de axones neuronales se muestra en la Figura 2A.
- Al día siguiente, el medio de recubrimiento neurona se sustituye por el medio de cultivo regular neurona. Cambio de medio se realizó por aspiración cuidadosamente el medio de la zona de revestimiento celular de la cámara, pero no de la zona de retención de células de la MCP montado, con el fin de evitar burbujas de aire en el área de retención de células y los canales de conexión central. Las burbujas de aire severamente inhibirá el axón y la posterior entrada en los canales centrales en el MCP. Glial de células factor neurotrófico derivado (GDNF, 10-20 ng / ml) se añadió también por el otro lado (izquierdo)de la cámara en el mismo día para facilitar la inducción del axón 5 desde el lado neuronal y transversal a través de los canales centrales de la MCP ensamblado (Figura 2A). Cantidad de crecimiento de las neuritas espontáneo sin GDNF también se observa desde el lado neuronal y transversal a través de los canales centrales de la MCP montado. Los axones que entran en el canal central se observan a menudo 2-3 días después de la siembra. Una vez que los axones entrar en el canal central, que generalmente entran en el otro lado en un día. Los axones son normalmente intacta durante al menos una semana después de entrar en el otro lado.
3. La adición de astrocitos en cultivo a MCP para establecer una compartimentado Co-cultura del sistema
Cultivos de astrocitos primarios se prepararon a partir del cerebro P1-3 de ratón cachorro. El procedimiento de disociación cerebro es similar al procedimiento de aislamiento de células neuronales se ha descrito anteriormente. Los astrocitos se cultivaron por primera vez en placa de 10 cm que se pre-Recubiertas con poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). El medio de cultivo de astrocitos (DMEM, 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina-streptomysin) se cambió cada día durante los siguientes dos días para eliminar los desechos. Después de eso, el medio se cambió cada tres días.
- Los astrocitos convertido en 90% confluentes y formar una monocapa después de 7 días. Astrocitos confluentes se trataron con tripsina y 150 l de re-suspendidas astrocitos (1x10 6 / ml) fueron re-chapada en la zona de recubrimiento de células de la parte izquierda de la ensamblada MCP cuando los axones están a punto de entrar o acaban de entrar en el lado izquierdo de el ensamblado MCP. Los astrocitos se sembraron por lo general 4-5 días después de que las neuronas eran plateado. GDNF se retiró antes de la primera re-recubrimiento de los astrocitos en el lado izquierdo de la MCP. Chapados Re-astrocitos se adjunta en el área de retención de células, tal como se muestra por la inmunotinción GFAP (Figura 1). Sólo flujo mínimo de medio entre ambos lados de las cámaras (determinado por fluorescencia dSí) se encontró en el MCP, como se mostró previamente 4,6.
- Los astrocitos convertido en 90% confluentes y formar una monocapa después de 7 días. Astrocitos confluentes se trataron con tripsina y 150 l de suspensión re-astrocitos (1 x 10 6 / ml) fueron re-chapada en la zona de recubrimiento de células de la parte izquierda de la ensamblada MCP cuando los axones están a punto de entrar o acaban de entrar en la izquierda lado del ensamblado MCP. Los astrocitos se sembraron por lo general 4-5 días después de que las neuronas eran plateado. GDNF se retiró antes de la primera re-recubrimiento de los astrocitos en el lado izquierdo de la MCP. Chapados Re-astrocitos se adjunta en el área de retención de células, tal como se muestra por la inmunotinción GFAP (Figura 1). Sólo flujo mínimo de medio entre ambos lados de las cámaras (determinado por colorantes fluorescentes) se encontró en el MCP, como se mostró previamente 4,6.
- Después de la re-recubrimiento de los astrocitos, los axones que entraron en el lado izquierdo de la MCP montado interactúan directamente con la astrocytes, ya sea por contacto directo axonal o liberación de factores solubles. La inmunotinción de GLT1 astroglial membrana plasmática transportadora de glutamato neuronal y βIII de tubulina se realizó para visualizar la interacción entre los axones y astrocitos, como se muestra en la Figura 2D-F.
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Representative Results
Time-lapse de imágenes de análisis axón inducida por la activación del promotor GLT1 en astrocitos
La neurona de compartimentado y el sistema de co-cultivo de astrocitos permite sólo los procesos neuronales, especialmente los axones, para interactuar selectivamente con los astrocitos. Tras el establecimiento con éxito de axón y astrocitos (u otras células gliales) co-cultivo en el ensamblado MCP, diferentes tipos de interacciones gliales del axón puede ser estudiado como; axón inducida por la activación de la activación astroglial promotor del gen, astrocitos inducida guía de axones , axón inducida por astroglial Ca 2 + respuesta y axón inducida por la síntesis de mielina en oligodendrocitos. Todas estas aplicaciones se aprovechan de la disponibilidad de potentes reporteros fluorescentes disponibles para las células gliales o colorantes cargados a estas células.
Aquí se describe axón inducida por la activación transcripcional de glutamato astroglial promotor transportador 1 (GLT1) mediante el uso de cromosomas artificiales bacterianosalgunos (BAC) GLT1 eGFP ratones transgénicos y este sistema compartimentado de co-cultivo. En los BAC ratones transgénicos GLT1 eGFP, un reportero EGFP fluorescencia se sobreexpresa bajo el control del promotor genómico GLT1 7. La expresión del reportero eGFP se correlaciona con la expresión endógena GLT1 promotor de activación de la proteína y la actividad funcional 7 permitiendo así una evaluación de la actividad del promotor de GLT1 en astrocitos individuales in situ. Astroglial expresión GLT1 es altamente dependiente de la estimulación neuronal 6,8. Astrocitos primarios expresar niveles mínimos de GLT1, sin embargo, los niveles de expresión GLT1 (tanto ARNm y proteínas) están fuertemente inducida en astrocitos que se co-cultivan con neuronas 9. La evidencia se muestra aquí por GLT1 aumentó significativamente la inmunorreactividad en compartimentada sistema de co-cultivo (Figura 3). En las neuronas y astrocitos convencional co-cultivos de alta densidad de neuronas hacen menos ideal para observar elefecto de los axones neuronales en la activación transcripcional de GLT1 promotor.
Para controlar la activación dependiente de axón GLT1 promotor, las neuronas de tipo salvaje se cultivaron en el lado derecho de la MCP montado y los axones fueron inducidos tras la aplicación de la GDNF en el lado izquierdo de la MCP montado. Los astrocitos derivados de los ratones BAC GLT1 eGFP se cultivaron en el lado izquierdo de la ensamblada MCP después de que los axones han sido inducidos y acaba de entrar en el lado izquierdo de la MCP montado. Un total de 6 días (24 horas a 140 horas) de lapso de tiempo imágenes fueron recogidos para supervisar el cambio eGFP intensidad de fluorescencia en tiempo real y el crecimiento de los axones en la MCP. Como se muestra en la figura 4A, la expresión de eGFP fluorescencia muy mínimo en astrocitos se observó 24 horas después de la siembra en placa de los astrocitos. Aumento significativo de la intensidad eGFP se observó 48 horas después de co-cultivo (de 24 horas a 68 horas) cuando los axones están bien en el lado de los astrocitos y la interacciónt directamente en contacto con los astrocitos (Figura 4 C). Por otro lado, eGFP intensidad de fluorescencia se redujo gradualmente una vez que los axones se retrae y degenerado por kainita (200 mM) induce la muerte celular neuronal en la neuronal lado (derecho) de la MCP ensamblado (Figura 4D-F). El cambio dinámico de la intensidad de fluorescencia de eGFP en respuesta a los axones demostrado claramente que la actividad del promotor de GLT1 astroglial es modulada por la interacción axón.
Figura 1. Diagrama esquemático de la neurona y la plataforma de microfluidos astrocito co-cultura. Plataforma cultura Microfluidic (MCP) tiene dos compartimentos que están conectados a través de los canales centrales. Las células se pueden sembrar a partir de la zona de recubrimiento de células en cada lado y los axones neuronales son inducidas a partir de la zona de retención celular y pasan a través de los canales centrales a enter el otro lado (inserte la barra de escala de 50 micras).
Figura 2. La inducción de los axones neuronales y la interacción de los axones con astrocitos en MCP MCP. (A) de alta densidad de las neuronas en el área de retención de la célula ensamblada MCP, revelado por inmunotinción βIII-tubulina. Barra de escala: 50 micras (B) Vista ampliada de los axones que cruzan los canales centrales y que entran en el otro lado de la MCP. Barra de escala: 100 micras (C) del cono de crecimiento Axon revelado por la tinción de tubulina BIII-cuando los axones entrar en el otro lado de la MCP. Barra de escala: 100 micras (D) haces de axones que crecen a través del canal central y entrar en el otro lado de la MCP. (E) Los astrocitos revelado por la inmunotinción GLT1 en el lado glial de la MCP. (F) imagen combinada muestra el contacto entre los axones y GLT1 astrocitos positivos. Barra de escala: 50 m.
Figura 3. Neuron-dependiente de la inducción de la expresión de GLT1 en astrocitos primarios GLT1 inmunoreactividad en (A) cultivos de astrocitos primarios, barra de escala:. 50 micras (B) cultivos neuronales primarios, y (C) primarios de neuronas y astrocitos co-cultivos. Barra de escala: Las neuronas se muestran mediante inmunotinción de βIII-tubulina. Aumento significativo de GLT1 se observó inmunoreactividad en neuronas y astrocitos co-culturas.
Figura 4. Lapso de tiempo imágenes de axón inducida por la activación del promotor GLT1 en MCP con BAC GLT1 eGFP astrocitos y neuronas de tipo salvaje. Cambios dinámicos de intensidad eGFP y el crecimiento de axones se recogieron a través de un 6d de lapso de tiempo de grabación después de chapado de astrocitos. (A) 24h (B) 48h (C) 68h (D) 92h (E) 112H (F) 140h. La entrada de unaXON (resaltados por las flechas amarillas) en el lado de los astrocitos se observó a partir de 48h a 92h, que se correlacionan con una mayor intensidad eGFP fluorescencia. Disminución de la intensidad de fluorescencia de eGFP producido a partir de 112h a 140h después de kainita (200 mM), se aplicó en el lado neuronal en 92h para inducir la muerte de células neuronales y la degeneración del axón. Barra de escala: 50 m.
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Discussion
La neurona MCP y basado en sistema de astrocitos de co-cultivo permite la disección de neurona detallada a astroglía vías de señalización permitiendo que sólo los axones pasan los canales centrales y la interacción con las células astrogliales. Este sistema de co-cultivo se puede configurar cómodamente con neurona convencional y los procedimientos de astrocitos cultura. También se describe una aplicación práctica de este sistema de co-cultivo mediante el empleo de un reportero eGFP base para demostrar axón dependiente de la activación del promotor de GLT1 en astrocitos.
Esta MCP basada neurona y astroglía co-cultivo sistema ofrece varias ventajas en comparación con los convencionales de co-cultivo métodos: 1) capacidad de visualizar e identificar la interacción explícita morfológica entre los axones individuales y astrocitos en tiempo real bajo microscopía de alta resolución 2) un pozo microambiente controlado independiente para aplicar la manipulación farmacológica de células específicas de efecto 3) análisis de la activación del promotory expresión de proteínas exclusivamente inducido / hasta reguladas en los astrocitos que se modulan a través del contacto axones. Como los procedimientos de cultivo para primaria microglia y oligodendrocitos 10 11 han sido bien establecidos, este MCP co-cultivo sistema puede ser aplicado también a las neuronas a la microglia y la neurona a oligodendrocitos co-cultivos. Mientras tanto, también reconocen que este sistema de co-cultivo se destina para el análisis de imágenes sensible a nivel de célula única, que es complementaria a los enfoques convencionales de análisis de gran cantidad de células, como el ARN o el análisis de proteínas. Además, nuestro sistema simplifica la interacción enorme entre las neuronas y las células gliales en vivo por la interacción entre ejemplificando sola célula y axón. Todos estos aspectos deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados de este sistema de co-cultivo. En el SNC, las interacciones entre los axones y las diferentes células gliales están muy presentes y son de vital importancia tanto para las neuronas yfunciones gliales 12,13. El desarrollo de este sistema de co-cultivo permitirá obtención de imágenes basada en la disección de estas interacciones.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Jeffrey Rothstein para proporcionar GLT1 BAC ratones EGFP y anticuerpos GLT1; Tufts Center para Investigación de Neurociencia (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) para proporcionar servicios de valor básicos; Nueva facultad de contratación de subvención (NIH P30-02 5P30NS069254 , PI, Phil Haydon) en Tufts Neurociencias Departamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
