Summary
我们描述了一个有价值的诊断方法，有可能被用来决定撤出未经移植排斥反应的风险升高，移植后的免疫抑制。该法采用迟发型超敏反应的原则，并提供准确的评估，既供者特异性效应和调节免疫应答安装收件人。
Abstract
体内 T细胞依赖的免疫应答，宿主的免疫系统在最近的过去经历了一个外来抗原（Ag）的表现形式是一种快速的迟发型超敏反应（DTH）。 DTH反应通常分为致敏阶段，指的是最初的抗原经验，挑战阶段，通常如下致敏后数天。往往被视为无能的证据缺乏的迟发型超敏反应皮肤测试证明召回银。传统的DTH试验已有效地用于诊断许多微生物感染。
尽管共享相似的免疫功能，如淋巴细胞浸润，水肿，组织坏死，直接DTH直喷导致致敏供者抗原与移植物丢失的可能性，因为不是一个可行的诊断技术在移植患者。为了避免这个问题，哼哼开发一个鼠标“体内反”DTH检测1,2。此测试本质上是一个传输的DTH试验，人外周血单核细胞（PBMCs）和特异性抗原皮下注射到羽片或一个天真的的鼠标和DTH像肿胀足垫3 18-24小时后测量。人类抗原提呈细胞如巨噬细胞或区议会高度血管小鼠组织中的T细胞的抗原提呈触发炎症级联反应，并吸引了小鼠的免疫细胞，导致肿胀反应。该反应是抗原特异性的，并需要事先致敏抗原。一个积极的捐助者反应在电视DTH检测反映的DTH反应，移植的病人已经发展向移植同种抗原的亲炎症免疫处置。
在此检测中最重要的特征是，它也可以被用于检测调节性T细胞，从而引起旁观者抑制。一个旁观者抑制供体抗原的存在是的DTH召回响应特征与接受同种异体移植受者2,4-14。同种异体反应性和监管的TV-DTH移植术后监测可能确定谁可以受益于减少免疫抑制的患者没有拒绝或肾功能恶化的风险升高的一个子集。
一个有前途的领域是电视DTH检测监测自身免疫15,16和17在肿瘤免疫学的应用。
Protocol
1。淋巴细胞的制备
- 收集血液进入ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）管。
- 按照标准方法，用淋巴细胞分离液从新鲜人外周血的PBMC隔离。
- 外周血单个核细胞用PBS三次洗净，去除污染的血小板。血小板被发现干扰反式被检体内的DTH试验。最大允许PBMC制备血小板污染是≤1×10 7 /注塑。
- 如果有明显的红血细胞污染，执行第一次洗涤后，使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。将ACK缓冲液，用PBS洗涤2次。
2。制备特异性抗原
- 使用上面所示的过程从供体外周血的PBMC隔离。
- 于PBS中的浓度为120x10 6细胞/ ml（4×10 6个细胞/ 30微升）重悬供体的PBMC。
- 加入1μM的苯甲基磺酰氟的混合物，以防止蛋白质退化。
- 超声处理的细胞悬浮液，用2毫米的探头超声波破碎仪使用7个1秒的脉冲。 （注意：保持材料的冷，并避免过多的气泡，如果出现泡沫，让细胞悬液，坐冰2-3分钟）。
- 验证使用血球细胞> 90％的中断。
- 在14,000 rpm离心该混合物在4℃下冷藏20分钟的离心。
- 上清转移到一个新的2.0毫升安全锁管，并确定蛋白浓度。
3。细胞制备的注射
- 为每次注射等分7×10 6到2.0毫升安全锁管PBMC。
- 离心一分钟6000转离心，去除上清。
- 带或不带抗原在PBS中重悬细胞。调整进样体积为35微升，用PBS。下面的计划是用于注射：
阴性对照：外周血单个核细胞+ PBS
阳性对照：PBMC + TT / DT（25亩克/注射液）
实验抗原特异性反应：外周血单个核细胞+测试AG（4-8微克/注塑）
实验抗原特异性调节：PBMC +测试的Ag + TT / DT
4。测量前，注射，测量后
- 异氟醚麻醉CB17 SCID小鼠。使用弹簧式卡尺测量后脚掌厚度。认厚度足垫的中心，一个边缘上行走的脚的焊垫接触，以提供一个基准，以保持测量部位一致。脚垫的厚度记录时，压力表读数稳定。
- 慢慢细胞悬液注入皮下的小鼠使用半CC胰岛素注射器，28号针头的脚垫。针指向脚趾，斜面朝上，执行注入。 （注意：确保没有任何泄漏）。
- 注射后18-24小时，麻醉鼠标垫肿胀与异氟醚和重复测量。
- Subtr行事每个足垫的厚度，在注射之前，从后喷射值取得足垫的膨胀值，在10 -4英寸为单位表示的数据。计算的抗原特异性的净肿胀：控制垫肿胀（外周血单个核细胞+的PBS）中减去从足垫肿胀的处理获得的值（外周血单个核细胞+供体同种抗原，TT / DT，或供体同种抗原+ TT / DT）。阳性对照响应召回抗原TT / DT≥25×10 -4英寸以上背景响应PBS所需的测试被认为是有效的。
- 确定供者抗原的存在下进行比较，使用下列公式计算各喷射净肿胀抑制召回响应：
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Representative Results
1。评估肾移植供体抗原特异性反应使用电视DTH检测
为了测试我们的捐助者反应在肾移植术后细胞免疫注射PBMC从这些患者与供者抗原单独或与召回抗原破伤风类毒素（TT）。仅与TT作为阳性对照细胞注射。我们观察到三个主要模式的迟发型超敏反应移植受者（ 图1）。所有患者反应强烈，召回AG（TT）。患者＃62所示的调节柄，其特征在于由一个弱响应于供体抗原和一个带标记的链接的抑制（67％），调用在存在供体抗原的抗原反应。这是一种模式，已经发现，与器官移植耐受性。病人第48件展品一个非监管模式，其中有弱响应捐助的功能，但没有挂抑制（或挂钩抑制<50％）的。这格局已经经常观察患者服用免疫抑制药物。然而，部分患者仍在接受移植后免疫抑制药物可能会显示联供体抗原抑制他们的DTH反应。的患者＃8展品捐助敏化模式，由高响应捐助者的抗原，并没有挂抑制。这种反应是与移植排斥反应的临床病例研究8。
2。临床监测肾移植供者特异性的调节作用
外周血单个核细胞在ITN507ST观察试验受试者进行了测试（“容错肾移植患者”的鉴定及其机理的调查）为供体特异性T效应间接的途径和调节性T反应使用TV-DTH检测和捐助者（或捐赠者HLA-匹配的替代品）的抗原。 如图2A中所示，间接通路T效应供者抗原的反应揭示了一个独特的频谱在招生组，足垫肿胀随着患者的临床状态范围从那些宽容那些长期拒绝。宽容收件人诱导外周血单个核细胞减少或没有拒绝个体的外周血单个核细胞的DTH反应，而引发强烈的肿胀反应。
抗供体的间接途径调节性T响应由链接抑制试验表明，免疫调节是一个重要的机制，接受肾移植。 如图2B所示监管措施减少通过中间范围最（TOL）的测量（单色和SI）至少宽容（CR）14例。
3。使用TV-DTH检测自身免疫监测
一个有前途的领域是应用TV-DTH检测在自身免疫性疾病监测。 BOS，纤维化的过程闭塞小气道阻塞肺移植，肺移植失败的最常见的原因。
通过测试细胞介导的免疫力，V型胶原蛋白在此过程中的作用，我们发现，闭塞性细支气管炎综合征（BOS）的发展的相对危险度最高的患者中观察到DTH电视的开发了一种积极的响应在其V型胶原的外周血。
图3表明，肺移植受者的外周血单个核细胞，而不是从健康对照组或IV型胶原无肺出血肾炎综合征患者肾移植后，经常胶原蛋白V无15。
4。肿瘤免疫学的应用
跨体内DTH优先考虑接种疫苗治疗的前列腺癌患者在癌症研究开辟新的可能性。由于调节性T细胞的发生和发展中扮演着重要的角色，我们使用TV-DTH测试反应的PBMC来自癌症患者的治疗与DNA疫苗编码前列腺酸性磷酸酶（PAP）。我们响应召回的旁观者抑制抗原确定抗原特异性的监管活动是否正在接种疫苗后的反应引起。我们发现PAP-特异性调节性T细胞在一些前列腺癌患者自发产生，坚持在免疫和防止PAP-特异性效应反应免疫后检测。在一些患者中，我们确定PAP特异性调节性T细胞免疫反应之前。可伴有未能开发的抗原特异性Th1型免疫反应的疫苗接种后获得的预先存在的调节性T细胞，具体为PAP。另外预现有的调节性T细胞的反应，以PAP将确定多个免疫后的患者可能发展效应反应。无论哪种方式，这个实验提供了一个重要的发现，因为它可能会建议优先考虑或排除逐张idual患者从抗原特异性疫苗的评价17。
图1。发现在肾移植术后患者外周血单核细胞分别注入CB17 SCID小鼠的脚垫无论是召回抗原（TT），供体抗原或捐助者+召回抗原的三个主要模式的迟发型超敏反应（DTH）的例子 。显示是背景的净肿胀反应过度。
图2。间接途径T细胞分析。主题就读分为五组：同卵双胞胎，临床宽容（TOL），单用类固醇（单声道），标准的免疫抑制（SI）和慢性排斥反应（CR）进行了调查（B）T效应反应（A）和调节性T反应电视DTH检测。所有面板：个人每个科目（个别的符号）和组中位数（水平线）与四分结果显示出来。重大群体之间的差异表明，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001;＃P = 0.04，＃＃P = 0.03，＃＃＃P = 0.008。
图3。测量V型胶原蛋白特异性自身免疫电视DTH测定。电视DTH反应获得正常健康对照组，与GPS或肺移植受者的肾移植受者的外周血单个核细胞。所有3组召回抗原阳性反应（≥25×10 -4英寸净肿胀），上校（我I）表示的fibrilar特定的关节软骨的胶原蛋白，没有引起电视组或对照组的DTH反应。肾移植受者与GPS有升高意味着肿胀COL（IV）的反应。肺移植并没有回应COL（IV），但没有回应上校（V）。
图4。使用的电视DTH测定的，以评估肿瘤诱导的免疫调节前列腺癌患者的外周血单个核细胞分别注射前列腺酸性磷酸酶（PAP）单独或与TT / DT召回抗原和前列腺特异性抗原（PSA）作为对照，带或不带注射记得抗原TT / DT。注射PAP + TT / DT确定PAP抗原特异性调节性T细胞，共同管理的PSA无法抑制DTH反应的TT / DT召回的抗原。
图5。电视DTH试验的重复性。冻存细胞1/15/2007白细胞分离获得解冻后，用PBS洗涤，与PBS或EBV：P37-TE + EBV（自肽）或P37-MA + EBV（捐助肽）的混合注入脚垫。在下面的时间点：2008/7/29，2010/2/23，2011/9/1，2011/10/11，2011/12/15细胞进行了测试。
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Discussion
跨体内的DTH检测是一种新型的诊断测试与评估细胞介导的反应，移植，癌症和自身免疫性病人中的一个潜在的临床应用。它是有价值的，因为它不仅是有用的监测召回T效应反应，而且还可以检测调节性T反应。一种可靠的方法来检测人类DTH调控可能预测免疫抑制戒断安全的患者中单药治疗或耐受性试验的候选人是谁。
DTH电视的间接通路的MHC allorecognition的检测是非常敏感的。然而，TV-DTH可以被修改，检测对完整的供体MHC分子的直接alloresponse。要检测供体抗原联抑制DTH，EBV-LCL细胞表达单一捐赠者HLA-I类或II类，可与病人外周血单个核细胞共注射。 EBV-LCL用作DTH检测的抗原的来源时，细胞与万拉德的γ-照射，200,000细胞共外周血单个核细胞注射到SCID小鼠的足垫。
电视DTH发展过程中，我们发现，一些条件可以影响这个实验。其中最重要的是旁观者抑制检测要求。我们提供的证据，以检测抑制回收的DTH响应共定位的供体抗原，无论是挑战站点和免疫活性的小鼠收养主机限制的Tv-DTH试验的灵敏度是至关重要的因素。宽容移植PBMC介导的旁观者抑制PBMC注入的脚垫，而不是耳朵，只有在免疫缺陷，免疫功能正常小鼠3。
像所有的检测TV-DTH测试有实力和弱点。的巨大的电视DTH测定的优点包括以下各项：1）是很敏感的，并且能够可靠地检测人的调节性T细胞，2），它检测到由它们的功能的调节性T细胞不是由t嗣表型，3）检测到两个的Th-1-17钍效应反应4）粗细胞裂解物可用于检测不致敏患者供体抗原5）这个实验中呈现高再现性/稳定（ 图5）的情况下的调节。其缺点是：1）它需要相对大量的PBMC每次注射; 2）的技术要求，特别是在广泛的培训旁观者抑制测定。
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Disclosures
这份手稿的作者有没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
笔者想承认的贡献AM万巴斯柯克我们的理解的发展DTH反应，移植受者的监管。这项工作是支持的NIH拨款PO1AI084853和R01AI066219-06，由欧盟资助的一个研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
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