Abstract
原形質膜（PM）と細胞内コンパートメント間の受容体の輸送を支配するメカニズムの理解は、優れた空間的および時間的な解像度で実験的なアプローチを必要とします。さらに、そのようなアプローチは、細胞内区画のものからPMに局在受容体を区別する能力を持っている必要があります。各小胞が受容体の数が少ないを運ぶので、最も重要なのは、単胞の受容体を検出することは、卓越した検出感度を必要とします。と細胞の化学固定を必要とするため、十分な時間分解能1-6を欠いている免疫標識表面受容体の蛍光顕微鏡検査、、受容体の輸送を調べるための標準的なアプローチは両方必要な空間および時間解像度を欠いている生化学的検出、続いて表面ビオチン化が含まれています。これらの制限を克服するために、私たちと他の人が開発され、新しいストラを採用してきた7月17日優れた空間的および時間的な解像度でPMに受容体の動的挿入の可視化を可能にtegy。アプローチでは、受容体のN末端 細胞外ドメインにpH感受性GFP、superecliptic pHluorin 18のタグが含まれています。 Superecliptic pHluorinは、酸性pHで中性pH及び非蛍光液（pH <6.0）での蛍光性のユニークな特性を持っています。したがって、細胞内輸送小胞またはエンドソーム区画の酸性ルーメン内タグ付けされた受容体は、非蛍光性であり、PMの外表面に、細胞外pH中性の環境にさらされた場合にのみ、それらは容易に可視になります。当社の戦略は、結果的に私たちは細胞内輸送小胞の中でそれらからPM表面受容体を区別することができます。十分な空間的および時間的な解像度だけでなく、受容体の動的輸送を研究するために必要な感度を達成するために、我々は採用反映内部合計私たちは光イメージング（〜170 nm）の最適な空間分解能を達成することができイオン蛍光顕微鏡（TIRFM）は、ビデオレート顕微鏡（30フレーム/秒）、感度の時間分解能は、単一GFPの蛍光を検出する分子。 TIRFM下イメージングpHluorinタグ付きの受容体によって、我々は直接培養神経細胞におけるPMに個々の受容体挿入イベントを可視化することができました。このイメージングアプローチは、潜在的にsuperecliptic pHluorinで標識することができる細胞外ドメインを持つ任意の膜タンパク質に適用することができ、異なる膜タンパク質（受容体、イオンチャネル、トランスポーター、など）の挿入をするために、管理キー詳細なメカニズムの解剖を許可します午後。
Protocol
1。神経培養エアコン用マウスグリア文化の準備
- T75フラスコは、コラーゲン溶液（蒸留H 2 O中Purecolの1:3希釈）でコーティングされています。フラスコを立設し、組織培養フード中で一晩乾燥させています。
- 解離バッファ（ACSF：119 mMのNaCl、カルシウムなし5mMのKCl、1mMのMgCl 2、30mMのデキストロース、25mMのHEPES、pH7.4で）やグリア培地（DMEM、10％FBS、10単位/ mlペニシリン、10 μg/ mlストレプトマイシン、およびグルタマックスは）℃使用直前まで準備し、4℃で保存されています。
- グリア文化の日に、グリアメディアがマウスの脳の解剖の前に37℃の水浴中で少なくとも30分間加温する。胚または新生仔マウスは、急速な断頭により安楽死させる。脳皮質を解剖顕微鏡下で解剖されています。
- 解剖した脳組織を37℃パパイン溶液（100mlパパインおよび2 ml郭清を緩衝液中の20μlの1パーセントのDNase I）°CのFOで消化されるR 20分。
- パパイン消化後、脳組織を10mlの予め温めグリアメディアでリンスしています。新鮮グリアメディア（2 ml）を消化した脳組織に追加され、組織はファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて摩砕しています。
- 新鮮グリアメディア（8ml）を解離組織に追加されます。 70μmのセルストレーナーは、解離組織懸濁液をフィルタリングするために使用されます。次いで、細胞を、T75フラスコ（通常2-3胚ができるシード1 T75フラスコ）に接種し、37℃のインキュベーターに入れられる。
- 翌日、T75フラスコから培地を吸引しています。フラスコを10mlのPBSで洗浄する。新鮮グリアメディア（10-15 ml）を各フラスコに添加されています。
- 10から12日以内に、T75フラスコのグリアがコンフルエントになる必要があります。グリア細胞は、PBSで洗浄し、0.05％トリプシン5mlをそれぞれT75フラスコに追加されます。
- 5分間37℃トリプシンのインキュベーション後、グリア細胞はそれぞれT75フラスコから解離およびグリア細胞を2つに分割され異なるコラーゲンコートT75フラスコ。
- 培養インサート（ミリポアPICM03050）を6 - ウェルプレート、コラーゲンでコーティングして、一晩空気乾燥にそれらを置くことによって調製される。グリアメディア（各2ml）を各培養インサートの下に配置されています。
- コンフルエントT75フラスコからグリアをトリプシン処理し、（6ウェルプレートあたり1 T75フラスコ、各2ml挿入）培養インサート上に播種されています。これらのグリア細胞培養インサートは、条件ニューロン培養するのに使用されます。
2。ニューロンの文化
- 神経細胞培養用のカバーガラスは、70％で少なくとも一晩HNO 3を浸漬することによって清掃されています。カバーガラスは、その後ddH 2 Oを少なくとも3回洗浄し、（> 200℃）で一晩Isotempオーブンで乾燥させます。
- 洗浄カバーガラスを6ウェルプレート1ウェルあたり1カバースリップに配置されます。カバースリップを37℃のインキュベーターで一晩、ポリ-L-リジン溶液（2ml、100mMホウ酸、pH = 8.5で0.1％）でコーティングされています。
- ザポリ-L-リジン溶液は、カバーガラスとカバーガラスから取り外されオートクレーブ滅菌蒸留H 2 Oで3回洗浄するカバーガラスは、その後37でインキュベートされる（Neurobasalが5％熱不活化ウマ血清、10単位/ mlペニシリン、10μg/ mlのストレプトマイシン、グルタマックスを補ったプレート培地で一晩℃のインキュベーター、メッキ用培地に添加されている2パーセントB27サプリメント当日）が使用されます。
- 翌日、プレート培地を除去し、B-27に、新鮮なプレート培地2mlのガラスカバースリップを持って各ウェルに添加する。
- 妊娠マウス（E15-18）は、CO 2で安楽死され、マウス胎児は断頭により安楽死させる。海馬や線条体は、それぞれ脳組織から解剖し、海馬ニューロンまたは線条体中型有棘神経細胞の培養のために、氷冷解剖緩衝液を用いて15 mlコニカルチューブに入れられます。
- ステップ1.4）、1.5）で説明したように解剖した脳組織は、パパインによる解離する。
- F解離ollowing、各ニューロンの懸濁液中の細胞数は血球計算板でカウントされます。神経細胞は、その後、6ウェルプレートのウェル当たり0.4×10 6細胞の密度で各カバースリップ上に播種し、37℃のインキュベーターで一晩培養する（ニューロンがDIV 0アール）。
- コンディショニングのグリア培養インサートニューロン培養を準備するには、グリアメディアは、グリア培養インサートから削除され、新鮮なメッキ媒体（インサート内の2ml及びインサートの下に2ミリリットル）を添加する。
- 翌日（DIV 1）は、ニューロンとグリアカバースリップを培養インサート、各ウェル中の1カバースリップの下に配置されます。
- 彼らは、トランスフェクションおよびイメージング実験の準備が整うまで、ニューロンは新鮮予め温めておいた餌メディア（B-27）3〜4日ごとに半分の容積が供給される。
3。トランスフェクション
- 神経細胞のトランスフェクションは、リポフェクタミン2000を使用して実行されます。各ニューロンの培養用（カバースリップあたり一つの文化）、2μlのリポフェクタミン2000と1μgのDNAを使用しています。ノーサプリメントで新鮮Neurobasal培地はリポフェクタミンとDNAを希釈するために使用されます。
- DNAとリポフェクタミンを混合した後、室温で20分間インキュベートする。
- 各グリア培養インサート下からのメディアの1ミリリットルを保存し、各インサートの内側から1ミリリットル、円錐管にメディアを転送する。 37℃で保存した培地でインキュベート℃にメディア送りの同じボリューム+ B27を追加この培地は、トランスフェクション後の神経細胞培養のために使用されます。
- 20分リポフェクタミン/ DNAのインキュベーションの後、グリア培養インサートを6ウェルプレートから瞬間的に削除されます。 200μlのリポフェクタミン/ DNA混合物をニューロンと各カバースリップに追加されます。グリア細胞培養インサートはその後ニューロン上に、各ウェルに返されます。培養インサートの膜の下の気泡の発生は避けるべきである。ニューロンは2〜4時間、37℃でリポフェクタミン/ DNA混合物と共にインキュベートする。
- 目の後E 2〜4時間のインキュベーション期間、グリア挿入が再び削除されます。リポフェクタミン/ DNA混合物と培養培地を各ウェルから除去されます。ステップ3.3）に保存されたメディアは、ニューロン（ウェル当たり2ミリリットル）に追加されます。グリア細胞培養インサート）を各ウェルに返され、各インサートからグリアメディアが削除され、ステップ3.3からのメディアの2ミリリットル各インサートに追加されます。
- ニューロンは、全反射イメージングは、これらのニューロン上で実行される前に、トランスフェクトされたcDNAの発現を可能にするために、追加の24から72時間培養する。
4。 TIRFイメージング
- 人工脳脊髄液（ACSF：119 mMのNaCl、2.5mMのKCl、30mMのグルコース、2mMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、25mMのHEPES緩衝液、pH = 7.4）をライブイメージング実験のために使用されます。当社の全反射イメージングシステムは、検出器のための100 mWのシアン励起用レーザー、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラでセットアップカスタムです。
- イメージング実験に先立ち、ACSFは37＆dで警告される例えば、少なくとも30分間℃の水浴。ライブイメージング用加熱インサートは、顕微鏡ステージ上に配置され、加熱挿入、レーザー、カメラはイメージング実験の開始前に少なくとも30分間温めています。
- トランスフェクトされたニューロンとカバースリップをライブイメージング室に組み立てられる。チャンバーを組み立てた後あらかじめ温めておいたACSFはチャンバ内に配置され、このステップはできるだけ迅速に完了する必要があります。
- チャンバーは顕微鏡ステージ上で加熱インサート上に置かれると、トランスフェクトされたニューロンは、エピ蛍光イメージングモードで視覚的に識別されます。
- 健康なトランスフェクトされたニューロンは（ 図1及び図2参照）を同定した後、原形質膜上のpHluorin-受容体は非常に高い蛍光レベル時を持っているように、我々は一般的に、細胞膜上の既存pHluorin蛍光を排除するために、光漂白剤の1分を実行TIRF画像が最初に開始され、これは、個々のプラグインの可視化を妨げるertionイベント。
- 光退色後、EMCCDカメラで電子増倍管のゲイン設定が最大に設定されており、記録は、10 Hzで1分間実行されます。
- 各記録は600の画像が含まれています。個々の挿入イベントがImageJを用いた記録バックを再生することにより識別されます。個々の挿入イベントは手動でImageJを用いて分析する。
5。代表的な結果
一貫性のあるニューロンの培養は成功したライブイメージング実験の鍵となります。 図1に 18をdivに、DIV 11から我々のプロトコルを使用して培養したマウス海馬神経細胞を示しています。これは、神経細胞が広範囲プロセスを開発していることと、樹状突起は樹状突起棘、これらのニューロンは、文化の中で健康であることの表示で密に覆われている画像から明らかである。私たちの文化プロトコルはまた、脳内の神経細胞の他のタイプを使用することができる。例えば、我々は最近、文化に、このプロトコルを使用培養マウス線条体中型有棘ニューロン9にドーパミンD2受容体（DRD2）の挿入を検討する研究では線条体中型有棘ニューロン図2は、DIV 8時に我々のプロトコルを使用して培養したマウス線条体中型有棘ニューロンを示しています。我々はまた、正常ニューロンのこのタイプのsuperecliptic pHluorinタグ付きDRD2sの全反射イメージングを行った。 図3はpH DRD2このニューロンにおける挿入の中型有棘ニューロンと可視化でpHluorinタグ付きDRD2（PH-DRD2）の発現を示す。
インタフェース培養法を用いて図1。マウス海馬培養。 DIV：in vitroでの日、文化の日は、DIV 0とみなされます。画像から、それは明らかであるDIVとDIV 11〜15の間の文化のこのタイプの成熟した海馬ニューロン。 DIVの11と13で、ニューロンの樹状突起はfilipodiaと未熟な棘で覆われている。 DIVの15時と18は、ニューロンの樹状突起は、大きな棘は、より成熟した神経細胞の指標で覆われている。左パネル：異なる年齢のマウス海馬ニューロンの低倍率像。右のパネル：高倍率画像（左パネルのニューロンの樹状突起上でズーム）は、異なる年齢での樹状突起と神経細胞樹状突起の。
インターフェイス培養法を用いて図2マウス線条体中型有棘ニューロン文化。画像内のニューロンは、DIV 8時です。
図3：スーパー黄道pHluorinタグ付きドーパミンD2受容体（PH-DRD2）を用いてトランスフェクトマウス線条体中型有棘ニューロン。左の画像は、タイムラプス記録の最大値投影（600画像、画像あたり100ミリ秒）です。白い矢印は、pH-Dの個々の小胞の挿入を示すRD2。この画像は、xyディメンションの挿入情報を保持しますが、時間情報が失われます。右の画像はXYTスタックがy軸の周りに90度回転させ、各x軸線上の最大ピクセルは、単一のy軸の画素に投影された、YT最大値投影を示しています。この画像はYT軸に沿って挿入情報を保持するが、x軸の情報が失われます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
