Summary
על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.
Abstract
הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH <6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו ') כדי PM.
Protocol
1. הכנת תרבות גליה מאוסה למיזוג תרבות עצבי
- T75 צלוחיות מצופות בפתרון קולגן (01:03 דילול Purecol בDDH 2 O). את הצלוחיות נקבעות זקופות והשאירו לייבוש למשך הלילה בברדס תרבית רקמה.
- חיץ דיסקציה (aCSF: 119 mM NaCl, 5 המ"מ KCl, 1 המ"מ MgCl 2, 30 המ"מימ דקסטרוז, 25 HEPES מ"מ, 7.4 pH, ללא סידן) ותקשורת גליה (DMEM בתוספת 10% FBS, 10 יחידות / המ"ל פניצילין, 10 מיקרוגרם / המ"ל סטרפטומיצין, וGlutamax) מוכנים ומאוחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
- ביום של תרבות גליה, תקשורת גליה היא חממה במשך לפחות 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני הנתיחה של מוח עכבר. עכברים עובריים או ילוד מורדמים באמצעות עריפת ראש מהירה. cortexes מוחיה הם נתחו את הנתיחה תחת מיקרוסקופ.
- רקמות מוח גזור מתעכלות בפתרון פפאין (100 המ"ל פפאין וμl% DNase אני 20 1 בחיץ נתיחת מ"ל 2) על 37 מעלות צלזיוס fo20 דקות r.
- בעקבות עיכול פפאין, רקמות מוח נשטפות עם 10 תקשורת גליה מראש חמם מ"ל. תקשורת גליה הטריה (2 מ"ל) נוספה לאחר מכן לרקמות המוח מתעכלת, ואת הרקמות נכתשה עם זכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת.
- תקשורת גליה הטריה (8 מ"ל) הוא הוסיף לרקמות ניתקו. תא מסננת 70 מיקרומטר משמש לסינון השעית הרקמה ניתקה. תאים אז נזרע לתוך צלוחיות T75 (בדרך כלל 2-3 עוברים 1 T75 בקבוקון זרע יכול) ולהציב לתוך 37 מעלות צלזיוס תא תרבות חממה.
- למחרת, התקשורת מT75 צלוחיות היא aspirated. את הצלוחיות נשטפות עם 10 המ"ל PBS. תקשורת גליה הטריה (10-15 מ"ל) ואז הוא הוסיף לכל בקבוק.
- בתוך 10-12 ימים, גליה בT75 צלוחיות צריכה להיות confluent. תאי גליה נשטפים עם PBS, ו5 מ"ל של טריפסין 0.05% נוספים לכל T75 בקבוק.
- לאחר הדגרת טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תאי גליה הם תאי גלייה וניתקו מכל T75 בקבוק נחלקים לשנייםקולגן מצופים T75 צלוחיות שונות.
- מחדיר תרבות (Millipore PICM03050) מוכנים על ידי צבת אותם לצלחות 6 היטב, ציפוים בקולגן, וייבוש באוויר-בן הלילה. תקשורת גליה (2 מ"ל כל אחת) ממוקמת מתחת לכל תותב תרבות.
- גליה מT75 צלוחיות confluent הם trypsinized וזרע אל מחדיר התרבות (1 T75 בקבוק לצלחת 6 היטב, 2 מ"ל כל הוספה). מחדיר תרבות גליה אלה ישמשו למצב התרבויות העצביות.
2. תרבות עצבית
- את coverslips הזכוכית עבור התרבות העצבית מנוקה על ידי שרייה ב70% 3 HNO לפחות לילה. Coverslips מכן שטף עם 2 לפחות 3 פעמים DDH O, ולייבש בתנור Isotemp (> 200 מעלות) למשך הלילה.
- coverslips ניקה מונחים בצלחת 6-טובה, אחד לכל coverslip היטב. Coverslips מצופים בפתרון פולי-L-ליזין (2 מ"ל, 0.1% בחומצה בורה 100 מ"מימ, pH = 8.5) בלילה 37 מעלות צלזיוס חממה.
- פתרון פולי-L-ליזין הוא להסיר את coverslips וcoverslips נשטפים 3 פעמים עם autoclaved DDH 2 O. Coverslips אז מודגרת ב37 מעלות צלזיוס חממה בלילה בתקשורת ציפוי (Neurobasal להשלים עם סרום 5% חום מומת סוס, 10 יחידות / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 10 מיקרוגרם / מ"ל, Glutamax; 2% B27 תוסף מתווסף למדיום הציפוי ביום בו שימוש).
- ביום למחרת, תקשורת הציפוי מוסרת ו2 מ"ל של מדיה ציפוי טריה עם B-27 נוסף לכל גם שיש coverslip זכוכית.
- עכברות הרות (E15-18) מורדמות עם CO 2, ועכברים עובריים מורדמים באמצעות עריפת ראש. ההיפוקמפוס או סטריאטום הוא גזור מרקמת המוח ולהציב לתוך צינור חרוטים 15 מ"ל עם חיץ קר כקרח נתיחה, לתרבות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים קוצניים בינוניים striatal, בהתאמה.
- רקמות מוח גזור הן ניתקו עם פפאין כמתואר בשלבי 1.4) ו -1.5).
- Following דיסוציאציה, מספר התאים בכל השעיה עצבית נספר עם hemocytometer. הנוירונים מכן נזרעו על כל coverslip בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל היטב של צלחת 6-היטב, ותרבית ב37 מעלות צלזיוס חממת הלילה (הנוירונים DIV 0).
- כדי להכין מחדיר תרבות גליה למיזוג התרבויות העצביות, תקשורת גליה יוסרה ממחדירה תרבות גליה ובינונית ציפוי טרי מתווספת (2 מ"ל ובהוספת 2 מ"ל מתחת למסגרת).
- למחרת (DIV 1), coverslips עם נוירונים ממוקמים מתחת מחדיר תרבות גליה, coverslip אחד בכל טוב.
- הנוירונים ניזונים במחצית הנפח של המדיה טריה חומם מראש האכלה (עם B-27) כל 3-4 ימים עד שהם מוכנים לניסויי transfection והדמיה.
3. Transfection
- transfection העצבי מתבצע באמצעות Lipofectamine 2000. לכל תרבות העצבית (תרבות אחת לכל coverslip), 2 μlLipofectamine 2000 ומיקרוגרם 1 של ה-DNA משמשים. בינוני Neurobasal טרי עם שום תוסף משמש לדילול Lipofectamine וה-DNA.
- ה-DNA וLipofectamine מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר לאחר הערבוב.
- שמור 1 מ"ל של תקשורת מכל עלון מתחת תרבות גליה, ו1 מ"ל מתוך כל הוספה, ולהעביר את התקשורת לצינור חרוטים. הוסף את אותו הנפח של תקשורת מלבה + B27 למדיום הציל ולדגור על 37 ° C. בינוני זו משמשת לתרבות עצבית בעקבות transfection.
- לאחר דגירת 20-דקות Lipofectamine / דנ"א, מחדירה תרבות גליה יוסרו רגעי מהצלחות 6-כן. תערובת Lipofectamine / דנ"א 200 μl מתווספת לכל coverslip עם הנוירונים. מחדיר תרבות גליה מכן חזר לכל באר, מעל לנוירונים. דור של בועות תחת הקרום של מחדירה התרבות יש להימנע. הנוירונים מודגרת עם תערובת Lipofectamine / דנ"א על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות.
- לאחר הדואר תקופת 2-4 שעתי דגירה, מוסיפה גליה יוסרה שוב. תקשורת התרבות עם תערובת Lipofectamine / DNA היא תוסר מכל טובה. התקשורת שנשמרה בשלב 3.3) מתווספת לנוירונים (2 מ"ל לטוב). מחדיר תרבות גליה מוחזרים לכל באר, והתקשורת מכל גליה להוסיף מוסרת, ו2 מ"ל של התקשורת מצעד 3.3) הוא הוסיף לכל הוספה.
- הנוירונים בתרבית ל24-72 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של cDNA transfected לפני TIRF ההדמיה מבוצע על הנוירונים האלה.
4. TIRF הדמיה
- נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF: 119 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, גלוקוז 30 מ"מימ, 2 המ"מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 HEPES מ"מ, pH = 7.4) ישמש לניסויים חייה הדמיה. מערכת הדמית TIRF היא מותאם אישית הגדרה עם 100-mW ציאן ליזר לעירור, וחיוב כפל אלקטרוני מצמידי מכשיר מצלמה (EMCCD) לגלאי.
- לפני ניסויי הדמיה, aCSF הוא הזהיר ב37 & dלמשל; אמבט מי C לפחות 30 דקות. להוסיף החימום להדמיה חייה ממוקם על במת מיקרוסקופ, ולהוסיף החימום, ליזר, והמצלמה התחממו לפחות 30 דקות לפני תחילת ניסויי ההדמיה.
- Coverslip עם הנוירונים transfected הוא כנס לתוך התא חייה ההדמיה. ACSF מראש התחמם הוא ממוקם בתא אחרי התא מורכב; שלב זה אמור להסתיים במהירות אפשרית.
- ברגע שהתא ממוקם על הוספת החימום על במת מיקרוסקופ, הנוירונים transfected מזוהים ויזואלית תחת מצב הדמיה עלית ניאון.
- לאחר נוירונים בריאים transfected מזוהים (ראה איורים 1 ו 2), אנחנו בדרך כלל לבצע 1 דקות של צילום אקונומיקה כדי לחסל פלואורסצנטי pHluorin קיים מראש על קרום הפלזמה, כמו pHluorin-קולטנים על קרום הפלזמה יש רמות גבוהות מאוד כאשר קרינה TIRF ההדמיה ראשונה התחילה, אשר מפריע להדמיה של תוספות אישיותאירועי ertion.
- בעקבות photobleach, הגדרת מכפיל הרווח של האלקטרון במצלמת EMCCD מוגדרת למקסימום, וההקלטה מתבצעת על דקות 1 ב 10 רץ.
- כל הקלטה תכיל 600 תמונות. אירועי הכנסה מזוהים בשמם על ידי משחק חזרה ההקלטה באמצעות ImageJ. אירועי החדרה בודדים מנותחים באופן ידני באמצעות ImageJ.
5. נציג תוצאות
התרבות העצבית העקבית היא המפתח לניסויים מוצלחים חייה הדמיה. איור 1 מציג נוירונים ביפוקמפוס עכבר התרבית באמצעות פרוטוקולנו בין 11 ל DIV דיב 18. זה ברור מהתמונות שהנוירונים פתחו תהליכים נרחבים וכי התהליכים דנדריטיים מכוסים בצפיפות עם קוצים הדנדריטים, סימנים שהנוירונים האלה הם בריאים בתרבות. פרוטוקול התרבות שלנו יכול לשמש גם לסוגים אחרים של תאי עצב במוח. לדוגמה, לאחרונה שימוש בפרוטוקול זה לתרבותהנוירונים striatal בינוניים קוצניים במחקר במטרה לבחון הקולטן D2 דופמין (DRD2) כניסה בנוירונים בתרבית עכבר striatal בינוני קוצני 9. איור 2 מראים נוירונים קוצניים בינוניים striatal עכבר תרבית באמצעות פרוטוקולנו בDIV 8. יש לנו גם בצע בהצלחה TIRF הדמיה של DRD2s pHluorin המתויג-superecliptic בסוג זה של תא עצב. איור 3 מציג ביטוי של pHluorin מתויג-DRD2 (pH-DRD2) בנוירון בינוני קוצניים ויזואליזציה של pH-DRD2 כניסה בתא עצב זה.
איור 1. תרבות היפוקמפוס עכבר תוך שימוש בשיטת תרבות הממשק. DIV: ימים במבחנה, ביום של התרבות נחשב DIV 0. מהתמונות ניכר כי נוירונים ביפוקמפוס הבוגרים בסוג זה של התרבות שבין 11 ל 15 DIV DIV. בשעת 11 וDIV 13, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצי filipodia ולא בשלים. בגיל 15 וDIV18, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצים גדולים, אינדיקציה של נוירונים בוגרים יותר. לוחות שמאל:-הגדלה נמוכה תמונות של נוירונים ביפוקמפוס עכבר בגילים שונים. לוחות נכונים: תמונות בהגדלה גדולה (זום על הדנדריטים עצביים של הפנל השמאלי) של תהליכים דנדריטיים עצביים עם קוצים הדנדריטים בגילים שונים.
איור 2. התרבות המאוסה striatal הבינוני הקוצנית נוירון בשיטת תרבות הממשק. הנוירונים שבתמונות הם בDIV 8.
איור 3. נוירון עכבר striatal הבינוני הקוצני transfected עם סופר קולט האקליפטית pHluorin מתויג-דופמין D2 (pH-DRD2). תמונה מהשמאל היא הקרנת עוצמתו מרבית של הקלטת זמן לשגות (600 תמונות, 100 אלפית שני לכל תמונה). ראשי חץ לבנים מצביעים על החדרת שלפוחי בודדה של pH-DRD2. תמונה זו שומרת מידע הכנסה בממד xy אבל מאבדת את המידע בזמן. תמונה מהימין מציגה הקרנת עצמה מרבית yt, שבו מחסנית xyt היא מסובב 90 מעלות סביב ציר y, ופיקסל המקסימאלי בכל שורת ציר x מוקרן על פיקסל בודד ציר y. תמונה זו שומרת מידע החדרה לאורך ציר yt אבל מאבדת את מידע ציר x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים שלהם נוטים לגדול על גבי תאי גליה, situating somata העצבי ותהליכים דנדריטיים מעבר להישג ידם של מיקרוסקופיה TIRF. לכן, תרבות עצבית נמוכה יותר בצפיפות עם כמה גליה על coverslip היא אידיאלית עבור TIRF הדמיה. בדקנו לראשונה את השיטה בנקר 19, 20, שבתחתית תבנית התרבות זרועה גליה, והנוירונים נזרעו על coverslip והניחה הפוכים בצלחת התרבות. Coverslip ושכבת גליה מופרדים על ידי שלוש טיפין קטנות של שעווה על coverslip. שיטה זו פועלת היטב עבור coverslips בגודל קטן יותר (כגון coverslips 15 מ"מ או 18-מ"מ), אך כאשר בחנו את השימוש בשיתוף 25-מ"מverslips, הנוירונים בסמוך למרכז של coverslips לא היו בריאים כמו אלה ליד קצות coverslip.
בעוד הסיבה לפער הזה בנוירון בריאות לא הייתה ברורה לנו, לעצמנו שזה יכול להיות בגלל דיפוזיה מוגבלת של חומרים מזינים למרכז אזור coverslip. לכן פנינו לשיטת תרבות הממשק שמתוארת בכתב היד הזה, כמו הקרום של הכנסת התרבות מאפשר דיפוזיה חופשיה של חומרים מזינים לתאי עצב על coverslips. אנחנו נוירונים seeded על coverslips 25-מ"מ, עם הנוירונים פונים כלפי מעלה. אנו זורעים גליה בעלון תרבות, והנחנו את החדרת מזין גליה על גבי coverslip. אנחנו קבענו ששיטת תרבות הממשק עדיפה על שיטות אחרות שכבר בדקו בעת השימוש coverslips 25-מ"מ לתרבות העצבית עכבר בצפיפות נמוכה, ומניב תוצאות עקביות עבור TIRF הדמיה. כדי לכמת את המאפיינים של הכנסת קולט (תדירות, משרעת), קבוצת ביקורת עם הנוירונים transfected wwildtype קולטנים ith pHluorin מתויג-תמיד צריכים להיות כלולים. קבוצת ביקורת זה משמש גם כבדיקת איכות לתרבות עצבית.
מערכת TIRFM שלנו בנויה על בסיס מיקרוסקופ AxioObserver Zeiss ידני (Carl Zeiss MicroImaging, Inc, Thornwood, ניו יורק). ליזר העירור הוא ניופורט 488nm-100mW ציאן ליזר מערכת (Newport Corporation, אירווין, קליפורניה). הליזר הוא מצמיד את מחוון TIRF Zeiss באמצעות סיב אופטי KineFLEX-P-2-S-488-640-0,7-P2-FCP (מקור פוינט, מיטשל פוינט, האמבל, בריטניה). מראה Dichroic Z488RDC (Chroma Technology Corporation, לווז פולס, VT) שמש כדי לשקף את הליזר נכנס אל α-תכנית Zeiss עדשת 100X אובייקטיבית (NA = 1.46, Carl Zeiss). ET525/50 פליטת מסנן (Chroma Technology Corporation) שמש לגילוי פלואורסצנציה GFP. מצלמת EMCCD Evolve (Photometrics, טוסון, אריזונה) שמשה כגלאי. עדשת ממסר 2.5x הוכנסה בין יציאת מצלמת מיקרוסקופ והמצלמתעידן כדי להשיג רזולוציה מרחבית אופטימלית (0.064 מיקרומטר לכל פיקסל בעת שימוש ב100X NA = 1.46 אובייקטיביים). המצלמה נשמרה ב-80 מעלות צלזיוס במהלך ניסויי הדמיה. LS6 תריס Uniblitz שליטת VMM-D3 בקר (Associates וינסנט, רוצ'סטר, ניו יורק) היה משולב בין ראש הליזר ומשגר סיבים. נתונים נרכשו באמצעות μManager תוכנה (http://www.micro manager.org /).
כל ניסויי ההדמיה שבוצעו על 37 מעלות צלזיוס בתמיסה המכילה aCSF 2 מ"מ CaCl 2. פתרון aCSF זה מותאם ל-pH = 7.4 בטמפרטורת חדר. כשחמם עד 37 ° C, pH של aCSF זה הופך 7.2, שהוא אופטימלי לתאי עצב בתרבית. במהלך רכישה, כוח הליזר מוגדר במקסימום, הן עבור צילום אקונומיקה ונתונים לרכישה. חשיפת מצלמה הותקן ב 100 אלפיות שני, ושיעור הרכישה היה 10 תמונות בשנייה (10 הרץ). רווח EMCCD נקבעמקסימום לא. הקלטות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ (Rasband, WS, NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2012), ואירועי החדרה נרשמו ונותחו באופן ידני. סה"כ אירועים לדקה לכל יחידת שטח נלקחו כתדר של הכנסה, והיו מנורמלים לקבוצת הביקורת של 100%. YT תמונות שניתנו נוצרו בImageJ על ידי ההחלפה של 90 ° ערימת xyt המקורי לאורך ציר y, ועוצמתו המרבית של כל שורת x הייתה מוקרנת על פיקסל בודד של ציר Y באמצעות אלגוריתם הקרנת העצמה המרבי בImageJ.
אירועי הכנסה הם נצפו בדרך כלל כהופעה הפתאומית של הניאון פונטה (שלב עולה במהירות), ואחרי שלב מתפורר שמייצג דיפוזיה רצפטור על הממברנה 7; 9. המראה של הניאון פונטה עם שלב איטי עולה או אלו ללא שלב דעיכה לכאורה (disappe הפתאומיarance) אינם נכלל בניתוח נתונים, כפי שהאירועים אלה עשויים לייצג סחר בשלפוחית תאית כי יש לי לומן פחות חומציים (כמו אלה מreticulum endoplasmic). Photobleach של אוכלוסיות הקולטן לפני שטח קיימים גם למזער את התרומה של התקבצות הקולטן לפני שטח קיים מראש על הממברנה. עד כה, כל הנתונים שלנו נתחו באופן ידני באמצעות ImageJ. פיתוח עתידי של אלגוריתמים לזיהוי אירוע אוטומטי וניתוח נתונים יהיה חשוב להקלה על הסתגלות ויישום של שיטת הדמיה זו לבחינה של הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.
כדי להמחיש אירועי החדרה שלפוחי בודדים של קולטנים pHluorin כותרת-כמה פרמטרים חשובים צריכים להילקח בחשבון. ראשית, עירור הליזר צריך להיות חזק מספיק כדי לאפשר זיהוי של קרינה מן השלפוחית בודדה. במערכת מותאמת אישית מעוצבת, השתמש 10 0-488-mW ליזר ננומטר כמקור העירור שלנו. שנית, הגלאי של מערכת ההדמיה צריך להיות גם רגישות ומהירות כדי להשיג נתונים מהכנסת קולט בזמן אמת, דינמית. מסיבות אלה, אנו משתמשים EMCCD במערכת שלנו. שילוב של ליזר עירור חזק וגלאי EMCCD מציע יכולת איתור מולקולת GFP בודדה במערכת ההדמיה שלנו. הבחירה של מערכת TIRF המותאם אישית מעוצבת שלנו מבוססת על השגת ביצועים מרביים ממשאבים מוגבלים. ראוי לציין שכל מערכת זמינה מסחרי TIRF עם כוח עירור ליזר מספיק (100-488-mW ליזר ננומטר היא מספיק לצרכימים שלנו והוא זמין ביותר על פלטפורמות מסחריות) ומצלמת EMCCD צריכה גם להיות מתאימה להדמיה כגון מחקרים. לכן, עיבוד של מחקרי הדמיה אלה לתאי עצב אינו מוגבל על ידי ביצועים של מערכת TIRFM, אלא על ידי האיכות של תרבות ועקביות של תרבויות העצביות העצביות.
ove_content "> שלישי, בשל פלואורסצנטי הראשוני מקיים pHluorin מתויגים קולטני קרום פלזמה, photobleach תחת מצב TIRF הוא בדרך כלל נחוץ לזיהוי של קרינה מן שלפוחית אחת. בדרך כלל אנחנו מבצעים photobleach 1-דקת שימוש במצב הדמית TIRF במקסימום כוח הליזר פעם נוירון באופן חזותי, שתוצאתה חיסול של רוב פלואורסצנטי pHluorin משטח קיים מראש. כמו כן, חשוב לזכור כי כוח עירור ליזר גבוה גם מעלה את האפשרות של ניזק ליזר וphototoxicity. בניסיון שלנו , באמצעות 100-488-mW ליזר mW כמקור העירור אינו מופיע להציג את הניזק ניכר לנוירונים בתוך תקופת רכישת הנתונים, תוך מתן כוח הליזר מספיק להמחשת קולטנים בשלפוחית בודדה. שיקול חשוב נוסף הוא שהבדלים ב סוגים ומספרים של קולטנים בכל שלפוחית ישפיעו גם על דרישת עירור הליזר.לדוגמה, שהיינו בעבר מסוגל לבחון את ההסדרה של החדרת מקטע גלוטמט רצפטור GluA1 לממברנת באמצעות עירור 50-7 mW ליזר. אנו מעריכים כי כל שלפוחית נבדקה במחקר שכלל 56 ± 6 GluA1 מולקולות, בדומה להערכה שנעשתה על ידי קבוצה אחרת משתמשת בשיטות דומות 12. במחקר האחרון שלנו DRD2, אנו מעריכים כי כל שלפוחית הכילה 30 ± 1 מולקולות, וליזר 100-mW היה מספיק למחקר זה. עם זאת, בגלל הרמה הגבוהה של רעש רקע בתאים חיים, בחינת שלפוחית המכילה רק כמה מולקולות הקולטן (לדוגמה, 5-10) עשויים לדרוש כוח ליזר גבוה יותר מ 100 mW על מנת להשיג מספיק אות ל יחס רעש להדמיה של הכנסת קולט לממברנת הפלזמה בתאי עצב. מציאת האיזון הנכון של כוח רגישות והעירור היא חשובה לתכנון לימודים מוצלחים.השימוש בTIRFM ל iקולטנים superecliptic קוסם pHluorin מתויג-הוחלו על מספר סוגים שונים של רצפטורים עצביים 7-17. עם זאת, חשוב מאוד לזכור שהשיטה הנוכחית שלנו מסתמכת על קולטנים תיוג עם מולקולת GFP וביטוי יתר של הקולטנים מתויגים. חיבור מולקולת GFP לתחום התאי של חלבון קרום עלולה להפריע לתפקודו של החלבון, ולכן חיוני כדי לוודא שאסטרטגית התיוג הזה אינה משמעותי מפריעה לתפקודו של החלבון על פי 9 חקירה. יתר על כן, הקולטן overexpressed עשוי או עשוי שלא להיות כפוף למנגנוני הפיקוח המסדירים את הסחר של רצפטורים אנדוגניים. שיטות עצמאיות ולכן יש צורך לאמת את התוצאות המתקבלות מקולטנים ההדמיה overexpressed pHluorin מתויג-. לדוגמה, במחקרים שלנו GluA1 7 הכנסה, ביטוי עליון וסחר הסינפטי של GluA1 קולטנים אנדוגניים קבלו תוקף uלשיר immunostaining הסטנדרטי / שיטות הביוכימיות או גישות אלקטרו. לסיכום, גישת ההדמיה שלנו, בשילוב עם שיטות סטנדרטיות אחרות לסחר בחלבון קרום, עשויה להיות סייע בניתוח מנגנונים מולקולריים ותאיים מפורטים המסדירים את כניסת קרום פלזמה של חלבוני קרום אחרים בתאי עצב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג'קסון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
