Summary
La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.
Abstract
RNAs no codificantes son jugadores adicionales en la regulación de la expresión génica. Dirigida en la electroporación in ovo de áreas específicas proporciona una herramienta única para el control espacial y temporal de la expresión de microARN ectópico. Sin embargo, las estructuras del cerebro como ventrales del cerebro medio ventral son más bien difíciles de alcanzar para cualquier manipulaciones. Este sentido, demuestran una forma eficiente de electroporar miRNA en el mesencéfalo ventral usando electrodos de platino delgada. Este método ofrece una forma fiable para transfectar las áreas específicas del cerebro medio y una herramienta útil para los estudios in vivo.
Introduction
El reconocimiento de los ARN no codificantes pequeños como reproductores adicionales para la expresión de genes lanzó una nueva complejidad a la regulación genómica de programación / gen. Las diferentes especies de RNAs no codificantes tienen importancia funcional en las células neuronales, incluidos los pequeños no codificante RNAs 1-4. Los microARN (miR o miARN), por ejemplo, muestran distintos perfiles de expresión y los cambios en los cerebros en desarrollo 5. Dirigida en la electroporación in ovo de embriones de pollo ofrece una oportunidad única para el control temporal y espacial de la expresión génica y el silenciamiento durante el desarrollo.
Este video muestra las diferentes etapas de realizar la expresión ectópica de MIR en áreas específicas del cerebro medio pollito utilizando electroporación in ovo 6-10. Para garantizar un efecto de larga duración de estos pequeños RNAs no codificantes en las células, la secuencia de ADN del MIR fueron clonados en vectores de mono o bi-cistrónicos. Porque en la electroporación in ovo, MIR contiene vEctor se inyecta en el tubo neural del cerebro medio exponiendo el embrión después de hacer una pequeña ventana en la cáscara del huevo. Para transfectar áreas específicas del cerebro medio, más pequeño (ánodo) y negativo (cátodo) electrodos de platino se colocan en posiciones específicas. Para la transfección cerebro medio ventral, el ánodo se coloca debajo de la mesencéfalo ventral izquierda y el cátodo encima de la mitad derecha del cerebro medio antes de la aplicación de una corriente. La abertura en la cáscara del huevo se cierra con cinta y los embriones se incuban durante todo el tiempo necesario para cualquier análisis. Este método fue descrito originalmente por Muramatsu et al. 6 y mejorado por Momose et al. 8 para la transfección área específica.
Resumen Esquemático.
- El embrión en el huevo es expuesto por el corte de una pequeña ventana en the cáscara de huevo.
- El vector (s) disuelta se inyecta en el cerebro medio usando un capilar micro.
- Dos electrodos - colocados en paralelo o por debajo y por encima del embrión - generan un campo eléctrico pulsante.
- El campo eléctrico crea temporalmente poros en la membrana celular, que facilitan la entrada en la célula por el ADN cargado negativamente (o ARN) atraído hacia el ánodo 11,12.
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Protocol
1. Requisitos para la electroporación in ovo
- Preparación de la construcción del vector: sentido y antisentido mir primers fueron diseñados después de las instrucciones de Ambion, recocidas y se ligaron en ApaI / EcoRI digerido pSilencer pSilencer U6.1 vector. Después de la transformación con éxito uno de los clones resultantes se cultivó y el plásmido pSilencer pSilencer se aisló por el método de lisis alcalina utilizando un kit de preparación de MIDI Quiagen.
- Electrodos: Los electrodos se pueden comprar o fácilmente se construirán 13. Utilizamos electrodos hechos a sí mismos de alambre de platino (Φ = 0,2, 0,25, o 0,5 mm de diámetro) o en algunos casos un electrodo de alambre de tungsteno aún más pequeño (Φ = 0,1 mm) 8 dependiendo de la zona que queremos electroporar. Para evitar que se queme de tejido, se utiliza por regla general la más cerca al tejido el más delgado de los electrodos. Por amplia electroporación de cerebro medio, utilizamos 0,5 mm hilos de platino soldado a un tubo de latón / acero inoxidableeje y fijado a un soporte del electrodo con una distancia de 3-5 mm (Figura 1). Para electroporar áreas específicas, usamos 0,25 mm ánodos de alambre de platino y 0,2 mm de alambre de platino o 0,1 mm de tungsteno para el cátodo con una distancia aproximada de 1 mm o menos.
- Soluciones: Haga las siguientes soluciones Ready:
- Dos colores de pollo en autoclave, de pH 7,5 (9,0 g de NaCl, 0,42 g de KCl, 0,24 g de CaCl2, se disuelven en 1 L de agua destilada).
- PBS (8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g de KH 2 PO 4, 1,44 g de Na 2 HPO 4, se disuelven en 1 litro de H2O destilada).
- Verde rápido: solución madre de 10 mg / ml de H2O destilada
- Tinta de secado lento (menos goma laca y por lo tanto menos intoxicación para el embrión). Nota: Un filtro dicroico azul unido a una lámpara de fibra óptica como se describe en el Canto-Soler y Adler 14 mejora el contraste y puede eliminar la necesidad de inyectar tinta.
Figura 1. Diagrama esquemático de electrodos y porta electrodo. (A, B, C) de alambre de platino se suelda a un lado de un eje tubular de acero inoxidable. Se perforó un orificio en el otro lado del eje tubular así que los enchufes de conector se pueden encajar (A) cables de colores rojo y azul se conectan a los enchufes de conector. En el extremo opuesto del cable se ajusta a los conectores de banana que trabajan con las tomas eléctricas del electroporador. (A, C) El alambre de platino estaba doblado en un ángel de 90 °. Una capa de barniz de uñas aislado del eje por encima de la curva.
2. Preparativos directamente ante En ovo electroporación
- Prepare el siguiente material:
- Diluir tinta con Ringer pollo 01:06, añadir solución antibiótica-antimicótica (100x desde GIBCo) 1:100.
- Prepare la solución vector: 1-2 g / l por ADN específico en H 2 O complementado con verde rápido (1:20).
- Esterilizar fórceps, tijeras, aguja de tungsteno y electrodos con etanol al 70%.
- Tire de micropipetas para la inyección de ácido nucleico a partir de capilares de vidrio borosilicato (longitud a diámetro exterior: 100 mm x 0,9 mm). Utilizamos un sencillo extractor PUL-1 (WPI, Berlín) con los valores que se muestran en la Tabla 1.
- Ajuste los parámetros de la electroporador como se muestra en la Tabla 2.
| Parámetros | Valores |
| Calor | 350 |
| Jale | 100 |
| Velocidad 50 | |
| Retraso | 200 |
Tabla 1. Ajustes para PUL-1
| Parámetros | Valores |
| Frecuencia | 50 Hz |
| Retraso | 20 - 50 mseg * |
| Ancho | 20 mseg |
| Voltaje | 8-25 V * |
| Pulso | 3 - 5 veces |
| * Según el diámetro del electrodo y la distancia. Por favor,tener esto en cuenta a la hora de cambiar uno de los parámetros. | |
Tabla 2. Ajustes para el Estimulador de pulsos
- Preparar los embriones de pollo para la electroporación:
- Incubar huevos de gallina fertilizados en su lado más largo a 37 ° C con 65% de humedad durante 39 horas para adquirir embriones entre Hamburger & Hamilton (HH) Ciclo 15 9-11. El embrión se asienta en la parte superior del huevo, por lo que debe marcar con una línea de lápiz.
- Desinfectar los huevos con etanol al 70%.
- Perforar el huevo en su lado más ancho, donde la cavidad de aire debe ser.
- Retire 1-2 ml de clara de huevo. Esto se separará el embrión de la cáscara de huevo.
- Cello-cinta de la cáscara del huevo para evitar astillas cáscara incluidas en el embrión. Use un par de tijeras para cortar una pequeña ventana en la cáscara de huevo alrededor de la línea de lápiz.
- Inyectar un poco de tintadebajo de la zona opaca para visualizar el embrión.
- Hacer un corte en la membrana vitelina con una aguja de tungsteno afilado para lograr una mejor accesibilidad del embrión para la inyección de ácido nucleico y la electroporación.
3. La electroporación e Incubación
- Añadir unas gotas de solución caliente de Ringer en los embriones. Esto reducirá los embriones, evitar el sobrecalentamiento, la adherencia de los electrodos al tejido y proporcionar un medio para la corriente entre los dos electrodos.
- Se inyecta la solución vector en el lumen del tubo neural a nivel del mesencéfalo. Si el vector de expresión de ADN contiene ningún gen reportero (por ejemplo, EGFP), añadir un vector gen reportero ligeramente inferior concentrado (1 g / l de miR vector de expresión a 0,9 g / l gen reportero vector) a la solución de ADN. Esto se asegurará de que usted reconozca las células transfectadas tarde 8. Utilizamos el llamado vector pCAX, un regalo de aquí para allám C. Krull 13.
- Para una amplia transfección del cerebro medio, colocar los electrodos izquierdo y derecho del embrión a la altura del cerebro medio. La distancia entre los electrodos debe ser alrededor de 3-5 mm. Los otros ajustes son de 15V, 20 impulsos ms y 50 ms de retardo para la HH 10. Cambio de la posición de los dos electrodos ligeramente a lo largo de la (DV) eje dorso-ventral del cerebro medio asegura una una amplia transfección más de las células de la transfección eje DV.
- Para la transfección ventral, añadir un poco de Ringer para levantar la cabeza de la membrana de la yema y colocar el ánodo por debajo del mesencéfalo ventral. Si la cabeza no se eleva empujar el electrodo debajo de la membrana que separa la yema y el embrión para evitar que se queme del tubo neural. El cátodo debe ser colocado por encima de la mesencéfalo dorso-lateralmente opuesta al ánodo. No toque el tubo neural. Nos transfectar la media ventral izquierdo del cerebro medio de evitar cualquier dificultad en el desarrollo del corazón. La distancia entre los electrodoses de alrededor de 1 a 0,5 mm, el resto de los ajustes se 10V, una anchura de 20 ms y 50 ms de retardo.
- Aplique una gota de solución salina en la parte superior de los embriones para que se enfríe y quitar las burbujas de aire.
- Sellar los huevos con la cinta y se incuba durante al menos 4 horas; el tiempo mínimo requerido para la expresión del vector.
4. La fijación de pollo embriones
- Retire los embriones de sus huevos.
- Embriones limpiar debajo de un microscopio estereoscópico y evaluar el alcance de la transfección con un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
- Fijar los embriones durante la noche en el 4% PFA a 4 ° C. Proceda con el corte y / o manchas (hibridación in situ, inmunohistoquímica) para analizar los cambios en el área transfectadas.
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Representative Results
La extensión de la zona del cerebro medio transfectadas con MIR es visible a través de la expresión de GFP a partir de un vector indicador inyectado junto con el vector de expresión de miR (Figura 2). El uso de electrodos de platino con un diámetro de 0,5 mm y colocado paralelo al eje de AP de cables del cerebro medio normalmente a la transfección de una zona amplia a lo largo de la-y DV AP-eje, incluyendo rombencéfalo, mesencéfalo y diencéfalo veces (Figuras 2A y B). El tamaño de los electrodos resulta en un campo eléctrico amplia aplica a la región del cerebro y por lo tanto un área amplia transfectadas.
Es difícil de localizar con precisión una zona como por ejemplo el cerebro medio ventral. La reducción de la distancia entre los electrodos de 0,5 mm para lograr un campo eléctrico más pequeño es a menudo tóxicos para el embrión y conduce a artefactos. Se utilizó electrodos con diámetros más pequeños (0,2 mm, 0,25 mm de platino o de 0,1 mm de alambre de tungsteno afilada), que ofrecen tra más localizadansfection como la del cerebro ventral, que es de difícil acceso (Figuras 2C-I). Electrodos más pequeñas reducen el campo eléctrico aplicado y permiten insertar los electrodos mucho más cerca al tejido. Figura 2F muestra un ejemplo, donde todo el cerebro medio ventral había sido transfectadas. En las Figuras 2G y 2H las zonas ventrales transfectadas son más pequeñas, pero parte de la parte posterior del cerebro (2F) o diencéfalo (2H) también se transfectan. En la Figura 2G, el ánodo se colocó bajo el medio y posterior del cerebro para transfectar ambas zonas ventrales. Figura 2H muestra un ejemplo de un ánodo no está bien aislado con barniz de uñas a lo largo del eje. Por lo tanto, no sólo el área ventral alrededor de la MHB expresa de miR / GFP, sino también el donde se había colocado el eje del ánodo MES-y dorsal anterior di-encéfalo,. La distribución de miR / GFP ventral específica en las figuras 2C-I es un resultado de lo localcampo eléctrico se aplica con los electrodos más pequeños. Tomados en conjunto, con electrodos más pequeños y los campos eléctricos que podemos expresar ADN / ARN en las zonas más restringidas como cerebro medio ventral.
Dado que nuestro vector de expresión de microARN contiene ningún gen reportero, mezclamos en un vector de expresión de GFP en una relación de 1 g / l a 0,9 mg / l, respectivamente. La proporción casi igual asegura que el área transfectadas microARN y GFP casi completamente solapamiento (ver Momose et al. 8 y la propia experiencia). Para ser capaz de juzgar la extensión de la zona transfectadas se vuelve importante cuando sólo un área pequeña que contiene tipos específicos de células se transfecta o las células transfectadas se utilizan para QRT-PCR. Un mucho menos concentración del gen informador podría dar lugar a células que expresan GFP bajo el nivel de detección. La fuerza de expresión de cualquier vector transfectado no sólo depende de la concentración del vector usado, sino también en el promotor. Nuestros vectores son U6-promotor driven (expresando miRNA) y promotor de ß-actina expulsados (que expresan proteínas fluorescentes) y son a la vez de forma ubicua y constitutivamente activa en el embrión de pollo.
La mayoría de nuestros embriones se electroporan en el lado izquierdo, excepto para la Figura 2C (imagen de espejo). Para los experimentos de lapso de tiempo, se recomienda la electroporación de la parte derecha del embrión desde la mayoría de los embriones de girar la cabeza hacia la derecha y se encuentran en su lado izquierdo.
Figura 2. Los resultados representativos. Los embriones fueron electroporated entre HH10 y HH11 y fijados en las fases que se indican en los cuadros. (AC) muestran electroporaciones del mesencéfalo dorsal y (DI) del mesencéfalo ventral. Las flechas en (D, E) indican ventralmente situado, células GFP positivas. Para más detalles véase el texto. Mes- Mesencéfalo / cerebro medio, Di - diencéfalo, Tel - telencéfalo, Rhom - rombencéfalo / cerebro posterior.
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Discussion
Este video muestra un método eficaz para transfectar plásmido en las células neuroepiteliales de áreas específicas del cerebro medio pollito. Pulsos eléctricos rectangulares de baja tensión pueden introducir ADN en las células del tubo neural de pollo in ovo 6,16. Sin embargo, la exactitud de la focalización de ADN a menudo se ve obstaculizada por el campo eléctrico de ancho, que se eleva a través de los electrodos relativamente grandes (Φ = 0,5 mm). Hemos tratado de hacer frente a ese problema mediante el uso de electrodos más pequeños de diámetro siguiendo las directrices de Momose et al. 8. Para la transfección cerebro medio ventral, colocamos el cátodo debajo de la membrana de la zona pelúcida o si la edad del embrión permite que directamente debajo del mesencéfalo ventral. El último escenario necesita un poco de práctica, ya que los tejidos del cerebro medio tubo neural / no debe ser tocado y dañado por el ánodo. Adición de Ringer a menudo puede ayudar a levantar la cabeza del embrión ligeramente fuera de la membrana que cubre la zona pelúcida.
Aunque en cuenta las concentraciones de genes se encuentran en la célula. Diferentes dosis de genes pueden tener diferentes efectos sobre las células y tejidos. Podría haber un efecto de umbral involucrados (ver Agoston et al. 17, por ejemplo) o diferentes, efectos graduadas. Normalmente Probamos difealquiler concentraciones del MIR expresar (0,5-2 mg / l) de vectores y analizar los cambios en la morfología o proteína / gen-expresión. Los efectos pueden ser probados in vivo utilizando inmunohistoquímica, sensor de vectores de 18 o ARN hibridación in situ.
Esta técnica también ofrece para probar la fuerza y la ubicación de cualquier actividad de un MIR específica in vivo utilizando, por ejemplo, un reportero de fluorescencia / sensor vectorial de doble como se describe en De Pietri Tonelli et al. 18. Ellos usan un vector que contiene un GFP-reportero y un sensor RFP MIR. La RFP es seguido por una secuencia de miR gratuito. Mientras que la expresión de GFP identifica las células transfectadas con éxito, fluorescencia roja (RFP) indica la ausencia de la MIR investigado, y la desaparición de la fluorescencia roja revela la presencia de la MIR. Esta técnica también se puede utilizar para probar la especificidad de la diana de miR in vivo, mediante el uso de 3'UTR de la secuencia diana en la corriente abajo de RFP.En su conjunto esta técnica es muy apropiada para los estudios de desarrollo sobre la expresión génica y la función en los diferentes tejidos.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos K. Mikic, que contribuyó a la fase inicial de esta película y M. Nicolescu para la imagen MIR. C. Huber fue apoyado por una beca de la IZKF del Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand por el programa de la fortuna del Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
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