Summary
Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. "משכית תמונת הלבנה-" מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות ו
Abstract
תמונה רציפה הלבנה-מספק דרך לא פולשנית לתייג SCS הבודד בNMJ. NMJ הוא סינפסה הגדולה ביותר של מערכת העצבים של היונקים וכהן כמנחה מודל ללמוד מבנה ותפקוד הסינפטי. במסופי האקסון מוטורי NMJs עכבר להקים אתרי מגע הבייגלה עם סיבי שריר. מנוע האקסון ומסופו הם המכוסים בSCS. במהלך העשורים האחרונים, מספר עכברים הטרנסגניים כבר נוצר כדי לחזות הנוירונים מוטוריים וSCS, לדוגמא 1 Thy1-XFP ו PLP-GFP עכברים 2, בהתאמה.
לאורך האקסונים מוטוריים, SCS axonal myelinating מסודר בהלא חופף internodes, מופרד על ידי צומת של Ranvier, כדי לאפשר התקדמות פוטנציאל פעולה קופצנית. בניגוד לכך, SCS טרמינל הסינפסה הם תאי גליה מיוחדים, אשר לפקח ולקדם עצביים, לעכל האקסונים מדריך מתחדש ופסולת. NMJs מכוסה היטב על ידי עד חצי תריסר הלא myelinating SCS מסוף - אלה, עם זאת, לא ניתן לפתור באופן אישי על ידי מיקרוסקופ אור, כפי שהם נמצאים בקשר ישיר קרום 3.
כמה גישות קיימות בנפרד לדמיין SCS מסוף. אף אחד מאלה הם ללא רבב, אם כי. לדוגמה, מילוי צבע, שם תאים בודדים הם משופדים עם microelectrode צבע מלא, דורש להרוס את תאים שכותרתו לפני מילוי שנייה אחת. זה אינו תואם עם הקלטות זמן לשגות באות 3. תיוג בעל רפאים "Brainbow" של SCS הושג באמצעות ביטוי קומבינטורית של חלבוני ניאון 4. עם זאת, טכניקה זו דורשת שילוב של מספר transgenes ומוגבל על ידי דפוס הביטוי של היזמים בשימוש. בעתיד, ביטוי של חלבונים "צילום" בהחלפת SCS יכול להיות עוד 5 חלופיים. כאן אנו מציגים צילום הלבנה רציף, שבו תאים בודדים המולבנים, ותמונתם מתקבלת על ידי חיסור. אנו מאמיניםכי גישה זו - בשל הקלות והרבגוניות שלו - מייצגת תוספת קיימא לפלטת הטכנולוגיה של הנוירולוג, במיוחד כפי שהוא יכול להיות בשימוש בגוף חי והועבר לתאים מסוגים אחרים, אתרים או מינים 6 אנטומיים.
בפרוטוקול הבא, אנחנו פירוט היישום של מיקרוסקופיה confocal הלבנה רציפה ולאחר הזמן לשגות לSCS מסוף בexplants השרירים sterni triangularis. הכנה זו דקה, שטחית ונתחה בקלות עצבי שרירי 7,8 הוכיחה שימושית ללימודים של NMJ פיתוח, פיזיולוגיה והפתולוגיה 9. לבסוף, תסבירו כיצד שרירי sterni triangularis מוכנים לאחר הקיבוע לבצע קורלציה רזולוציה גבוהה confocal הדמיה, או בדיקות אימונוהיסטוכימיה ultrastructural.
Protocol
1. Triangularis Sterni Explant (איור 1)
תזמון: 15 דקות.
- הכן את מכשירי ניתוח: 2 זוגות של מלקחיים, 1 זוג מספריים, 1 זוג מספרי האביב, צלחת תרבית רקמה 1 (10 סנטימטרים). מראש מבעבעים-(מינימום 15 דקות) מקורר (4 ° C) הפתרון של רינגר עם 5% CO 2/95% O 2. מלא צלחת תרבית רקמה 15-סנטימטר עם קרח ולכסות אותו עם לוחית מתכת. הכן מיקרוסקופ נתיחה ולמקם את צלחת 15-הסנטימטר עם קרח מתחת להיקף הנתיחה כדי לקרר את explant במהלך נתיחה.
- קטלני להרדים את העכבר על ידי מנת יתר isoflurane (או כל שיטה אחרת שאושרה לקורבן). רסס את העכבר עם אתנול 70% על מנת למנוע זיהום פרווה של explant. להלבנת SC, השתמש עכברי PLP-GFP, אשר ניתן לחצה Thy1-OFP3 או Thy1-Membow13 להדמיה סימולטני של האקסון.
- שימוש בזוג מספרי גדול, לעשות חתך קו אמצע שלהעור מעל עצם החזה ושני חתכים מקבילים לקצה התחתון של כלוב הצלעות.
- השימוש בזוג מספרי גדול, להסיר את העור, לפתוח את דופן הבטן, ולבצע חתכים מקבילים לצלעות את כל הדרך חזרה לעמוד השדרה. ואז לנתח את שרירי החזה על ידי ביצוע חתכים קרובים יותר להחדרה בשרירי עצם החזה.
- חותך את הסרעפת הפתוחה ממש מתחת לסחוס xiphoid ולנתח את הסרעפת יחד הוספות costal.
- מחזיק את כלוב צלעות על ידי תהליך xiphoid עם סט של מלקחיים, להתחיל לחתוך את הצלעות את עמוד השדרה, קרוב ככל האפשר להוספות שלהם. קיצוצי השמאל וימין צריכים להתכנס מעל הלב כלפי manubrium sterni. נסה להימנע מחיתוך כלי דם גדולים (במיוחד את ורידי subclavian). ראות טובה יותר מושגת על ידי הרמת הכנת עדינות תוך אחיזה בתהליך xiphoid עם מלקחיים.
- לעשות חתך רוחבי מתחת manubrium sterniולהעביר explant לתוך צלחת 10-הסנטימטר עם פתרון 2 בועות-CO של רינגר המקורר 5% 2/95% O. מניח את צלחת 10-הסנטימטר על לוחית המתכת המכסה את צלחת תרבית רקמת 15-הסנטימטר מלא בקרח. צריכים לעשות את כל צעדים נוספים תחת המיקרוסקופ לנתיחה.
- בעזרת מספרי האביב קטנים להסיר שאריות של בלוטה התימוס, הצדר, סרעפת (בפנים) ושרירי חזה (חיצוניים; איור 1B-D).
- כדי להתאים את המנה לexplant 3.5-הסנטימטר, לנתח את כל הצלעות שלא להכניס לעצם החזה. הדרך טובה ביותר לעשות שימוש במספרי האביב קטנים וחיתוך רקמות שבבין צלעות (האיור 1E).
- הצמד explant sterni triangularis עצבי השריר לתוך צלחת Sylgard המצופית 3.5-סנטימטר רקמת התרבות באמצעות סיכות minutien (קצר ל< 4 מ"מ; האיור 1G). שתי סיכות צריכות לעבור את חלקי סחוס (לבן) של עצם החזה. הכנס לפחות שתי סיכות דרך הצלעות הן בצד השמאל וימין של הexplant הדואר מכוון לחלקי הסחוס הרכים והימנעות מהצלעות מתחת או קרוב לשריר triangularis. ככל שיותר סיכות משמשות, טוב יותר (בדרך כלל משתמשים באנו 8-10). כפי שאתם להצמיד הכנה, לוודא שהצלעות מפוזרות במקצת, תקן את השריר למצב מתוח במקצת.
- אופציונלי: דמיינו אתרים המכילים קולטניים אצטילכולין סינפטיים ידי הוספת bungarotoxin מצמיד את צבעי Alexa (ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל בפתרון 2-בועות של רינגר 5% CO 2/95% O). דגירת explant הצמיד בצלחת מצופית Sylgard לדקות 15-20 בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים עם פתרון 2-בועות של רינגר 5% CO 2/95% O.
2. SCS הלבנה ומיקרוסקופיה זמן לשגות אופציונלית (איור 2)
תזמון: 30 - 45 דקות + 1 אופציונלית - 5 שעות לזמן פקיעה.
- העברת מנת Sylgard המצופית של 3.5 סנטימטר לשנינות מצוידת confocal מיקרוסקופh ארגון ליזר (488 ננומטר אורך גל) ויעדי טבילה במים (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA ו100x, 1.0 NA או 60x, 0.9 נ"א).
- אופציונלי למיקרוסקופיה זמן לשגות: הוספה Sylgard מצופית 3.5 סנטימטר צלחת לטבעת חימום, להתקין את מערכת superfusion ובדיקת טמפרטורה (איור 2 א). ודא שאף אחד מהם לגעת explant, השפה של המנה או ציפוי Sylgard. מחמם את המדגם כדי 33-35 מעלות צלזיוס להלבנת SC ללא זמן לשגות, בטמפרטורת החדר היא טובה יותר, כמו תאים להראות פחות דינמיקה בין צעדי הלבנה.
- במטרה לבחון אוויר 4x דפוס עצבוב של שרירי sterni triangularis ולמצוא להקת endplate sterni triangularis. לעבור ל20x אובייקטיבי חרוט הטבילה ולהתחיל לחפש אזורים שטחיים בתוך להקת endplate (צלעות שמעליה אזורים הם מועמדים טובים). שינוי אובייקטיבי למטרה או 100x 60x חרוט הטבילה לבדוק NMJs הבודד. אידיאלי הוא NMJ כי הוא מכוסה על ידי מספר SCS והוא ממוקם מאוד superficially (איור 2 ב '). אם תבצע הדמית זמן לשגות אחרי הלבנה, בחר עד 3 NMJs שקרובים יחסית יחד כדי להגדיל את התשואה.
- לרכוש תמונת confocal של NMJ לפני צילום הלבנת SCS הבודד (איור 2 ב '). (להדמיה ברזולוציה מלאה, למשל בFV1000 מיקרוסקופ אולימפוס, להשתמש, אובייקטיבי 100x 1.0 ו -2.5 NA זום, שתוצאת דגימת נייקוויסט המוגבלת של ~ 0.1 מיקרומטר לפיקסל).
- "פרק" 488 קרן ליזר ננומטר מרכזי בגרעין של SC משתמש בכוח מקסימאלי למשך 5 שניות (לחלופין דפוס יעיל סריקה באזור קטן של עניין ניתן להשתמש, כגון פונקציה "טורנדו הסריקה" במיקרוסקופ אולימפוס; כפי שאנו משתמשים confocal מיקרוסקופ, הליזר הוא מרוכז למטוסי תמונת הצמד ומכאן, ב488 ננומטר עם מטרה של 1.0 NA, <0.5 מיקרומטר קוטר). מחדש להתמקד בתא ושופט הלבנת תוצאה. אם יש צורך לחזור על הלבנת צעד שוב עד רמות GFP הם להפחיתד לרמות רקע קרוב. לרכוש תמונה אחרי הלבנה (האיור 2C). זה קריטי כדי לוודא שהאזור המולבן הוא מחוץ לכל חפיפה בין שני תאים - אם יש חפיפה, הלבנה בתא שני תהיה ברורה.
- חזור על שלב מעל עד שכל אבל אחד SC הם מולבנים (איור 2D-E). האחרון "המולבן" SC מתאים למיקרוסקופיה confocal זמן לשגות. לשחזר תאים בודדים על ידי חיסור של תמונות, לדוגמא שימוש בתוכנת פוטושופ, כדי להתוות מורפולוגיה SC אחת ושטח (האיור 2F). להיות מודע לכך שהפחתת 2 המגים מוסיפה רעש (למשל על ידי יבואם ב" שכבות "רצופות בפוטושופ ולאחר מכן הגדרת הערוץ מלמעלה" הבדל "בתפריט הנפתח בחלק העליון של כרטיסיית ערוצים). זה יכול היה לעקוף באמצעות פונקציה "despeckle" בערוצים לפני החיסור וחיתוך משם כל רקע שאינו ברור מקורןתא מולבן. כדי לייעל, לעומת זאת, זה יכול להיות נחוץ כדי להתאים את הבהירות של שני הערוצים בחלון "הרמות". התמונה המתקבלת של התא המולבן היא על גבי התמונה המקורית של סינפסה, פסאודו הצבועה בגוון ייחודי ושקוף לצבוע את השטח של התא המולבן בתמונה המקורית (מלעשות את זה עבור כל מולבן והאחרון , תאים מולבנים תמונה שמוצגת בתוצאות תרשים 2F).
- אופציונלי: מיקרוסקופיה confocal התחל זמן לשגות אחרי הלבנה כל אבל אחד SCS. קח תמונה במרווחי זמן קבועים (למשל כל 5 עד 10 דקות). השתמש בכוח הליזר קטן ככל האפשר. עד 3 NMJs ניתן הדמיה באותה הישיבה.
- לעשות מפה של NMJs הנושן על ידי לקיחת תמונה ב100x ללא זום, אז תמונות של האזור באמצעות 20x ויעדי 4x (איור 2G-I). "המפה" זו נחוצה כדי למצוא NMJs הבא אימונוהיסטוכימיה של שריר קבוע.
- לתמונהעיבוד, להמיר תמונות בודדות לתחזיות בעצמה מרבית ולשמור בפורמט TIFF. מערבב את כל זמן נקודתי Z-מוקרנים לתוך ערימה וליישר בxy, למשל באמצעות התוסף "stackreg" 10 בפיג'י (חבילה המבוססת על תוכנת הקוד הפתוח ImageJ; המכונים הלאומיים לבריאות).
3. קיבעון ואימונוהיסטוכימיה (איור 3)
תזמון: לינה.
- העברת explant לתוך צינור תגובה 50-מ"ל מכיל לפחות 15 מ"ל 4% PFA על ידי הסרת הסיכות בזהירות. לאחר תיקון קיר בית החזה קדמי המכיל את שרירי sterni triangularis לשעה 1 בקרח. יש לשטוף את רקמה קבועה עם 0.1 M גליצין ב PBS (כדי להרוות מקבע השיורי ולכן להפחית רקע) במשך לפחות 10 דקות. דוגמאות ניתן לאחסן בנקודה זו ועיבוד מאוחר יותר.
- העברת explant קבוע לצלחת 10-סנטימטר Sylgard מצופית רקמת תרבות מלאה עם 0.01 M PBS. גזור את צורת טרפז עם סי 1דה במקביל לעצם החזה והשני דרך מעברי עצם לסחוס - זה מכיל את שריר triangularis על פני השטח שלו. הסרת צלעות תחתונות עם (כלומר טרנס חזה) לחתוך אופקי כך שקצה הזנב של שריר triangularis ניתן לגשת באופן חופשי (איור 3A-D).
- הכנס מזרק כמו סיכה בחלק העליון של הטרפז (איור 3E). השתמש במזרק המצורף למזרק 1 מ"ל ומלקחיים כדי להסיר את שריר triangularis על פני השטח על ידי החזקתה בעדינות אל פינת זנב של השריר ושימוש במחט כמייקרו אזמל. ודא כי קיצוצים נעשים במקביל למישור של קיר בית החזה. ברגע שחלק הזנב של השרירים משתחרר, הכנס זריקת הרגעה נוספת כמו סיכה מתחת לשריר דרך קיר בית החזה - זה משתק את ההכנה ומאפשר הפעלת משיכה עדינה על השריר באמצעות מלקחיים (איור 3F). כפי שאתה חותך tiss חיבורהוספות UE, "לקלף" את השרירים מבית החזה. חותך מצורף זנב אחרון במספרי האביב. הסר שאריות שומן וכלי דם באמצעות מלקחיים. היזהר שלא לקרוע את העצבים. הערה: השתמש במערכות נפרדות של כלים וצלחות לעבודה עם רקמה חייה וקבועה.
- התחל אימונוהיסטוכימיה (באמצעות פרוטוקול סטנדרטי) על ידי העברת דגימות רקמה לפתרון חסימה לשעה 1 בייקר בטמפרטורת חדר. נפח הקטן ביותר האפשרי להכתמה הוא 200 μl באמצעות צלחת 96 היטב.
- החל נוגדן ראשוני המדוללים בפתרון חסימה, 200 μl לטוב, לילה ב 4 ° C במטרף.
- שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות.
- החל נוגדן משני מתאים ל1-2 שעות בטמפרטורת חדר דילול בחסימת פתרון.
- שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות.
- הר במדיום נגד דהייה (למשל Vectashield) וcoverslip.
- שקופית מניח על צלחת מתכת מגנטית, מגנט מקום על גבימהמדגם לשטח לכמה שעות או למשך לילה ב 4 ° C. לאטום בלכה לציפורניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה לexplant sterni triangularis המוכן לצלחת הדמיה מוצגת באיור 1G. explant זה מתאים במיוחד עבור vivo ההדמיה NMJs לשעבר כשרירי triangularis מורכבים מכמה שכבות של סיבי שריר בלבד. זה מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה מexplants נגזר מקווי עכבר מהונדסים שגולת הכותרת או SCS (PLP-GFP 2) ו / או אקסונים (1 Thy1-XFP). גורמים קריטיים להדמיה באיכות גבוהה כוללים: (i) הימנעות מלגעת בשרירי triangularis במהלך הכנת explant כדי למנוע פגיעה בסיבי שריר (ii) בחירת סינפסות שטחיות ושטוחות כדי לצמצם סטיות עומק הקשורים, (iii) לא התחממות יתר המדגם (> 37 ° C) ושמירת הדגימה גם מחומצן, (ד) שעלול לעצור superfusion במהלך הדמיה להפחתת סחף או רטט; (v) הצבת צינורות superfusion ובדיקות טמפרטורה בזהירות כדי להימנע ממגע המדגם, כמו גם keeping התחתון של התבשיל היבש למניעת סחף; (vi) איזון מקיף הלבנה עם הימנעות אובדן "ביטחונות" אות בSCS מחוץ ליעד למקסם את הניגוד. עוויתות שרירים ופיצול האקסון לעתים קרובות נצפו תופעות, אם explant פגום ולא בריא. חוסר יציבות של תוצאות ההכנה בתחזיות מטושטשות של ערימות confocal. עם זאת, ברגע שטכניקה המתוארת הרציפה צילום ההלבנה עובדת היטב, היא חושפת את המורפולוגיה של SC מסוף היחיד בפירוט רב (האיור 2F). המורפולוגיה גילתה של SCS מסוף היחיד יכולה להיות די מפתיעה ולא צפויה בקלות לפני ההלבנה. יתר על כן, מידת תנועתיות SC בתוך NMJ לא יכולה להתגלות ללא תיוג תאים בודדים.
בעקבות מיקרוסקופי חי, explant sterni triangularis יכול להיות קבוע ומוכתם לכל סמן של ריבית (איור 3). לשם כך, לחיות תאי הדמיה ניתן לעקוב בחזרה באמצעות מפת Creaטד מראש (איור 2G-I) ונסרק ברזולוציה גבוהה ברקמות הקבועות. בדרך שיטות סטנדרטיות לאימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש - אזהרה אחת כאן היא העובדה שחדירת הנוגדן יכולה להיות מוגבלת למדי באקסונים myelinated ודורשת פעמי דגירת נוגדנים ארוכות מאוד. שוב, בחירת NMJs השטחי והסרת שאריות שומן משריר הקבוע היטב (בלי לגזול ממך את העצבים) מסייעת למנוע זאת מלכודת.
איור 1. הכנת Triangularis sterni explant. () להכין explant עצבי שרירי triangularis יש צורך לנתח את הקיר השלם הקדמי החזה של העכבר (גבי סכמטי על עכבר). (ב) קיר בית חזה קדמי רק לאחר נתיחה. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
איור 3. נתיחה של השריר הקבוע triangularis sterni ותמונה של NMJ הקבוע. () Explant הקבוע triangularis sterni ב PBS בצלחת תרבית תאים מצופים Sylgard. (BD) חתכים בוצע במספרי האביב לבודד שרירי sterni triangularis. (EG) הצמדה של חתיכת explant המכילה שריר sterni triangularis והסרת שריר מפני שטח. (H, אני) תצוגה קבועה של NMJ מאוד שצלם באיור 2. הכתמה לקולטנית אצטילכולין עם bungarotoxin מצמיד Alexa 647 (אדום) ועל שלפוחית סינפטיים עם נוגדן אנטי synaptophysin (לבן). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC שיטת ההלבנה מוצגת כאן היא פשוט, מהירה ותכליתית: (i) הוא מאפשר לחשוף מורפולוגיה SC אחת ודינמיקה ידי מיקרוסקופיה confocal מבוססת על transgene בודד - אשר מהווה יתרון משמעותי בעת שילוב לדוגמא הגישה למודלים למחלות הדורשים אללים נוספים . (Ii) היא השיטה מהירה, כמנתיחה לקיבעון זה ניתן לבצע בחצי יום. (Iii) מספר היישומים רחב, כפי שהיא ניתנת בשילוב עם שיטות אחרות, כגון כריתה סלולרית, אברוני הדמיה, electrophysiology או אימונוהיסטוכימיה. בנוסף, הגישה המוצגת כאן לSCS בNMJs Murine ניתן להכליל את תאים אחרים, רקמות או מינים - דוגמה אחת ליישום של טכניקה קשורה בדג הזברה מוצגת ב6 הפניה. גם חלבוני ניאון אחרים מלבד GFP יכולים לשמש להלבנה וזמן לשגות מיקרוסקופ, למשל YFP או CFP. למרות שאנו לא השתמשנו חלבוני הניאון האלה בSCS, bleachiננוגרם של אקסונים מראה כי חלבון פלואורסצנטי פחות יציב (למשל CFP) בהגדרה זו יכול להיות יתרון. עם זאת, פשרה בין הדמית הלבנה יעילה ויציבה יש למצוא, בהתאם לתוצאות הרצויות (למשל תמונה אחת לעומת זמן לשגות של התאים הנותרים בלתי המולבנים).
ישנן מספר המגבלות לטכניקה, עם זאת. אחד מתייחס לשימוש בשרירי explanted (ומכאן axotomized), המגביל את תקופת ההדמיה. במחקרים הקודמים שמצאנו כי - בהתאם לשאלה נחקרת - explant sterni triangularis יכול לשמש למקסימום של 3-6 שעות. ובכל זאת, תמונה רציפה הלבנה-ניתן להשתמש in vivo, התגברות על מגבלה זו ספקה דגימה ניתן לייצב במידה מספקת כדי להשיג תמונות שניתן נגרעו. שני היבטים נוספים צריכים להיות כל זמן בראש, בעת ניתוח נתונים המתקבל מגישת ההלבנה הרציפה: Phototoxicity (אני) יכול לשנות את הדינמיות SC, כפי killing לתוצאות מסוף SC בהתרחבות מהירה של 11 שכניה. אז יש לכלול בדיקות סבירות, למשל מדידת הסכום של הרחבות והכחשות בסינפסה יציבה. בממוצע, האוכלוסייה של SCS הדמיה לא צריכה לגדול או להתכווץ באופן משמעותי. (Ii) המורפולוגיה של כל אבל SC האחרון מתקבלת על ידי חיסור תמונה. איכות תמונה כזו תלויה בניגוד ההלבנה הושג. זו מושגת בדרך כלל קל יותר בקווי עכבר בהירים. לדוגמה, PLP-GFP עובד טוב יותר מאשר 12 S100-GFP. תמונת החיסור מוסיף רעש, ולכן SCS האחרון מתגלה בדרך כלל בפירוט רב יותר מאשר לאחרים (במיוחד גם, כהדמיה שלאחר מעשה לאחר קיבוע מאפשר באמצעות מטרות נפט גבוהות מספריות צמצם). לפיכך, תכונה מורפולוגית צריכה להתקבל רק כאמיתי, אם הוא גלוי בSCS "האחרון", כמו גם באלה מולבנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למנואלת ודאק, Ljiljana Marinkovi וקריסטינה Wullimann לקבלת סיוע טכני מעולה. אנו מודים וו מאקלין למתן עכברי PLP-GFP. TM נתמך על ידי המכון ללימודים מתקדמים (אוניברסיטת Technische מינכן), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), על ידי אלכסנדר פון הומבולדט--הקרן ועל ידי סוכנות המימון הלאומי ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) במסגרת של "Neuron" iPSoALS ERA-NET ו" הדמית 2-פוטון ". TM וMB נתמכים על ידי המרכז למדע החלבון משולב (מינכן). השעה הייתה נתמכת על ידי בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת Technische מינכן (טום-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
